检测样本中ABCG2基因相对表达量的寡核苷酸和方法与流程

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中abcg2基因相对表达量的方法，采用荧光定量pcr技术，用于检测肿瘤患者体内abcg2基因的表达水平。

背景技术：

三磷酸腺苷结合转运蛋白g2(atp-bindingcassettefamilygmember2,abcg2)亦称乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistantprotein,bcrp)，是abc转运蛋白超家族中的成员之一，是一种重要的跨膜转运蛋白。abcg2基因定位于人类染色体4q22，编码655个氨基酸。该类蛋白均有atp结合位点，通过水解atp提供能量将底物逆势转运至细胞膜外或细胞器中，其转运底物包括各种药物/毒素及其代谢物、生理代谢物、营养物、脂类和多肽等。大量研究显示，abcg2在大多数正常组织中高表达，包括脑、肠道、肝、胎盘、生殖腺和骨髓等组织，从而保护这些组织免于药物及毒物的影响，对维持人体正常生理功能和减轻病理损伤起着至关重要作用。

恶性肿瘤化疗耐药机制的研究发现abcg2可以将进入细胞内的药物转运至细胞外，从而达到药物耐药的作用。已经证实abcg2可以识别并且转运多种临床上常见的化疗药物(甚至一些新型的分子靶向药物)，包括传统的化疗药物依立替康、米托蒽醌、托泊替康等。因此abcg2的表达与肿瘤化疗效果密切相关，abcg2高表达的患者，其化疗效果可能明显差于abcg2低表达的患者。一些研究也发现，abcg2可以降低sn-38、米托葸醌和拓扑替康的部分细胞毒性作用，通过水解atp释放能量，并利用能量发挥转运作用，将药物蹦出细胞外，这就降低了肿瘤细胞内的有效药物的量，减轻了药物对细胞的毒性作用，从而达到抗肿瘤药物作用及耐药的产生。因此，针对不同的癌症患者根据其体内abcg2的表达水平来选择最佳的化疗方案及用药剂量，可达到最佳治疗效果，降低化疗毒副作用，以实现个体化治疗。

实时荧光定量pcr技术是目前公认的最准确，重复性最好的定量pcr研究方法。其通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板定量及定性的分析，优点如下：l)特异性强，灵敏度高；2)封闭反应，无需pcr后处理；3)定量范围宽，可达到l0个数量级；4)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；5)仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断；6)可实现一管双检或多检；7)操作安全，缩短时间，提高效率。因此，荧光定量pcr技术已成功用于肿瘤基因表达量检测的研究。荧光定量pcr技术常见的方法有sybrgreeni染料法,双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光pcr技术结合taqman探针法应用于abcg2基因表达量检测。

技术实现要素：

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量pcr技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因actin和目的基因abcg2的定量标准曲线，检测目的基因abcg2相对于内参基因actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及pcr反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够实现对abcg2基因表达水平的检测，用于制定化疗方案及预测预后。

本发明提供用于检测样本中abcg2基因相对表达量的引物和探针，所述引物和探针包括：

(1)针对abcg2基因的上游引物abcg2-f、下游引物abcg2-r和探针abcg2-probe，其碱基序列如下所示：

abcg2-f：5’-atgaaacctggtctcaacgc-3’

abcg2-r：5’-ccacttggatctttccttgc-3’

abcg2-probe：5’-fam-cacaggtggaggcaaatcttcgt-tamra-3’；

(2)针对内参基因actin的上游引物actin-f、下游引物actin-r和探针actin-probe，其碱基序列如下所示：

actin-f：5’-tgagcgaggctacagctt-3’

actin-r：5’-tccttgatgtcgcgcacgattt-3’

actin-probe：5’-fam-accaccacggccgagcgg-tamra-3’。

本发明还提供了一种检测样本中abcg2基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本中的rna；

(2)将步骤(1)中的rna逆转录cdna；

(3)加入cdna到反应管中，利用abcg2基因的上、下游引物和探针检测样本中的abcg2基因的荧光信号；利用actin内参基因的上、下游引物和探针检测样本中的actin内参基因的荧光信号。其碱基序列如下所示：

