磷脂酰肌醇聚糖3抗体及其偶联物的制作方法

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：磷脂酰肌醇聚糖3(gpc3)是细胞表面蛋白聚糖，已知其在肝细胞癌细胞上表达，并已经在许多恶性细胞中被报道。本发明提供了gpc3抗体及其偶联物。发明概述本文提供了抗gpc3抗体和针对gpc3的抗体药物偶联物。特别是，本文提供了针对gpc3的微管蛋白裂解素(tubulysin)抗体-药物偶联物，以及使用该偶联物治疗表达gpc3的疾病的方法。优选的抗gpc3抗体是鼠gpc3-1抗体的嵌合或人源化形式。鼠gpc3-1抗体包含具有seqidno:8列出的氨基酸序列的重链可变区和seqidno:9中列出的氨基酸序列的轻链可变区。附图说明图1显示了人gpc3的序列。图2a显示了hgpc3-1重链变体与人vh供体序列hv1-18/hj4的序列比对。图2b显示了hgpc3-1重链变体与人vh供体序列hv1-69-2/hj4的序列比对。图3显示了hgpc3-1重链变体的序列比对。图4显示了hgpc3-1轻链变体与人vl供体序列kv1-30/kj2的序列比对。图5显示了hgpc3-1轻链变体的序列比对。图6显示了hgpc3-1ec的表面等离子体共振结合数据。(左)多个传感图数据代表与固定化hgpc3结合的不同浓度(400,160,64,25.6,10.2,4.1,和1.64nm)的hgpc3-1ec。(右)kd通过每种浓度下的600秒最大响应作图确定，并通过半最大结合定义。图7显示了体外细胞毒性实验的结果，其测试人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1sgd-6183抗体-药物偶联物对一组表达gpc3的hcc细胞系的效果，这些细胞系包括jhh7,huh7,和hep3b。图8显示了体外细胞毒性实验的结果，其测试人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1sgd-6183抗体-药物偶联物对一组表达gpc3的肺癌细胞系的效果，这些细胞系包括nci-h661和nci-h446。图9显示hcc异植体模型jhh7的结果。图10显示hcc异植体模型huh7的结果。图11显示hcc异植体模型hep3b的结果。图12显示肺癌异植体模型nci-h661的结果。图13显示当与s239c或天然半胱氨酸偶联时，微管蛋白裂解素m乙酸盐稳定性和接头马来酰亚胺的稳定性的体内评估结果。定义本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了少数中存在的可能天然发生的突变外，群体包含的单独抗体是相同的。修饰语“单克隆”指示该抗体获自基本均质的抗体群这一特点，而不应被解释为需要通过任何特定的方法来产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可通过首先由kohler等，nature256:495(1975)所述的杂交瘤方法，或通过重组dna方法(参见例如美国专利号4816567)制备。也可通过例如clackson等，nature352:624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)所述的技术，也可通过其他方法从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。本文所述的抗体是单克隆抗体。抗体通常以分离的形式提供。这意味着抗体通常在从其生产和纯化来源产生的干扰蛋白和其他污染物中具有至少50％w/w的纯度，但不排除可能抗体结合有过量的药学上可接受的运载体或其他载剂，便于其使用。有时抗体在生产或纯化来源的干扰蛋白和污染物中具有至少60％,70％,80％,90％,95或99％w/w的纯度。抗体(包括分离的抗体)可与细胞毒剂偶联，并作为抗体-药物偶联物提供。“分离的”多核苷酸指已从其天然组分中鉴定分离和/或回收的多核苷酸。单克隆抗体与其靶抗原的特异性结合意味着至少106,107,108,109,或1010m-1的亲和力。特异性结合在数量级上可检测地更高，且可与至少一种无关靶标的非特异性结合区别开来。特异性结合可能是由于特定官能团之间成键或特定的空间匹配(例如锁匙类型)，而非特异性结合通常是由于范德华力。针对gpc3的抗体药物偶联物和抗-gpc3抗体与gpc3特异性结合。基础抗体结构单元是亚基的四聚体。