基于ddPCR及EGFR热点突变检测人循环肿瘤细胞的引物组、探针组、试剂盒及用途的制作方法

本发明涉及基因检测
技术领域：
，更具体地，特别是涉及到基于ddpcr及egfr热点突变(l858r、19del、t790m)检测人循环肿瘤细胞的引物组、探针组、试剂盒及在检测方法中的用途。
背景技术：
：国家癌症中心发布的2018年全国最新癌症报告中，中国人群中，肺癌发病率、死亡率居首，每年发病约78.1万。非小细胞肺癌(包括腺癌、鳞癌和大细胞癌等多种)约占肺癌的80-85％，egfr在非小细胞肺癌的突变频率约为40-55％。egfr突变是亚洲人群中最主要的nsclc驱动基因，主要发生在胞内tk区域的前四个外显子上(18-21)，目前发现的tk区域突变有30多种，它们能导致不依赖于配体的egfrtk激活。激活突变有三种类型：缺失突变、替代突变、复制或插入突变，都发生在tk区域的atp结合口袋上。酪氨酸激酶抑制剂(tki)是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。egfr突变是癌症患者对tki敏感或耐药的强预测因子，具有极大的临床意义。egfr突变对egfr-tkis用药的指导分为敏感突变、耐药突变，其中敏感突变的93％出现在18-21外显子，超过80％为del19及l858r，其余的属于罕见突变(g719x、e709x、del18、ins19、ins20、s768i、l861q)，敏感突变按突变位点不同对应的相应的一代、二代、三代靶向药；耐药突变主要集中在20外显子，60％的耐药是由t790m引起的，其对应的靶向药为奥希替尼。egfr-tkis用药的选择、用药后疗效检测、耐药检测等都需要egfr突变检测，因此，对于热点突变且具有明确用药指导的突变点，进行经济有效的检测就成为重要的临床检测需求。目前对egfr突变的主要检测方法有：sanger测序法、armspcr、ngs、ddpcr等。sanger测序法可以直接给出序列信息，但在批量检测时操作复杂、检测时间长、数据解读耗时，这些问题使之用于临床检测存在诸多不便。armspcr时目前egfr突变检测的经典方法，其精度为1％，在需要更高精度的检测时，存在一定的局限性。ngs可以一次检测明确多种肿瘤标志物，给用药提供更多的指导，但截至目前为止，中国范围内，肺癌是致癌基因及突变位点高度一致的，出于经济原因和必要性，ngs更适合用于化疗、靶向药等出现耐药后寻找新药时应用。技术实现要素：本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种基于ddpcr及egfr热点突变(l858r、19del、t790m)检测人循环肿瘤细胞的引物组及探针组，以克服现有技术中的不足。本发明的另一主要目的在于提供一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的的试剂盒。本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒于制备基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的产品中的用途。本发明的另一目的还在于提供一种基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的方法。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的引物组，其中所述egfr热点突变的位点包括l858r、19del和t790m，所述引物组包括：检测egfr热点突变位点t790m的第一引物对，包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如seqidno.1所示，所述第二引物的序列如seqidno.2所示；检测egfr热点突变位点19del的第二引物对，包括第三引物和第四引物，且所述第三引物的序列如seqidno.3所示，所述第四引物的序列如seqidno.4所示；检测egfr热点突变位点l858r的第三引物对，包括第五引物和第六引物，且所述第五引物的序列如seqidno.5所示，所述第六引物的序列如seqidno.6所示。本发明实施例还提供了一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的探针组，其中所述egfr热点突变的位点包括l858r、19del和t790m，所述探针组包括：检测egfr热点突变位点t790m的第一探针，其序列如seqidno.7所示；检测egfr热点突变位点19del的第二探针和第三探针，其序列分别如seqidno.8、seqidno.9所示；检测egfr热点突变位点l858r的第四探针，其序列如seqidno.10所示。本发明实施例还提供了一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的试剂盒，其包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为前述的引物组，一探针组为前述的探针组。