一种用于发酵海杂鱼的复合微生物菌剂及酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法与流程

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种用于发酵海杂鱼的复合微生物菌剂及酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法。

背景技术：

鱼蛋白肥主要是利用深海鱼虾，结合酶解与微生物低温菌解发酵工艺，以深海鱼蛋白为主要原料的一种肥料。酶解后它富含小分子多肽、氨基酸、牛磺酸、维生素等多种活性物质及丰富的钙、镁等中微量元素，根据种植需求可调配冲施肥、叶面肥、水溶肥等多种类型。

但是现有技术中制备的鱼蛋白肥在加工酶解发酵过程中，需要对温度进行严格的控制，对相关生产设备的要求较高，无形地加大了生产成本，且制备的鱼蛋白肥多以叶面喷施为主，很少以冲施肥的方式使用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于发酵海杂鱼的复合微生物菌剂，通过多个菌种的复配，高效地发酵分解海杂鱼以生产鱼蛋白氨基酸水溶肥。

本发明还提供了一种酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法。通过复合微生物菌剂和复合酶制剂的配合使用，制备高氨基酸含量的鱼蛋白氨基酸水溶肥，以解决土壤板结，土壤次生盐渍化，减少化肥使用等问题，改善农作物品质，提高作物产量，增加经济收入，并实现对低值的海洋生物蛋白进行高值化、资源化、生态化利用。

本发明采取的技术方案为：

本发明提供的一种用于发酵海杂鱼的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌、酿酒酵母菌中的任意3种或者4种组成；

所述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌、酿酒酵母菌的质量分别为底物质量的0.08％～0.12％、0.04％～0.06％、0.04％～0.06％、0.06～0.08％、0.025％～0.035％、0.07％～0.015％，优选为0.1％、0.05％、0.05％、0.075％、0.03％、0.1％。

所述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌、酿酒酵母菌的活菌数分别为80×10⁸cfu/g、4.2×10⁶cfu/g、1×10⁶cfu/g、4×10⁸cfu/g、2.1×10⁶cfu/g、8.6×10⁸cfu/g。

本发明提供的一种酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)在运输前将海杂鱼和权利要求1所述的复合微生物菌剂搅拌均匀，进行预处理以防止海杂鱼腐败变质，延长海杂鱼保质期，然后封装在塑料袋中进行常温运输，以降低运输成本；

(2)将预处理的海杂鱼破碎；

(3)向破碎后的海杂鱼中加入水，并升温至60～65℃，加入复合酶制剂进行酶解；然后重复此步骤向第一次酶解得到的酶解液中再次加入等量的复合酶制剂进行二次酶解得到酶解液；

(4)将酶解液送至发酵釜中加入复合微生物菌剂进行发酵，发酵结束得到发酵鱼溶浆；

(5)将发酵鱼溶浆进行固液分离、油脂分离、过滤、浓缩，得到酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥。

进一步地，步骤(2)中，将预处理的海杂鱼采用骨泥机破碎为0.2cm的碎块，以利于后续的酶解和发酵；

步骤(3)中，所述复合酶制剂由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶中的任意2种或3种组成；

所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶的质量分别为底物质量的0.025％～0.035％、0.025％～0.035％、0.035％～0.045％、0.015％～0.025％、0.015％～0.025％，优选为0.03％、0.03％、0.04％、0.02％、0.02％，此处的底物指的是海杂鱼与水的混合液。

步骤(3)中，海杂鱼与水的重量配比为1：1.5～4.0；所述酶解的时间为8～12h。

步骤(4)中，所述发酵的条件为25～40℃发酵20～24h。

步骤(5)中，所述固液分离为经100目平板式离心机过滤，转速为800-1200转/分钟，然后经600目平板式离心机进行二道过滤，收集滤液。

步骤(5)中，所述油脂分离为将滤液经过蝶式离心机，分离滤液中的油脂，得到无油脂酶解液。

步骤(5)中，所述过滤为经1000目平板式离心机过滤后收集滤液。

步骤(5)中，所述浓缩的条件为：真空度75～80kpa，浓缩温度为35～38℃，浓缩时间为1.5～2小时。

本发明提供的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法中，在运输之前就使用本发明所述的复合微生物菌剂对海杂鱼进行预处理，在运输的过程中，由于复合微生物菌剂的存在，其在发酵海杂鱼的同时可产生大量的有益菌进而可抑制海杂鱼的腐败变质，解决长途运输时高昂的运输成本问题，同时经过运输时的初步发酵，后续在使用复合酶制剂对海杂鱼进行酶解处理时，可酶解的更彻底，海杂鱼的蛋白质可彻底的分解为氨基酸，提升产品中的氨基酸含量。