各四聚体包括两个相同的多肽链对，各对有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50-70kda)。各链的氨基末端部分包含约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。可变区最初表达成与可切割信号肽连接。不含信号肽的可变区有时被称作成熟可变区。因此，例如轻链成熟可变区指不含轻链信号肽的轻链可变区。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，这进而确定了抗体的同种型，分别为igg、igm、iga、igd和ige。在轻链和重链中，下标(subscript)和恒定区之间由约12个或更多氨基酸大小的“j”链连接，而重链还包括约10个或更多氨基酸的“d”区。(参见例如《基础免疫学》(fundamentalimmunology)第7章(paul,w.,编，第2版，瑞文出版社(ravenpress)，纽约(1989)，在此完整引入参考)。每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。链全部显示由三个高变区(也称作互补决定区或cdr)连接的相对保守框架区(fr)的相同一般结构。每对两根链的cdr通过框架区对齐，能够与特定表位结合。从n端到c端，轻链和重链都包含结构域fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3和fr4。各结构域氨基酸的分配与kabat，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(《免疫学热门蛋白的序列》)(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)(1987和1991))或chothia和lesk，j.mol.biol.196:901-917(1987)；chothia等，nature342:878-883(1989)的定义一致。kabat还提供了广泛使用的编号法(kabat编号系统)，其中不同重链可变区或不同轻链可变区之间的对应残基编以相同数字。重链恒定区的编号是根据kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(kabat，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院，1987和1991)中的eu编号系统编号的。术语“抗体”包括完整抗体及其抗原结合片段。“完整抗体”是指包含抗原结合可变区以及适合抗体类型的轻链恒定域(cl)和重链恒定域ch1,ch2,ch3和ch4的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。抗体片段与衍生出这些片段的完整抗体竞争与靶标的特异性结合，包括分离的重链，轻链fab,fab',f(ab')2,f(ab)c,双抗,dabs,纳米抗体和fv。可通过重组dna技术，或酶或化学分离完整的免疫球蛋白来产生片段。术语“抗体”还包括双抗体(同聚fv片段)或小抗体(vl-vh-ch3),双特异性抗体等。双特异性或双功能抗体是人工杂交抗体，其具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点(见例如songsivilai和lachmann,clin.exp.immunol.,79:315-321(1990)；kostelny等,j.immunol.,148:1547-53(1992))。术语“患者”包括人和其他哺乳动物对象，其接受预防性或治疗性处理。出于将氨基酸取代归类为保守或非保守性的目的，氨基酸如下分组：组i(疏水性侧链):met,ala,val,leu,ile；组ii(中性亲水性侧链):cys,ser,thr；组iii(酸性侧链):asp,glu；组iv(碱性侧链):asn,gln,his,lys,arg；组v(影响链朝向的残基):gly,pro；和组vi(芳族侧链):trp、tyr、phe。保守性取代涉及在同组内的氨基酸间的取代。非保守性取代需要这些类别之一的成员与另一类别交换。由kabat编号法最大对齐的抗体序列确定序列相同性百分数。比对后，如果对象抗体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参比抗体的相同区域比较，对象和参比抗体区之间的序列相同性百分数为对象和参比抗体区中相同氨基酸占据的位置数目除以两个区域比对的位置总数(不计算空隙)，再乘以100，转换成百分数。