进一步地，所述试剂盒还包括荧光标记基团cy3、fam、hex和cy5。本发明实施例还提供了前述的试剂盒于制备基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的产品中的用途。进一步地，应用所述产品基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的方法包括：提供待检测的dna样本；使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；采用数字pcr检测技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测，判断dna样本是否包含突变的egfr基因。本发明实施例还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的方法，所述方法包括：提供待检测的dna样本；使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；采用数字pcr检测技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测，判断dna样本是否包含突变的egfr基因。与现有技术相比，本发明的优点包括：1)本发明提供的基于ddpcr及egfr热点突变(l858r、19del、t790m)检测人循环肿瘤细胞的引物、探针，该引物、探针检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变(l858r、19del、t790m)时灵敏度高，特异性强，所设引物、探针能够特异性结合突变序列，且结合稳定，能够实现单拷贝模板条件下的有效扩增；2)本发明提供的基于ddpcr及egfr热点突变(l858r、19del、t790m)检测人循环肿瘤细胞的试剂盒，能够快速、高效、准确检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变(l858r、19del、t790m)状态，成本低、精度高、灵敏度高、准确度高、重复性好、样本投入低、绝对定量；该试剂盒对低投入量样本的绝对定量准确性、灵敏度、重复性良好；对低频突变的检出有良好的结果，单模板扩增的ddpcr可以消除野生型模板带来的干扰；对部分由于抑制剂存在无法良好扩增的样本也可以由良好的检测结果，这是由于ddpcr可以最大化减小抑制剂的效果；3)本发明基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变(l858r、19del、t790m)的检测方法通过荧光检测仪器自动收集的不同芯片位置及其表现的强度荧光信号，自动生成数据，并参考泊松分布特征，经过背景信号处理及阳性信号分析各突变热点的突变频率，给出是否突变及具体突变频率，并呈现直观的可视化结果。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例1中针对突变点t790m、19del、l858r阴性样本检测结果示意图。图2是本发明实施例2中t790m阳性样本检测结果示意图。图3是本发明实施例3中l858r阳性样本检测结果示意图。具体实施方式dpcr的优势在于精确度高，可达到万分之一，但达到同样精度的检测时，ngs成本明显高于ddpcr；在患者不能提供高突变频率组织样本时，ddpcr的应用就很有必要，ddpcr可以检测低丰度突变组织、穿刺样本、低于10ml全血等突变含量在万分之一以内的困难样本，这对不适合手术的患者来说是急需的检测方法；ddpcr采用多通道荧光，可以一次扩增得到全。因此，本发明所用ddpcr对egfr突变检测具有特殊必要性。循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)是指脱离了肿瘤原发部位和转移部位而进入血液循环中的各类肿瘤细胞。ctc在肿瘤早期发现、指导用药、预后复发检测、肿瘤转移提示等方面有明显的优势。一、ctc对于恶性肿瘤进行早期诊断有意义，早期无症状的恶性肿瘤患者外周血中也可检测到少量的ctcs，而在良性疾病及健康体检者血液中未检出ctcs；二，ctcs与原发灶内瘤细胞具有相似的基因遗传学特征，能够实现无创、可持续性监测肿瘤病程，并指导用药；三，预后可持续监测复发状况；四，ctc作为原发灶和转移灶之间的桥梁，携带了大量的肿瘤进展和转移的信息，具有极强的转移潜能，对肿瘤转移复发起到了至关重要的作用。本发明针对循环肿瘤细胞进行检测，可以实现对肿瘤用药、用药监测、耐药检测、复发检测等的无创、高灵敏度、高准确性。数字pcr是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子pcr方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。经pcr扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。