一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法与流程

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种lamp氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法。

背景技术：

近年来，一些遗传学疾病、恶性肿瘤等已严重威胁着人类生命健康，给社会造成了严重的经济负担。其中，艾滋病由人类免疫缺陷病毒(hiv)引起。据世界卫生组织统计，2016年底全球约有3700万人感染hiv，而我国约占70万人。大量研究证实，hiv感染人群并发感染其他病毒如人乳头瘤病毒的风险明显增加。因此，灵敏、快速、便捷、准确检测hiv特异性标志物(如dna、rna、蛋白质等)，对于其早期诊断、治疗、病情追踪等具有极其重要的现实意义和社会价值。

环介导等温扩增(lamp)是在闭管内于65℃45min～1h即可完成的一种强有力的核酸放大技术。其扩增机理是以长达150、甚至200个碱基以上的基因序列为目标物模板，在dna聚合酶作用下，引物链末端的3'-oh对三磷酸脱氧核苷酸(dntps)的α-磷原子发起亲核进攻，3'-oh上的h被核苷酸碱基置换而释放h⁺和焦磷酸根离子，引物不断延伸而实现10⁹放大倍率。因此，除长短不一的双链dna主产物外，生成的大量h⁺(同时焦磷酸水解也产生h⁺)会引起lamp反应溶液ph的改变(lamp-h⁺)。

lamp技术具有高特异性，操作简便，快速高效，无需特殊昂贵仪器，已广泛用于细菌、病毒、生物酶活性、有机小分子、转基因食品的检测，以及临床疾病诊断和胚胎性别鉴定等。但也存在诸多不足，如扩增目标物模板过长、引物设计要求高、对单核苷酸多态性识别能力差、扩增产物难以准确定向控制等。常用的直接检测方法如凝胶电泳、浊度法、比色法和荧光法，以及间接的ph计测定，由于定量灵敏度低、稳定性差、操作不便等，极大限制了lamp方法的实际应用能力。而通过改变lamp反应装置，如与微流控或毛细管进行联用，设备复杂成本高、操作繁琐耗时、技术要求高；而在lamp反应过程中引入生物连接酶或切割酶，或磁珠形成乳液微反应器，再经离心、磁分离、破乳、洗脱等步骤，不仅过程繁琐耗时，引入新的试剂还可能改变lamp反应进程，加剧反应体系动力学过程的不确定性和复杂性，使得lamp反应溶液更加多元，给后续定量检测带来更大的潜在干扰和假阳性信号，一定程度上会降低lamp技术的特异性和灵敏度。近来，通过逆转录和连接反应，以仅有约20～30个碱基的目标mirna通过链杂交反应形成双哑铃结构dna引发lamp反应，虽然极大简化了dna模板和引物的设计，拓宽了lamp的应用范围，但逆转录和连接反应使得lamp扩增过程和产物组成复杂化。最近，将lamp-h⁺诱导二聚体i-motif形成后，引入修饰电极表面启动酶支持的dna行走放大，建立了测定流感病毒dna电化学生物传感器。这为将lamp放大与简便快捷、高灵敏、信号窗口宽的电化学分析相结合，并建立新型dna电化学生物传感器提供了新思路和新途径。但目前尚无利用lamp-h⁺转换信号的比率型电化学分析方法的相关报道。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的在于提供一种lamp氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种lamp氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器的构建方法，先将用不同电活性物质标记的两条单链dna进行反应，然后将所得产物滴加至电极表面，最后在电极表面滴加lamp反应溶液，即可完成所述传感器的构建；其中，lamp反应溶液是通过以下方法制备得到的：利用hdna与两条特殊的茎-环发夹dna模板和前驱体进行扩增后，制备具有内引物结合位点的特殊双哑铃dna结构，然后以该结构为起始模板，经lamp扩增获得含大量副产物h⁺的lamp反应溶液。hdna的核苷酸序列如seqidno.1所示。

hdna：5’-actgctagagattttccacat-3’，如seqidno.1所示。

优选的，所述的两条单链dna(s1和s2)分别用二茂铁fc和亚甲蓝mb标记，得fc-s1和mb-s2，即为电化学信号探针。各核苷酸序列如下：

s1：5’-sh-(ch2)6-aatgcagtgggaggggaagggaggggactgcatt-3’，如seqidno.6所示；

s2：5’-cccctcccttcccctccc-3’，如seqidno.7所示。

进一步优选的，fc-s1和mb-s2的反应温度为室温(25℃)，反应时间为2小时，所得产物滴加至电极表面，孵育16小时。

进一步优选的，所述fc-s1分别在s1的5’端和3’用巯基(-sh)和fc修饰，自由状态的构象为发夹结构，fc-s1通过au-s键结合到电极表面；所述mb-s2在s2的3’端修饰mb，其18个碱基富含14个c碱基，能形成具有ph响应的i-motif结构，且互补于fc-s1的茎和环的18个碱基，能打开fc-s1并与之杂交。