“包含”一个或多个所述元件的组合物或方法可包括其他没有特别引述的元件。例如，包括抗体的组合物可包含单独的抗体或与其他成分的组合。术语“治疗有效量”或“有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病况的抗体-药物偶联物量。在癌症的情况下，治疗有效量的偶联物可以减少癌细胞的数量，减小肿瘤的大小，抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞向周围器官的浸润，抑制(即在某种程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移，抑制肿瘤的生长，和/或减轻与癌症有关的一种或多种症状。对于癌症治疗，可以例如通过评估疾病进展时间(ttp)，和/或确定响应率(rr)来衡量疗效。除非另外说明，术语“有效方案”指给予的偶联物量与给药频率的组合，其足够实现疾病治疗。除非上下文另有说明，术语“治疗”指治疗性处理，其中目的是抑制或减缓(减少)不良生理改变或异常，例如癌症发生或扩散。有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的缓解症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和缓解(部分或完全)。“治疗”也可以指与不接受治疗的期望存活相比延长生存期。需要治疗的人包括具有可检测疾病的那些。需要治疗的人还可包括患有不可检测的疾病的那些，例如在gpc3表达异常治疗后实现完全反应，但仍然需要治疗以防止复发的患者。除非上下文另外说明或提示，本文所用的术语“化合物”是指并涵盖化合物本身，命名或通过结构表示，包括其盐形式，无论是否明确说明，除非上下文明确表明此类盐形式被排除在外。化合物盐包括具有有机抗衡离子或无机抗衡离子的两性离子盐形式和酸加成盐和碱加成盐形式，以及涉及两种或更多种相同或不同的抗衡离子的盐形式。在一些方面，盐形式是化合物的药学上可接受的盐形式。术语“化合物”还包括化合物的溶剂化物形式，其中溶剂与化合物非共价结合或与化合物可逆地共价结合，例如当化合物的羰基被水合形成偕二醇(gem-diol)醇。溶剂化物形式包括化合物本身及其盐形式的形式，包括半溶剂化物，单溶剂化物，二溶剂化物，包括水合物；当化合物可以与两个或更多个溶剂分子缔合时，两个或更多个溶剂分子可以相同或不同。在某些情况下，本发明的化合物将明确提及一种或多种上述形式，例如盐和溶剂化物，其并不意味着该化合物为固态形式；然而，该参考仅是为了强调，并且不应被解释为排除以上确定的任何其他形式。此外，当未明确提及化合物或抗体药物偶联物组合物的盐和/或溶剂化物形式时，该省略不应解释为排除化合物或偶联物的盐和/或溶剂化物形式，除非上下文清楚地排除了这些盐和/或溶剂化物形式。除非上下文另有说明或暗示，本文所用的术语"部分"意味着分子或化合物的特定节段、区段或官能团。化学部分有时表示为嵌入或附加至(即取代基或可变基团)分子、化合物或化学式的化学实体。除非另有说明或上下文暗示，否则对于本文中由给定碳原子范围描述的取代基或部分，指定范围表示描述了任意单个的碳原子数。因此，提及例如“任选取代的c1-c4烷基”或“任选取代的c2-c6烯基”具体分别是指存在如本文所定义的任选取代的1,2,3或4个碳的烷基部分，存在如本文所定义的任选取代的2,3,4,5或6个碳的烯基部分。所有这些数字标记明确地旨在公开所有单个碳原子基团；因此，“任选取代的c1-c4烷基”包括甲基，乙基，3-碳烷基和4-碳烷基，包括它们的所有位置异构体，无论是取代的还是未取代的。因此，当烷基部分被取代时，数字标记是指未取代的基础部分，并不旨在包括未直接连接至该基础部分的取代基中可能存在的基础部分的碳原子。对于由给定范围的碳原子定义的本文所述的酯、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲，标号范围包括相应官能团的羰基碳。因此，c1酯是指甲酸酯，c2酯是指乙酸酯。本文所述的有机取代基、部分或基团，和本文所述的任意其他部分通常将排除不稳定部分，除非这种不稳定部分是可用于制备对于本文所述的一种或多种用途具有足够化学稳定性的化合物的瞬态物质。通过操作本文提供的定义导致具有五价碳的那些的取代基，部分或基团被特别排除。