其灵敏度非常高，且只需要很少的模板量；尤其适用于痕量、不易得到的待检样品。本发明采用ddpcr进行检测，可以对检测样本进行绝对定量，检测灵敏度精确到0.001％，可以解决低丰度样本的精确定量，有助于肿瘤病程的监测以及早发现、早处理。下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。本发明实施例的一个方面提供了一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的引物组，其中所述egfr热点突变的位点包括l858r、19del和t790m，所述引物组包括：检测egfr热点突变位点t790m的第一引物对，包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如seqidno.1所示(t790m-f即上游引物，具体序列为cgcctgctgggcatctg)，所述第二引物的序列如seqidno.2所示(t790m-r即下游引物，具体序列为cgcctgctgggcatctg)；检测egfr热点突变位点19del的第二引物对，包括第三引物和第四引物，且所述第三引物的序列如seqidno.3所示(19del-f即上游引物，具体序列为gaaagttaaaattcccgtcgctat)，所述第四引物的序列如seqidno.4所示(19del-r即下游引物，具体序列为acccccacacagcaaagc)；检测egfr热点突变位点l858r的第三引物对，包括第五引物和第六引物，且所述第五引物的序列如seqidno.5所示(l858r-f即上游引物，具体序列为ccgcagcatgtcaagatcac)，所述第六引物的序列如seqidno.6所示(l858r-r即下游引物，具体序列为tccttctgcatggtattctttctc)。本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的探针组，其中所述egfr热点突变的位点包括l858r、19del和t790m，所述探针组包括：检测egfr热点突变位点t790m的第一探针，其序列如seqidno.7所示(即t790m-p，具体序列为atgagctgcatgatgag)；检测egfr热点突变位点19del的第二探针和第三探针，其序列分别如seqidno.8、seqidno.9所示(即19del-m，具体序列为acatcgaggatttccttgt；19del-w，具体序列为tccgaaagccaacaaggaaat)；检测egfr热点突变位点l858r的第四探针，其序列如seqidno.10所示(即l858r-p，具体序列为ttggcccgcccaa)。进一步地，所述t790m-p还包括荧光标记基团cy3。进一步地，所述19del-m还包括荧光标记基团fam，19del-w还包括荧光标记基团hex。进一步地，所述l858r-p还包括荧光标记基团cy5。具体的，本发明涉及引物、探针序列及荧光标记信息如下表所列：本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的试剂盒，其包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为前述的引物组，一探针组为前述的探针组。进一步地，所述试剂盒还包括荧光标记基团cy3、fam、hex和cy5等，但不限于此。进一步地，所述的试剂盒还包括pcr扩增检测的常规组件，所述pcr扩增检测的常规组件包括pcr反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(dntps)、dna聚合酶等。本发明实施例的另一个方面还提供了前述试剂盒于制备基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的产品中的用途。进一步地，应用所述产品基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的方法包括：提供待检测的dna样本；使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；采用数字pcr检测技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测，判断dna样本是否包含突变的egfr基因。其中，所述待检测的dna样本来源来源于受试者循环肿瘤细胞。本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于基于ddpcr检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变的方法，所述方法包括：提供待检测的dna样本；使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；采用数字pcr检测技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行检测，判断dna样本是否包含突变的egfr基因。