本发明选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶中的任意2种或3种组成的复合酶制剂对预处理之后的海杂鱼进行酶解。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶；胰蛋白酶是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用；碱性蛋白酶可使复杂的大分子蛋白质结构变成简单的小分子肽链或者氨基酸；胃蛋白酶具有分解蛋白质的作用，中性蛋白酶对纤维蛋白有很好的溶解能力。

当木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶的质量分别为底物质量的0.03％、0.03％、0.04％、0.02％、0.02％时，以他们分别对海杂鱼进行酶解处理，它们对于海杂鱼蛋白的水解度分别为3.95％、10.5％、8.45％、7.56％、1.03％；随机选取其中两种或三种蛋白酶进行复配，复配后各蛋白酶使用量为复配前的1/2或1/3，用得到的复合酶制剂对海杂鱼进行酶解处理时，海杂鱼蛋白的水解度可提高至11.00％～12.09％，可见本发明选用的蛋白酶任意两种或者三种的组合使用，均可进行协同酶解作用，提升蛋白质的水解度。

本发明在对预处理之后的海杂鱼进行两次酶解后，对酶解之后的酶解液使用复合微生物菌剂进行发酵处理，复合微生物菌剂中，地衣芽孢杆菌可促使海杂鱼产生抗菌活性物质、杀灭致病菌，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖；枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；巨大芽孢杆菌主要作用是解磷固钾；腊样芽孢杆菌促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低ph值，间接抑制其他致病菌的生长；乳酸链球菌抑制有害菌群生长；酿酒酵母菌在无氧的条件下，经过内酶的作用，能够把单糖分解为二氧化碳和酒精，促进发酵。

当地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌、酿酒酵母菌的质量分别为底物质量的0.1％、0.05％、0.05％、0.075％、0.03％、0.1％时，以他们分别对海杂鱼的酶解液进行发酵处理时，发酵之后的发酵液的酸度分别为72°t、83°t、86°t、76°t、78°t、80°t，随机选取它们其中的三种或四种菌剂进行复配，复配后各菌剂使用量占复配前原单个菌剂的1/3或1/4，用得到的复合微生物菌剂对海杂鱼的酶解液进行发酵处理时，发酵液的酸度可提高至86°t～92°t，可见本发明随机选用上述菌剂的其中三种或四种菌剂组合使用，均可进行协同发酵作用，提升发酵液的酸度，并且可在发酵海杂鱼的过程中产生大量的有益菌，产生有机酸，降低ph值，抑制致病菌的产生，防止鱼蛋白氨基酸水溶肥的腐败变质，且本发明制备得到的产品浓缩后无需干燥即可在常温进行保存，这样更方便后续的水溶施肥。

本发明的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥营养液施入土壤后，土壤中的有益微生物以鱼蛋白等有机物质为载体迅速繁殖，活性可提高十倍以上，使土壤结构得到优化，保肥保水能力显著提高。该条件下的土壤能够大大满足蚯蚓的生活环境，使蚯蚓大量繁殖，土壤变得疏松肥沃，达到改善土壤生态，调节土壤酸碱度的效果。

本发明的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥含有丰富的氨基酸及微量营养元素，并且采用的是随水冲施作物根部土壤，使作物根部周围土壤氮磷钾及微量营养元素大幅增加，从而刺激幼苗根系生长，使其叶色浓绿，茎杆粗壮，促进作物的光合作用，促进作物提早开花和坐果，有效改善产品品质。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)在运输前将海杂鱼和复合微生物菌剂搅拌均匀，进行预处理，然后封装在塑料袋中进行常温运输；

(2)将预处理的海杂鱼采用骨泥机破碎为0.2cm的碎块；

(3)向破碎后的海杂鱼中按照1:2的质量比加入水，并升温至60℃，加入复合酶制剂进行酶解12小时；然后重复此步骤向第一次酶解得到的酶解液中再次加入等量的复合酶制剂进行二次酶解得到酶解液；