除非上下文另有说明或暗示，本文所用的“烷基”本身单独或作为另一个术语的一部分是指甲基或连续碳原子的集合，其中之一是单价的，其中一个或多个碳原子是饱和的(即，包含一个或多个sp3碳)，并且以正、仲、叔或环状排列，即线性、分支、环状排列或其一些组合共价连接到一起。当连续的饱和碳原子处于环状排列时，在某些方面，这些烷基部分被称为如本文所定义的碳环基。当将烷基部分称为烷基取代基时，与其相关的马库什结构或另一有机部分的该烷基取代基是甲基或通过烷基取代基的sp3碳共价连接至该结构或部分的连续碳原子的链。本文所用的烷基取代基因此包含至少一个饱和部分，还可额外包含一个或多个独立选择的双键和/或三键，以定义不饱和烷基部分，还可被1-4，通常为1-3或1或2个其他包括本文所示的合适任选取代基的部分取代。饱和烷基部分中的碳原子数可以是不同的，通常为1-8,1-6或1-4，在不饱和的烷基部分中通常为3-8,3-6或3-4。除非上下文另有说明或暗示，否则术语“烃基”将指示饱和的非环状烃基基团，其中所述烃基基团具有指定数目的共价连接的饱和碳原子，使得术语例如“c1-c6烃基”或“c1-c6烃基”是指含有1个饱和碳原子(即甲基)或2、3、4、5或6个连续的非环状饱和碳原子的饱和烃基部分或基团，并且“c1-c8烃基”是指具有1个饱和碳原子或2、3、4、5、6、7或8个连续的饱和非环碳原子的饱和烃基部分或基团。当指定饱和的烃基取代基、部分或基团时，物质包括由从母体烷烃中去除氢原子衍生的那些物质(即，烃基部分是一价的)，并且可包括甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、2-丙基(异丙基，-ch(ch3)2)、1-丁基(正丁基)、2-甲基-1-丙基(异丁基，-ch2ch(ch3)2)、2-丁基(仲丁基，-ch(ch3)ch2ch3)、2-甲基-2-丙基(叔丁基，-c(ch3)3)、戊基、异戊基、仲戊基和其他直链和支链烃基部分。除非上下文另行指出或暗示，否则如在本文通过自身或作为另一术语的一部分所用的“亚烷基”是指取代或未取代的饱和的支链或直链烃双自由基，其中一个或多个碳原子是饱和的(即，由一个或多个sp3碳组成)，其具有所述数目的碳原子，通常为1至8个，1或6，或1至4个碳原子，并且具有两个自由基中心(即，是二价的)。从亲本烷烃或从本文所述的烷基自由基的同一个或两个不同的饱和(即sp3)碳原子上除去两个氢原子产生的自由基中心，其中在烷基自由基上从其另一个饱和碳或从烷基自由基的自由基碳上除去一个氢原子，形成双自由基。亚烃基部分的例子不限于亚甲基(-ch2-),1,2-亚乙基(-ch2ch2-),1,3-亚丙基(-ch2ch2ch2-),1,4-亚丁基(-ch2ch2ch2ch2-),等双自由基。通常，亚烃基是仅含有sp3碳的支链或直链烃(即，尽管存在自由基碳原子，但是完全饱和的)并且在一些方面是未取代的。在其他方面，亚烃基包含一个或多个双键和/或三键官能团，通常为1或2，更通常为1的此类官能团形式的不饱和内部位点，不饱和亚烃基部分的末端碳原子是一价sp3碳原子。在其他方面，亚烷基是未取代的或被1至4，通常为1至3，或1或2个本文定义为任选取代基的取代基取代。除非在上下文中另有所指或提示，本文所用的“可任选取代的烷基”或“可任选取代的苯基”指本文所定义的烷基或苯基取代基、部分或基团，其中该取代基、部分或基团的氢原子可任选地被不同的部分或基团替换，包括选自以下的基团：氰基、卤素、-cx3,其中x独立为卤素、本文所述的n-连接的部分和o-连接的部分。通常存在的可任选的取代基选自：-x,-cl,-oh,-or’–oc(＝o)r’,-nh2,-nh(r’),-nr’(r’)2,-n(r’)3,-cf3,-cn,和-no2,其中各x独立为卤素，每个r’独立为c1-c6烷基。本文所用的“o-连接的部分”指含氧有机部分，其与其结合的马库什结构或其他部分通过氧原子直接连接。o-连接的部分包括-oh,酰氧基(即-oc(＝o)ra,其中ra通常为-h,可任选取代的烷基或可任选取代的苯基，和醚基例如c1-c6烷氧基，其中烷基部分是饱和或不饱和的。其他示范性o-连接的取代基如氨基甲酸酯定义所示。本文所用的“n-连接的部分”指含氮有机部分，其与其结合的马库什结构或其他部分通过氮原子直接连接。n-连接的部分包括–nh2,-nhra,-n(ra)2和酰胺(即-nrac(＝o)ra)，其中ra通常选自：–h,可任选取代的c1-c6烷基和可任选取代的苯基。其他示范性n-连接的取代基如氨基甲酸酯定义所示。