其中，所述待检测的dna样本来源来源于受试者循环肿瘤细胞。以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1(阴性样本)本实施例涉及到的引物、探针序列及荧光标记信息如下表所列：引物名称引物序列荧光信号t790m-fcgcctgctgggcatctgt790m-rcgcctgctgggcatctgt790m-patgagctgcatgatgagcy319del-fgaaagttaaaattcccgtcgctat19del-racccccacacagcaaagc19del-macatcgaggatttccttgtfam19del-wtccgaaagccaacaaggaaathexl858r-fccgcagcatgtcaagatcacl858r-rtccttctgcatggtattctttctcl858r-pttggcccgcccaacy5本实施例采用的试剂包括：ctcs分离本发明以ctcs为检测投入物，本实施例使用系统分离ctcs。以egfr突变阴性肿瘤患者循环肿瘤细胞为例。取肿瘤患者全血4-10ml，离心分离血浆。血浆用系统各富集ctcs，要求不少于20个的ctcs，10μl的nfh2o重悬细胞。本发明提供了阴性对照样品，将k562细胞系提取dna稀释至30mol/μl作为本检测试剂盒的阴性对样品，每批次检测添加阴性对照样品以校验检测批次的准确性。数字pcr反应液制备1.4℃解冻10×引物混合液、2×数字pcr预混液，使用前将这些试剂涡旋5-10秒。2.制备扩增混合物要确定建立的反应数。为补偿在转管过程中的损失，在配置扩增混合物时，增加0.1-2个反应。3.扩增混合物：2×数字pcr预混液15μl10×引物混合液3μlnfh2o2μlmix20μl4.标记pcr反应管，分装扩增混合物到每个标记后的pcr反应管底部。5.将分离所得ctc收集液样本至pcr反应管底部。6.分别添加稀释10倍的阴性对照样品(3mol/μl)、阳性对照样品(3mol/μl)及nf-h2o各10μl，为阴性对照品、阳性对照品。pcr反应微滴制备1.打开微滴制备仪。2.将配好的30μl体系混匀，依次转移到微滴发生卡。3.在油孔中加入微滴生成油。4.选择设置好的微滴制备程序，编辑样本。5.制备完成后，移出制备好的样本，进行下一步pcr反应。pcr扩增pcr仪(bio-radc100096孔梯度扩增仪(1851197)扩增条件将完成pcr反应体系添加的pcr管转移至pcr仪上，反应条件如下：扩增完全后，产物立即进行分析。扩增产物分析将扩增后样品转移至信号采集仪，将采集的芯片各个位置的液滴的荧光信号值保存，并进一步处理背景信号；将处理后的信号按预设值的切割值及突变频率计算方法处理数据；最终给出检测样本的分析结果及可视化结果。突变点突变荧光信号对照荧光信号突变率t790mcy3hex100％*(cy3-hex)/cy319delfamhex100％*(fam-hex)/faml858rcy5hex100％*(cy5-hex)/cy5数据分析后输出检测结果图像。阴性样本中不产生突变荧光信号，只显示对照荧光信号hex，如图1所示。实施例2(t790m阳性样本)本实施例涉及到的引物、探针序列及荧光标记信息如实施例1。本实施例采用的试剂包括：ctcs分离本发明以ctcs为检测投入物，本实施例使用系统分离ctcs。以egfr突变阴性肿瘤患者循环肿瘤细胞为例。取肿瘤患者全血4-10ml，离心分离血浆。血浆用系统各富集ctcs，要求不少于20个的ctcs，10μl的nfh2o重悬细胞。本发明提供了阴性对照样品，将k562细胞系提取dna稀释至30mol/μl作为本检测试剂盒的阴性对样品，每批次检测添加阴性对照样品以校验检测批次的准确性。数字pcr反应液制备1.4℃解冻10×引物混合液、2×数字pcr预混液，使用前将这些试剂涡旋5-10秒。2.制备扩增混合物要确定建立的反应数。为补偿在转管过程中的损失，在配置扩增混合物时，增加0.1-2个反应。3.扩增混合物：2×数字pcr预混液15μl10×引物混合液3μlnfh2o2μlmix20μl4.标记pcr反应管，分装扩增混合物到每个标记后的pcr反应管底部。5.将分离所得ctc收集液样本至pcr反应管底部。6.分别添加稀释10倍的阴性对照样品(3mol/μl)、阳性对照样品(3mol/μl)及nf-h2o各10μl，为阴性对照品、阳性对照品。pcr反应微滴制备1.打开微滴制备仪。2.将配好的30μl体系混匀，依次转移到微滴发生卡。3.在油孔中加入微滴生成油。4.选择设置好的微滴制备程序，编辑样本。5.制备完成后，移出制备好的样本，进行下一步pcr反应。pcr扩增pcr仪(bio-radc100096孔梯度扩增仪(1851197)扩增条件将完成pcr反应体系添加的pcr管转移至pcr仪上，反应条件如下：扩增完全后，产物立即进行分析。扩增产物分析将扩增后样品转移至信号采集仪，将采集的芯片各个位置的液滴的荧光信号值保存，并进一步处理背景信号；将处理后的信号按预设值的切割值及突变频率计算方法处理数据；最终给出检测样本的分析结果及可视化结果。