abcg2-f：5’-atgaaacctggtctcaacgc-3’

abcg2-r：5’-ccacttggatctttccttgc-3’

abcg2-probe：5’-fam-cacaggtggaggcaaatcttcgt-tamra-3’

actin-f：5’-tgagcgaggctacagctt-3’

actin-r：5’-tccttgatgtcgcgcacgattt-3’

actin-probe：5’-fam-accaccacggccgagcgg-tamra-3’。

(4)根据abcg2基因的荧光信号和actin内参基因的荧光信号，确定样本中的abcg2基因的相对表达量。

本发明最后提供了检测样本中abcg2基因相对表达量的检测体系及pcr反应液，所述检测体系及pcr反应液包括：

(1)针对abcg2基因的上游引物abcg2-f、下游引物abcg2-r和探针abcg2-probe，其碱基序列如下所示：

abcg2-f：5’-atgaaacctggtctcaacgc-3’

abcg2-r：5’-ccacttggatctttccttgc-3’

abcg2-probe：5’-fam-cacaggtggaggcaaatcttcgt-tamra-3’；

(2)针对内参基因actin的上游引物actin-f、下游引物actin-r和探针actin-probe，其碱基序列如下所示：

actin-f：5’-tgagcgaggctacagctt-3’

actin-r：5’-tccttgatgtcgcgcacgattt-3’

actin-probe：5’-fam-accaccacggccgagcgg-tamra-3’。

进一步地，所述检测体系还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有abcg2cdna序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有abcg2cdna序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

进一步地，所述检测试剂盒还包括样本rna提取试剂，所述样本rna提取试剂包括trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水。

进一步地，所述样本rna提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钾和12.5μmol/ledta。

本发明中的“abcg2cdna序列”指的是abcg2基因通过转录产生的mrna经逆转录后获得的cdna序列，或者根据这种cdna序列通过化学合成手段直接合成获得。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的abcg2cdna序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光pcr技术结合采用taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因actin和目的基因abcg2的定量标准曲线，检测受测者体内abcg2基因相对于内参基因actin的表达水平。相比于fish和现今流行的△△ct法，该方法具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该方法灵敏度高，操作简便。有助于检测肺癌患者体内abcg2的表达水平，为患者后期化疗方案的制定及预后预测提供依据。

附图说明

图1以abcg2阳性质粒为模板检测abcg2制成的标准曲线图。

图2以abcg2阳性质粒为模板检测abcg2制成的标准扩增曲线图。

图3以actin阳性质粒为模板检测内参基因actin制成的标准曲线图。

图4以actin阳性质粒为模板检测内参基因actin制成的标准扩增曲线图。

图5健康体检人群外周血cdna为模板检测abcg2与对应内参基因actin的扩增曲线示意图。

图6正常体检人群外周血abcg2表达量/actin内参表达量数值分布。

图7肺癌患者外周血cdna为模板检测abcg2与对应内参基因actin的扩增曲线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

用于检测样本中abcg2相对表达量的核酸检测方法，可用于辅助临床上肺癌化疗方案的制定及化疗药物剂量的选择，还可对患者预后进行预测。该方法包括：

(1)红细胞裂解液，包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钾和12.5μmol/ledta。

(2)rna提取试剂，包括trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水。

(3)rna逆转录试剂，revertraaceqpcrrtkit试剂盒(toyobo公司)。

(4)检测体系pcr反应液，thnderbirdprobeqpcrmix(2×)(toyobo公司)。检测abcg2基因的上游引物abcg2-f、下游引物abcg2-r和探针abcg2-probe；检测内参基因actin的上游引物actin-f、下游引物actin-r和探针actin-probe。其中引物与探针序列为：

abcg2-f：5’-atgaaacctggtctcaacgc-3’，

abcg2-r：5’-ccacttggatctttccttgc-3’，

abcg2-probe：5’-fam-cacaggtggaggcaaatcttcgt-tamra-3’。

actin-f：5’-tgagcgaggctacagctt-3’；

actin-r：5’-tccttgatgtcgcgcacgattt-3’；

actin-probe：5’-fam-accaccacggccgagcgg-tamra-3’。

所述阳性对照品分别为含有对应abcg2cdna序列的质粒溶液；所述阴性对照品为不含有abcg2cdna序列的质粒溶液；所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