本文所用的“氨基甲酸酯”指一种取代基、部分或基团，其包含一个氨基甲酸酯官能团，如-o-c(＝o)n(ra)-或-o-c(＝o)n(ra)2所示,其中ra独立选自氢，可任选取代的c1-c6烷基并包括-o-c(＝o)nh(可任选取代的烷基)或-o-c(＝o)n(可任选取代的烷基)2,其例子为氨基甲酸酯取代基，其中可任选取代的烷基独立选自可任选取代的c1-c6烷基和。当氨基甲酸酯作为马库什基团(即取代基)时，氨基甲酸酯官能团的单键合的氧(o-连接的)或氮(n-连接的)与和其结合的马库什式连接。氨基甲酸酯基取代基的连接是明确陈述的(n-或o-连接的)或隐含在涉及该取代基的上下文中。本文所示的o-连接的氨基甲酸酯为示例性单价o-连接的部分，n-连接的氨基甲酸酯为示例性n-连接的部分。本文所用的“卤素”或“卤代”指氟、氯、溴或碘，通常为–f或-cl。除非另有说明或上下文暗示，否则本文使用的术语“其盐”是指化合物的盐形式(例如，药物，药物接头化合物或抗体药物偶联物化合物)。化合物的盐形式是一种或多种内部盐形式和/或涉及包括另一个分子，例如乙酸根离子，琥珀酸根离子或其他抗衡离子。化合物盐形式中的抗衡离子通常为有机或无机部分，其稳定亲本化合物上的电荷。化合物的盐形式在其结构中具有一个或多个带电原子。当多个带电原子是盐形式的部分时，存在多个抗衡离子和/或多个带电抗衡离子。因此，化合物的盐形式通常相对于化合物非盐形式具有一个或多个带电原子以及一个或多个抗衡离子。在一些方面，化合物的非盐形式包含至少一个氨基或其他碱性部分，因此当存在酸时，获得碱性基团的酸加成盐。在其他方面，化合物的非盐形式包含至少一个羧酸基团或其他酸性部分，因此当存在碱时，获得羧酸盐或其他阴离子基团。示例性化合物盐形式中的抗衡阴离子和抗衡阳离子包括但不限于：硫酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯离子、溴离子、碘离子、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1.1’-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐)。化合物的盐形式的选择取决于药物产品必须具有的性质，包括在各种ph值下的足够的水溶性，取决于预期的给药途径，具有适合于处理的流动特性和低吸湿性(即吸水性)的结晶度，以及通过确定加速条件下的化学和固态稳定性(即，用于确定在40℃和75％相对湿度下储存时的降解或固态变化)所要求的保质期。本文所用术语“药学上可接受”表示被联邦或州政府管理机构批准或可批准，或美国药典或其它公认药典所列用于动物应用，更具体用于人。术语“药学上相容成分”指药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂，抗体或抗体药物偶联物与其一起给予对象。“药学上可接受的盐“是适合于如本文所述给予对象的化合物的盐形式，并且在一些方面包括如下所述的抗衡阴离子和抗衡阳离子：p.h.stahl和c.g.wermuth编撰,《药用盐的手册：性质、选择和使用》(handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selectionanduse),weinheim/zürich:wiley-vch/vhca,2002。本发明所述的溶剂化物是本发明化合物通过与溶剂分子配位形成复合物的形式。水合物是溶剂化物中的一种特殊形式，其中配位与水发生。本发明中优选的溶剂化物为水合物。本文所用的“微管蛋白裂解素化合物”(除非上下文另有所指或说明)是一种基于四肽的微管蛋白破坏剂，具有细胞毒性或细胞抑制活性，其特征是具有一个非天然氨基酸残基，其具有中央的5元含氮杂亚芳基部分和n-末端哌啶酸残基，在一些方面包含叔胺，可用于掺入抗体药物偶联物作为季铵化药物单元。适合季铵化的非限制性示范性微管蛋白裂解素具有以下结构：或其盐，特别是药学上可接受的盐，其中当微管蛋白裂解素化合物掺入季铵化药物单元时，所示氮原子是季铵化位点；圆圈代表5元含氮杂亚芳基部分，其中杂芳基上所示的取代基彼此为1,3-关系，在剩余位置可任选取代；x是o,s,或nr2b；r3,r4,r5和r6独立为可任选取代的c1-c6烷基,r7a是可任选取代的苯基；r2b和r8a独立为氢或可任选取代的c1-c6烷基；z是–ch2-,-ch2ch2-或–ch＝ch-,而r2a是氢或可任选取代的c1-c6烷基，或-xr2a代表单价o-连接的取代基或单价n-连接的取代基。