突变点突变荧光信号对照荧光信号突变率t790mcy3hex100％*(cy3-hex)/cy319delfamhex100％*(fam-hex)/faml858rcy5hex100％*(cy5-hex)/cy5数据分析后输出检测结果图像如图2所示，t790m阳性样本中只产生cy3突变荧光信号及对照荧光信号hex，不产生fam及cy3。实施例3(l858r阳性样本)本实施例涉及到的引物、探针序列及荧光标记信息如实施例1。本实施例采用的试剂包括：ctcs分离本发明以ctcs为检测投入物，本实施例使用系统分离ctcs。以egfr突变阴性肿瘤患者循环肿瘤细胞为例。取肿瘤患者全血4-10ml，离心分离血浆。血浆用系统各富集ctcs，要求不少于20个的ctcs，10μl的nfh2o重悬细胞。本发明提供了阴性对照样品，将k562细胞系提取dna稀释至30mol/μl作为本检测试剂盒的阴性对样品，每批次检测添加阴性对照样品以校验检测批次的准确性。数字pcr反应液制备1.4℃解冻10×引物混合液、2×数字pcr预混液，使用前将这些试剂涡旋5-10秒。2.制备扩增混合物要确定建立的反应数。为补偿在转管过程中的损失，在配置扩增混合物时，增加0.1-2个反应。3.扩增混合物：2×数字pcr预混液15μl10×引物混合液3μlnfh2o2μlmix20μl4.标记pcr反应管，分装扩增混合物到每个标记后的pcr反应管底部。5.将分离所得ctc收集液样本至pcr反应管底部。6.分别添加稀释10倍的阴性对照样品(3mol/μl)、阳性对照样品(3mol/μl)及nf-h2o各10μl，为阴性对照品、阳性对照品。pcr反应微滴制备1.打开微滴制备仪。2.将配好的30μl体系混匀，依次转移到微滴发生卡。3.在油孔中加入微滴生成油。4.选择设置好的微滴制备程序，编辑样本。5.制备完成后，移出制备好的样本，进行下一步pcr反应。pcr扩增pcr仪(bio-radc100096孔梯度扩增仪(1851197)扩增条件将完成pcr反应体系添加的pcr管转移至pcr仪上，反应条件如下：扩增完全后，产物立即进行分析。扩增产物分析将扩增后样品转移至信号采集仪，将采集的芯片各个位置的液滴的荧光信号值保存，并进一步处理背景信号；将处理后的信号按预设值的切割值及突变频率计算方法处理数据；最终给出检测样本的分析结果及可视化结果。突变点突变荧光信号对照荧光信号突变率t790mcy3hex100％*(cy3-hex)/cy319delfamhex100％*(fam-hex)/faml858rcy5hex100％*(cy5-hex)/cy5数据分析后输出检测结果图像如图3所示，l858r阳性样本中只产生cy5突变荧光信号及对照荧光信号hex，不产生fam及cy5。综上所述，藉由上述技术方案，本发明的引物、探针检测egfr热点突变时灵敏度高，特异性强，所设引物、探针能够特异性结合突变序列，且结合稳定，能够实现单拷贝模板条件下的有效扩增；该检测试剂盒能够快速、高效、准确检测人循环肿瘤细胞egfr热点突变。本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。序列表<110>苏州绘真医学检验有限公司<120>基于ddpcr及egfr热点突变检测人循环肿瘤细胞的引物组、探针组、试剂盒及用途<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>1cgcctgctgggcatctg17<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>2cgcctgctgggcatctg17<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>3gaaagttaaaattcccgtcgctat24<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>4acccccacacagcaaagc18<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>5ccgcagcatgtcaagatcac20<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>6tccttctgcatggtattctttctc24<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>7atgagctgcatgatgag17<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>8acatcgaggatttccttgt19<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>9tccgaaagccaacaaggaaat21<210>10<211>13<212>dna<213>人工序列(人工序列)<400>10ttggcccgcccaa13当前第1页1 2 3