(4)将酶解液送至发酵釜中加入复合微生物菌剂，于25℃下发酵24小时，发酵过程充分搅拌，发酵结束得到发酵鱼溶浆；

(5)将发酵鱼溶浆经100目平板式离心机过滤，转速为800-1200转/分钟，然后经600目平板式离心机进行二道过滤，收集滤液；滤液经过蝶式离心机，分离滤液中的油脂，得到无油脂酶解液；再经1000目平板式离心机过滤后收集滤液；滤液在温度35℃，真空度75kpa下浓缩2小时，即可得到所述酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥。

所述复合微生物菌剂由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌组成；所述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌的质量分别为海杂鱼质量的0.1％、0.05％、0.05％、0.075％。

所述复合酶制剂由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶组成；所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶的质量分别为海杂鱼质量的0.03％、0.03％、0.04％。

该实施例制备得到的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥中的成分含量为：有机质172g/l、氨基酸163g/l、水不溶物1g/l、ph值(1:250倍稀释)4.5、密度1.1559g/ml、硫<1g/l、氯78g/l、钠3.4g/l。

实施例2

一种酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)在运输前将海杂鱼和复合微生物菌剂搅拌均匀，进行预处理，然后封装在塑料袋中进行常温运输；

(2)将预处理的海杂鱼采用骨泥机破碎为0.2cm的碎块；

(3)向破碎后的海杂鱼中按照1:3.3的质量比加入水，并升温至65℃，加入复合酶制剂进行酶解8小时；然后重复此步骤向第一次酶解得到的酶解液中再次加入等量的复合酶制剂进行二次酶解得到酶解液；

(4)将酶解液送至发酵釜中加入复合微生物菌剂，于40℃下发酵20小时，发酵过程充分搅拌，发酵结束得到发酵鱼溶浆；

(5)将发酵鱼溶浆经100目平板式离心机过滤，转速为800-1200转/分钟，然后经600目平板式离心机进行二道过滤，收集滤液；滤液经过蝶式离心机，分离滤液中的油脂，得到无油脂酶解液；再经1000目平板式离心机过滤后收集滤液；滤液在温度38℃，真空度80kpa下浓缩1.5小时，即可得到所述酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥。

所述复合微生物菌剂由枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌组成；所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌的质量分别为海杂鱼质量的0.05％、0.05％、0.075％、0.03％。

所述复合酶制剂由胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶组成；所述胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶的质量分别为海杂鱼质量的0.03％、0.04％、0.02％。

该实施例制备得到的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的成分含量为：有机质181g/l、氨基酸165g/l、水不溶物1g/l、ph值(1:250倍稀释)4.4、密度1.1559g/ml、硫<1g/l、氯75g/l、钠3.5g/l。

实施例3

一种酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)在运输前将海杂鱼和复合微生物菌剂搅拌均匀，进行预处理，然后封装在塑料袋中进行常温运输；

(2)将预处理的海杂鱼采用骨泥机破碎为0.2cm的碎块；

(3)向破碎后的海杂鱼中按照1:2.7的质量比加入水，并升温至63℃，加入复合酶制剂进行酶解10小时；然后重复此步骤向第一次酶解得到的酶解液中再次加入等量的复合酶制剂进行二次酶解得到酶解液；

(4)将酶解液送至发酵釜中加入复合微生物菌剂，于25℃下发酵24小时，发酵过程充分搅拌，发酵结束得到发酵鱼溶浆；

(5)将发酵鱼溶浆经100目平板式离心机过滤，转速为800-1200转/分钟，然后经600目平板式离心机进行二道过滤，收集滤液；滤液经过蝶式离心机，分离滤液中的油脂，得到无油脂酶解液；再经1000目平板式离心机过滤后收集滤液；滤液在温度36℃，真空度78kpa下浓缩1.8小时，即可得到所述酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥。

所述复合微生物菌剂由腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌、酿酒酵母菌组成；所述腊样芽孢杆菌、乳酸链球菌、酿酒酵母菌的质量分别为海杂鱼质量的0.075％、0.03％、0.1％。

所述复合酶制剂由碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶组成；所述碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶的质量分别为海杂鱼质量的0.04％、0.02％、0.02％。

该实施例制备得到的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的成分含量为：有机质168g/l、氨基酸161g/l、水不溶物1g/l、ph值(1:250倍稀释)4.3、密度1.156g/ml、硫<1g/l、氯73g/l、钠3.3g/l。