示范性的制备微管蛋白裂解素药物的方法及其构效关系见以下文献：shankar等，“新微管蛋白裂解素u类似物的合成和构效关系--对微管缬氨酸片段的结构变体的细胞杀伤的效果”org.biomol.chem.(2013)11:2273-2287；xiangming等，“微管蛋白裂解素合成中的最新进展”mini-rev.med.chem.(2013)13:1572-8；shankar等“微管蛋白裂解素-u的对映异构体和n-端类似物的合成和细胞杀伤评估”tet.lett.(2013)54:6137-6141；shankar等“微管蛋白裂解素u的恶唑类似物的完全合成和细胞杀伤评估”synlett(2011)2011(12):1673-6；raghavan等j.med.chem.(2008)51:1530-3；balasubramanian,r.等，“掺入微管蛋白裂解素类似物的去甲基和二甲基微管苯基丙氨酸衍生物”bioorg.med.chem.lett.(2008)18:2996-9；和raghavan等“细胞杀伤性简化微管蛋白裂解素类似物”j.med.chem.(2008)51:1530-3。在一些方面，适合季铵化的微管蛋白裂解素包括具有以下结构的那些：或其盐，特别是药学上可接受的盐，其中r2a是甲基、乙基或丙基，或–c(＝o)r2b,其中r2b如前定义；且r7b是氢或-oh。在其他方面，适合季铵化的微管蛋白裂解素是微管蛋白裂解素m，其具有以上结构，其中r2a是–c(＝o)ch3，且r7b是氢或是具有上述结构的微管蛋白裂解素化合物，其中r2a是乙基且r7b是氢。本文所用的(除非在上下文中另外说明或暗示)“季铵化的微管蛋白裂解素药物单元”涉及含叔胺的微管蛋白裂解素化合物，其中其叔胺氮存在于季铵化药物单元结构中，当该季铵化药物单元从抗体药物偶联物的药物接头部分释放时，提供含有游离叔胺的微管蛋白裂解素化合物。在一些方面，季铵化微管蛋白裂解素药物单元(d+)通过微管蛋白裂解素化合物的c端组分的叔胺氮与具有合适离去基团的接头单元前体缩合获得。在其他方面，c-端组分首先与微管蛋白裂解素化合物的其他部分一起季铵化，然后附着完成d+单元。因此，含有季铵化微管蛋白药物单元的结构并不意指特殊方法，其中形成d+并且其形成不需要反应物是含叔胺的药物，但仅仅需要d+掺入或对应于要从抗体药物偶联物化合物上释放的含叔胺的结构。除非另外说明或提示，本文所用的“延伸单元”指抗体药物偶联物基于葡糖苷酸的药物接头部分中的接头单元组分，其插在接头单元的琥珀酸部分或其水解形式之间，与抗体结合；以及葡糖苷酸单元组分。另外，延伸单元指基于葡糖苷酸的药物接头化合物中的接头单元组分，其可用于抗体药物偶联物制备，插在葡糖苷酸单元与接头单元的马来酰亚胺部分之间。延伸单元(a)可以是单个单元或可包含多个亚单元。通常，a是一个独特的单元或者具有2至4个独特的亚单元。在一些方面，延伸单元或其第一亚单元由可任选取代的c1-c6亚烷基组成，其二价中心之一与马来酰亚胺或琥珀酰亚胺部分或其水解形式的氮原子连接，另一个与羰基残基结合，其中有时存在c1-c6亚烷基的可任选取代基作为基础单元以提供自稳定的接头，如wo2013/173337所述。当a具有2或更多个不同亚单位时，第二个亚单位通常是–lp(peg)部分，其中lp是平行连接子单元，其由含三官能性胺的氨基酸残基组成，peg是本文所定义的peg单元，或α-氨基酸、β-氨基酸或其他含胺的酸残基。在每一种情形下，第二亚单位的含胺酸残基的胺氮原子与第一亚单位的羰基残基结合，第二亚单位的羰基残基的碳原子与基于葡糖苷酸的接头单元的葡糖苷酸单元或a的第三个亚单位的胺氮原子键合,后者通常是另一个含胺酸残基，其中其羰基与基于葡糖苷酸的接头单元的葡糖苷酸单元键合。除非上下文另有说明或所指，本文所用的“平行连接子单元”是抗体药物偶联物的药物接头基团的接头单元中，或具有疏水性药物单元的药物接头化合物的接头单元中的三官能性有机部分，其中三官能团之一与peg单元结合，其他两个与接头单元中的平行连接子(lp)结合，从而使得peg单元能与疏水药物单元呈平行朝向，从而至少部分掩蔽其疏水性。与lp结合的peg单元包含重复数目的乙二醇亚单位，通常为8-24，以提供掩蔽性。lp,peg和疏水药物单元在wo2015/057699中进一步所述，其公开内容在此引入以供参考。除非上下文另有说明或所指，本文所用的“葡糖苷酸单元”是与抗体药物偶联物或药物接头化合物基于葡糖苷酸的药物接头部分的药物单元结合的接头单元的可切割组分，由通过糖苷酸键键合的氨基苄基残基和糖类残基组成，其中苄基能够在糖苷酸酶作用时在糖苷酸键处自行分解，以释放作为游离药物的药物单元。