实施例2

1.样本外周血总rna提取操作流程：

(1)采集抗凝新鲜血液1ml，登记好年龄、性别；

(2)在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。

室温静置10min；

(3)5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；

(4)再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；

(5)向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静置5min；

(6)加入0.2ml氯仿，震荡均匀；

(7)14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；

(8)加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；

(9)14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；

(10)14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；

(11)室温干燥10-15min，加入20μlrnase-free水，从而获得提取出的血液中rna溶液。

(12)在nanodrop仪器上测定rna的浓度和纯度，-80℃保存备用。

2.将rna逆转录为cdna

参考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒说明书，将步骤1中获得的rna逆转录为cdna，-20℃保存备用。

3.荧光定量pcr检测

(1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份23μl分装，且每人份检测2次：

x＝23μl检测体系pcr反应液×2×(5份actin内参基因校准品+5份目的基因校准品+n份样本)+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照；其中，这5份abcg2基因校准品指的是10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl的abcg2阳性质粒溶液，每份abcg2基因校准品都需要检测2次，用于绘制针对abcg2基因的标准曲线(如图1所示)和标准扩增曲线图(如图2所示)；这5份actin内参基因校准品指的是10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl的actin阳性质粒溶液，每份actin内参基因校准品都需要检测2次，用于绘制针对actin内参基因的标准曲线(如图3所示)和标准扩增曲线图(如图4所示)。

(2)加样：加入检测体系pcr反应液中2μlcdna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(3)检测：在实时荧光pcr仪上进行检测，可用仪器包括abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(4)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数，然后按照下列原则进行判断：

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)样本结果有效性判断标准：ct<35，有效结果；ct>38，无效结果。

实施例3

采用本发明的方法检测健康体检人群外周血样本。

取送检的健康体检人群外周血样本24例，按实施例2所述方法提取rna、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量pcr检测。

对每份样本而言，取2μl经逆转录获得的cdna，加入到检测体系pcr反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照各一份，内参基因/目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间仅为100分钟。

检测结果如图5所述，以正常人血液cdna为模板检测abcg2和内参基因actin，图中显示ct值均小于35，结果有效。

对24例健康体检人群(abcg2表达量/β-actin内参表达量)比值进行统计，得到健康人群abcg2的表达范围为(0.5-6.5)×10^-3(图7)。由此得评判标准：

当abcg2/β-actin<0.5×10^-3时，为低表达；

当0.5×10^-3<abcg2/β-actin<6.5×10^-3时，为中表达；

当abcg2/β-actin>6.5×10^-3时，为高表达。

实施例4

采用本发明的方法检测肺癌患者外周血样本。

取送检的临床样本24例，按实施例2所述方法提取rna、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量pcr检测。

对每份样本而言，取2μl经逆转录获得的cdna，加入到检测体系pcr反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照各一份，内参基因/目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间仅为100分钟。

检测结果如图7所示，在阴性和阳性对照无误的情况下，检测结果显示临床样本外周血abcg2基因相对表达量如表1所示，24例患者中有15例，表达量低于正常表达范围，有9例落在正常表达范围内。

表1针对肺癌患者外周血样本的检测结果

序列表

<110>南京艾迪康医学检验所有限公司

<120>检测样本中abcg2基因相对表达量的寡核苷酸和方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgaaacctggtctcaacgc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccacttggatctttccttgc20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cacaggtggaggcaaatcttcgt23

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgagcgaggctacagctt18

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tccttgatgtcgcgcacgattt22

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

accaccacggccgagcgg18