优选的，所述内引物为bip和fip。

进一步优选的，杂交反应条件为：pcr仪于50℃闭管反应20分钟。

进一步优选的，所述ht为根据hdna的碱基序列(含21个碱基)设计的含一茎-环发夹结构的dna模板，其3’端用磷酸基团(po4^3-)修饰，靠近3’端为hdna的互补序列；所述hp为含一茎-环发夹结构的dna前驱体，其3’端方向的21个碱基能与ht中靠近hdna互补序列的21个碱基杂交；所述bip的碱基序列为ht的一段b1c-b2；所述fip的碱基序列为hp的一段f1c-f2。各核苷酸序列如下：

dna模板ht：5’-atcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcactttcagtcacgacgattttatgtctggtctagggattatg-3’，如seqidno.2所示；

dna前驱体hp：5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagtgtgagcggattttcctctgctgtcgttttcataatccctagaccagacatcacacttatgtggaaaatctctagcagt-phosphate-3’，如seqidno.3所示；

内引物bip：5’-atcgtcgtgactgtttgtaataggacagagccccgcac-3’，如seqidno.4所示；

内引物fip：5’-cgacagcagaggatttgttgtgtggaagtgtgagcgga-3’，如seqidno.5所示。

优选的，lamp扩增的反应条件为：pcr仪中65℃闭管反应40分钟。

优选的，具体步骤如下：

(1)制备具有内引物bip和fip结合位点并能延伸的特殊双哑铃dna结构；

(2)加入内引物bip和fip，该双哑铃dna结构为起始模板，进行快速、简便、高效的延伸和扩增，得到含大量副产物h⁺的lamp反应溶液；

(3)将两电化学信号探针fc-s1和mb-s2在室温反应2小时后，滴加到电沉积金的玻碳电极表面；

(4)在上述电极表面滴加lamp反应溶液。

进一步优选的，步骤(1)中，特殊双哑铃dna结构的制备方法如下：目标物hdna与两条特殊的茎-环发夹dna模板ht和dna前驱体hp、dna聚合酶bst以及dntps，在pcr仪中于50℃闭管反应20分钟，形成具有内引物bip和fip结合位点并能延伸的特殊双哑铃dna结构。

2、利用上述方法构建的一种lamp氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器。

3、上述传感器在hiv标志物dna定量检测中的应用。

4、一种lamp氢离子驱动i-motif变换比率型定量检测方法，利用上述传感器对所述两种电活性物质的电化学响应信号进行测定，从而实现对hdna的定量检测。

优选的，具体方法是：将传感器温和洗涤后，在磷酸缓冲盐溶液(pbs，ph7.0)中测定fc和mb的方波伏安(swv)电化学响应，通过二者电流信号比值实现对hdna的定量检测。

本发明的有益效果在于：

本发明将常规lamp扩增技术与高灵敏的电化学检测相结合，通过目标物短链dna延伸形成的双哑铃结构中间体进行lamp扩增，其副产物h⁺诱导i-motif构象转换实现比率型电化学信号的显著改变和放大输出，避免常规lamp技术模板dna及引物设计的复杂性和局限性，简化模板及引物设计，拓宽lamp技术应用范围，保障lamp高特异性和简便快捷，同时提升检测灵敏度，弥补尚无利用lamp反应副产物h⁺转换信号的比率型电化学分析方法的空白。两种电化学探针的信号比值能有效降低背景信号，确保高特异性和高灵敏度、良好的稳定性和再生性。本发明建立的电化学检测方法简单方便快捷；无需引入其他辅助反应物，提高检测特异性和灵敏度，缩短分析时间，降低检测成本。概括如下：

(1)本发明将lamp放大的简便快速和电化学的高灵敏结合，通过目标物短链dna延伸形成的双哑铃结构中间体进行lamp扩增，无需复杂昂贵的仪器设备，极大简化dna模板和引物的设计，效率高、成本低、步骤简单、易于操作。

(2)本发明利用两种信号探针的信号变化的比值，背景信号低，具有高灵敏、准确性和特异性，良好稳定性、再生性和通用性，为检测类似hdna的其他疾病标志物dna或rna提供了一种新的思路和途径。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为ht、hp和fc-s1的发夹结构。

图2为lamp反应双哑铃结构模板的形成(a)及lamp反应过程(b)示意图。插图为lamp反应的焦磷酸镁白色沉淀验证(+)，(-)为无hdna参与的lamp反应溶液对比。

图3为比率型hdna电化学生物传感器的组装过程示意图：将hdna引发的lamp反应后的溶液滴加到修饰电极表面，lamp-h⁺诱导i-motif结构变换，导致mb-s2信号探针离开电极表面，其swv信号减小；同时，fc-s1折叠为发夹结构，fc靠近电极表面，其swv信号增强。插图为该比率型传感器在没有和有目标物hdna存在的swv响应曲线对比图。