在一些方面，季铵化药物单元，例如本文所定义的季铵化微管蛋白裂解素药物单元，与氨基苄基部分的苄基碳原子共价结合；该氨基苄基部分的氨基氮原子与接头单元的剩余部分共价结合，其亚芳基被糖苷酸键合的糖残基(例如葡糖醛酸残基)取代，其中糖残基与苄基碳原子为邻位或对位关系，从而糖苷酸酶切割糖苷键后苄基自发片段化，以释放作为含游离季铵的药物的季铵化药物单元。在其他方面，氨基甲酸酯官能基团插在未季铵化的含胺的药物单元的苄基碳原子和氨基氮原子之间，其中氨基甲酸酯官能团的单价氧原子与苄基碳原子共价结合。在这些方面中，释放的药物单元包含氨基甲酸官能团，其自发丢失co2以提供含游离胺的药物。结合于未季铵化药物单元的葡糖苷酸单元如wo2007/011968进一步所述，结合于季铵化药物单元的葡糖苷酸单元进一步如wo2016/040684所述。除非上下文另外说明，术语“约”包括一定值标准误差范围内的值。具体实施方式i.概述本发明部分基于以下发现：抗体药物偶联物，包括靶向人gpc3的抗体药物偶联物对杀伤表达gpc3+的细胞特别有效。特别是，发现可用重链可变区受体序列(种系highv1-18或highv1-26-2和j外显子jh-4)和轻链可变区受体序列(种系higkv2-30和j外显子jk-2),通过将一个或多个关键位点的残基突变回鼠抗体或鼠种系序列，构建高亲和性gpc3-1人源化抗体。对于重链，这些关键位点包括以下位点中的一个或多个：h24,h38,h48,h66,h67,h69,h71,h73,h93,和h94。对于轻链，这些关键位点包括以下位置的一个或多个：l45,l46,l105,和l106。gpc3-1人源化抗体能作为抗体药物偶联物(adc)的一部分进行有效药物递送。当与sgd-6859微管蛋白裂解素m药物-接头偶联时，得到的hgpc3-1ec微管蛋白裂解素m偶联物(hgpc3-1ecsgd-6859)能对一组hcc细胞系高度活性。在hgpc3-1后的“ec”指抗体在重链239处具有半胱氨酸取代(编号根据kabat列出的eu编号法)。hgpc3-1ecsgd-6859adc可靶向表达gpc3的肿瘤，例如肝细胞癌(hcc)。hcc分类为一般对化疗抗性。这是由于hcc细胞中的药物外排转运体的高表达。这些转化子有效排出系统性化疗药。微管蛋白裂解素m是药物外排转运体的弱底物，因此是靶向hcc的adc的有效药物-接头。另外，微管蛋白裂解素m足够透过细胞以具有充分的旁观者(bystander)活性。ii.本发明的抗体人源化抗体是遗传工程改造的抗体，其中来自非人“供体”抗体的cdr被植入人“受体”抗体序列(见例如queen,us5,530,101和5,585,089；winter,us5,225,539；carter,us6,407,213；adair,us5,859,205；和foote,us6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟人抗体序列，这些序列的复合物，人抗体序列的共有序列，或种系区序列。因此，人源化抗体是一些或全部cdr完全或基本来自非人供体抗体，而如存在时恒定区和可变区框架序列完全或基本来自人抗体序列的抗体。类似地，人源化重链具有至少一个，两个，通常全部三个完全或基本来自供体抗体重链的cdr，和如存在，基本来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区。类似地，人源化轻链具有至少一个，两个，通常全部三个完全或基本来自供体抗体轻链的cdr，和如存在，基本来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区。除了纳米抗体和双抗，人源化抗体通常包含人源化重链和人源化轻链。人源化或人抗体中的cdr基本来自非人抗体中对应的cdr或基本与其相同，在各cdr之间有至少60％,85％,90％,95％或100％对应残基(如kabat定义)是相同的。在一些实施方式中，当各cdr中没有三个以上的保守氨基酸取代时，人源化抗体或人抗体中的cdr基本来自非人抗体中对应的cdr或与其基本相同。当与kabat定义的对应残基有至少70％,80％,85％,90％,95％或100％相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本分别来自人可变区框架序列或人恒定区。在本发明的一些人源化抗体中，在抗体的重链可变区框架区中有至少3个且多至9个鼠gpc3-1回复突变，在抗体轻链可变区中多至4个的鼠gpc3-1回复突变。