比较例1

其他同实施例1，只是步骤(3)、(4)按如下步骤进行：

(3)向破碎后的海杂鱼中按照1:3.3的质量比加入水，加入复合微生物菌剂，于40℃下发酵20小时，发酵过程充分搅拌，发酵结束得到发酵液；

(4)将发酵液升温至65℃，加入复合酶制剂进行酶解8小时；然后重复此步骤进行二次酶解得到鱼溶浆。

该比较例制备得到的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的成分含量为：有机质106g/l、氨基酸80g/l、水不溶物1g/l、ph值(1:250倍稀释)6.0、密度1.151g/ml、硫<1g/l、氯59g/l、钠2.5g/l。

酶解最适ph值范围为6～9，首先进行发酵的话，发酵液的ph值会降低至3～6，这样得到的发酵液再酶解的话会影响酶解的效果，如果通过人为调节ph值后再酶解又会增加操作步骤，加大生产成本，并且发酵的过程会产生抑菌作用，对酶制剂也会产生抑制作用，甚至使酶制剂失活，同样会影响酶解效果，进而降低蛋白质水解为氨基酸、氮磷钾及微量营养成分的水解度，在相同使用量的情况下，进而降低对作物的营养成分的供给，从而影响作物的良好生长。

比较例2

其他同实施例1，只是将复合微生物菌剂的组成替换为：0.04％两歧双歧杆菌、0.03％嗜酸乳杆菌、0.05％干酪乳杆菌。

该比较例制备得到的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的成分含量为：有机质113g/l、氨基酸85g/l、水不溶物2g/l、ph值(1:250倍稀释)6.0、密度1.155g/ml、硫<1g/l、氯57g/l、钠2.4g/l。可见本发明的技术方案中提供的菌种组合为最优的菌种组合。

比较例3

其他同实施例1，只是复合微生物菌剂中所述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌的质量分别为海杂鱼质量的0.04％、0.03％、0.03％、0.05％。

该比较例制备得到的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的成分含量为：有机质95g/l、氨基酸76g/l、水不溶物3g/l、ph值(1:250倍稀释)5.0、密度1.355g/ml、硫2g/l、氯55g/l、钠2.1g/l。

可见，如果降低了本发明中各发酵菌种的配比，由于发酵菌的减少，会导致蛋白质的腐败变质，腐败作用的大多数产物有：氨基酸脱羧反应产生胺类、脱氨基反应产生氨，以及其他物质，如苯酚、吲哚、硫化氢等；腐败作用也可产生少量脂肪酸、维生素等物质。

实验例

分别采用各实施例和比较例中所得酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥对瓠子、黄瓜进行稀释后随水滴灌施肥，以测其生长性能及土壤肥力指标。

试验方法：选取某大棚种植基地，分别以瓠子、黄瓜为试验对象，每个试验对象设置对照组和试验组1～6组，对照组不施肥，以水滴灌；6个试验组在作物3叶1心后分别采用各实施例和比较例中的鱼蛋白水溶肥加水300倍稀释，滴灌作物的根部，用量5公斤/亩。黄瓜和瓠子的实验时间均为100天。

表1各实施例和对比例所得酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥对黄瓜生长性能检测结果

同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

表2各实施例和对比例所得酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥对瓠子生长性能检测结果

同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

表3各实施例和对比例所得酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥对土壤养分状况影响的检测结果

同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

从表1、表2可以看出施用本发明的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥后，黄瓜和瓠子的株高、叶长都显著高于对照组，病害率也显著低于对比例和对照组，叶片中叶绿素含量显著高于对比例和对照组，黄瓜和瓠子的产量也显著高于对比例和对照组。经现场观察，实施例的黄瓜和瓠子与对照组和对比例相比，果实饱满，叶片肥厚，叶片呈深绿色，挂果率较高，病虫害率显著降低，杆径壮大，株高显著高于对照组。

从表3可以看出酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥可以有效提高土壤的有机质含量、ec值、速效氮、速效磷、速效钾含量，使用鱼蛋白氨基酸水溶肥后土壤ph值提高。同时也说明本发明采用复合酶制剂先对海杂鱼进行酶解，然后使用复合复合微生物菌剂对所得的酶解液进行发酵制备的酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥，有利于提高作物的生长品质，提高土壤的养分含量。

上述参照实施例对一种用于发酵海杂鱼的复合微生物菌剂及酶解鱼蛋白氨基酸水溶肥的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。