图4为循环伏安曲线、交流阻抗图以及电极构建过程示意图。其中，a和b分别为构建的比率型传感器逐步修饰过程在5mm的fe(cn)6^3-/4-溶液中测得的循环伏安曲线(cv)和交流阻抗图(eis)，曲线a～e对应的电极分别为裸玻碳电极(gce)、depau/gce、s1:s2/depau/gce、ht/s1:s2/depau/gce和lamp-h⁺/ht/s1:s2/depau/gce；c为相应电极构建过程示意图(注：使用的s1和s2未修饰fc和mb)。

图5为构建的比率型传感器在磷酸缓冲盐溶液(ph7.0，pbs含10mmna2hpo4，10mmkh2po4和2mmmgcl2)中测得的方波伏安(swv)响应信号，曲线b～f对应的电极分别为depau/gce、fc-s1:mb-s2/depau/gce、ht/fc-s1:mb-s2/depau/gce和lamp-h⁺/ht/fc-s1:mb-s2/depau/gce无目标物hdna(blank)和有目标物hdna(浓度为10pm)。

图6为lamp反应凝胶电泳图，lanem为dna-markers(25、50、75、100、150、200、300、400和500bp)；lane1目标物hdna浓度10nm；lane2目标物hdna浓度1.0pm。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明涉及的“室温”是指25℃。

实施例：

(1)序列设计：

以hiv标志物dna(hdna)为例，在nupack网站(www.nupack.org)设计全部基于hdna的碱基相关序列。如表1所示。

表1.dna碱基序列

其中，ht、hp和fc-s1的发夹结构如图1所示。

(2)双哑铃结构dna(lamp反应模板)的形成(图2)：

在20μl的微量离心管中，含有总体积为12μl的不同浓度的hdna、0.4μmht、0.4μmhp、2.8mmdntps，8ubst酶和20mmtris-hcl缓冲溶液(ph7.4)。tris-hcl溶液含10mmkcl，10mm(nh4)2so4，4mmmgso4和质量浓度0.1％tritonx-100。混合均匀的溶液在设定为50℃的pcr仪中反应20min后，冷却至室温。

(3)lamp反应：

在上述溶液中加入已配制的溶液(总体积8μl)：含4μmbip、4μmfip、和1m甜菜碱。溶液混合均匀后，在pcr仪中于65℃反应40min后，冷却至室温。4℃保存备用。

(4)电极修饰及可行性验证(图3)：

将裸的玻碳电极(直径为4mm)分别用0.3μm和0.05μm的al2o3粉末打磨，二次蒸馏水洗涤后，置于无水乙醇和二次蒸馏水中分别超声20min；将洗涤干净的玻碳电极置于质量浓度1％的haucl4溶液中在-0.2v的恒电位进行电沉积30s；再将fc-s1和mb-s2在室温反应2h后的溶液滴加到该修饰电极表面，室温放置16小时；然后滴加10μl己硫醇(浓度0.1mm，96％，ht)30min，封闭非特异性吸附位点；继续滴加lamp反应后的溶液10μl，室温密封放置1小时，制备好的电极在4℃保存备用。

特别说明：

为了验证电极的成功修饰，用无fc和mb修饰的探针dna(s1和s2)孵育电极，每一步过程都用二次蒸馏水温和洗涤，然后在含有5mm[fe(cn)6]^3-/4-的1.0ml的pbs溶液(ph7.0)中测定其cv和eis；cv的电位扫描范围为-0.2～0.6v，扫速为100mvs^-1；eis的频率范围为10^-1～10⁵hz，激发信号为5mv，表观电位为220mv。(图4)

(5)电化学检测及分析性能：

上述电极经温和洗涤后，在1.0ml浓度为1.0mlpbs(ph7.0)中测定fc和mb的方波伏安(swv)电化学信号，电位扫描范围为-0.5～0.6v，频率为15hz；其结果与lamp溶液孵育前的swv信号进行比较；测定不同浓度hdna进行lamp反应后，修饰电极的swv信号，通过fc和mb的峰电流比值实现对hdna的定量检测，以及线性范围和检测下限(平行测定10次)等分析性能的确定。(图5)

(6)凝胶电泳分析：

对两种不同浓度hdna的lamp反应产物进行了凝胶电泳分析。室温下，用质量浓度8％的琼脂糖和1×tbe缓冲溶液，用loadingbuffer进行染色，加入12μl样品混合溶液后，在120v电压下进行90min；然后用凝胶成像系统观察并拍照(图6)。可见，与dnamarker(lanem，含25、50、75、100、150、200、300、400和500bp)相比，两种浓度hdna(10nm和1pm)进行lamp反应后都呈现了类似“梯子”的条带(lane1和lane2)；即检测体系有hdna时，才能发生lamp扩增，并生成长短不一、分子量不同含不同碱基数的扩增产物，表明了lamp扩增释放h⁺的可行性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>西南大学

<120>一种lamp氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法

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