虽然人源化抗体通常包含全部6个来自小鼠抗体的cdr(优选由kabat定义)，也可以用少于全部的(例如至少3、4或5)来自小鼠抗体的cdr制备(例如pascalis等，j.immunol.169:3076,2002；vajdos等,journalofmolecularbiology,320:415-428,2002；iwahashi等,mol.immunol.36:1079-1091,1999；tamura等，journalofimmunology,164:1432-1441,2000)。可选择人可变区框架残基的一些氨基酸基于其可能的对cdr构型和/或与抗原结合的影响进行取代。这种可能的影响的调查是通过建模，检测特定位置氨基酸的特征，或对特定氨基酸的取代或诱变的作用的经验观察实现的。本发明提供了针对人gpc3抗原的抗体。优选的抗体是衍生自鼠gpc3-1抗体的嵌合或人源化抗体。重链可变区的优选受体序列是种系highv1-18或highv1-69-2和j外显子jh4。对于轻链可变区，优选受体序列是种系higkv2-30和j外显子jk2。示范性抗gpc3抗体是人源化抗体，其包括seqidno:1列出的重链cdr和seqidno:2列出的轻链cdr，还可具有成熟重链可变区，其与seqidno:1有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％或95％的相同性，和成熟轻链可变区，其与seqidno:2具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％或95％的相同性。cdr如kabat定义。优选维持以下重链可变域框架的氨基酸残基：h24被v占据,h38被q占据,h48被m占据,h66被r占据,h67被v占据,h69被l占据,h71被a占据,h73被k占据,h93被g占据,h94被r占据,而以下轻链氨基酸残基被维持：l45被r占据,l46被l占据,l105被e占据,l106被i占据。因此，本文提供了人源化抗体，其包含seqidno:1中所示的重链可变区和seqidno:2中所示的轻链可变区，条件是h24被v或a占据,h38被q、r或k占据,h48被m或i占据,h66被r或k占据,h67被v或a占据,h69被l占据,h71被a占据,h73被k或t占据,h93被g或a占据,h94被r占据,而存在以下轻链氨基酸残基：l45被r或k占据,l46被l或r占据,l105被e或v占据,l106被i或m占据。小鼠gpc3-1抗体的人源化形式包含4个示范性人源化重链成熟可变区(ha-hd)和七个示范性人源化轻链成熟可变区(la-le、lb-q、lb-v)。这些链的置换包括hala,halb,halc,hbla,hblb,hblc,hbld,hble,hblb-q,hblb-v,hcla,hclb,hclc,hdla,hdlb和hdlc。在这些置换中优选hble。hble包含seqidno:1所示重链和seqidno:2所示轻链。然而可使用hala,halb,halc,hbla,hblb,hblc,hbld,hble,hblb-q,hblb-v,hcla,hclb,hclc,hdla,hdlb和hdlc任一替代hble。在一些方面，人源化gpc3-1抗体对人gpc3的表观解离常数(kd)优选在0.1nm到10nm范围内，甚至更优选在0.1nm到5nm范围内，甚至优选在1nm到3nm或2nm到约3nm范围内。在一些方面，本发明的抗体的表观解离常数在鼠gpc3-1抗体对人gpc3的表观解离常数的0.1到1.5倍，或甚至0.5到2倍范围内。在一些方面，抗体对人源化gpc3-1的表观解离常数(kd)为约2.7。a.恒定区的选择人源化gpc3-1抗体的重链和轻链可变区可与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择可部分依靠是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性决定。例如，人同种型igg1和igg3具有强烈补体依赖性细胞毒性，人同种型igg2具有弱补体依赖性细胞毒性而人igg4缺乏补体依赖性细胞毒性。人igg1和igg3还比人igg2和igg4诱导更强的细胞介导的效应物功能。轻链恒定区可以是λ或κ。抗体可以表达成包含两根轻链和两根重链的四聚体，或作为单独的重链，轻链，作为fab,fab',f(ab')2和fv,或作为单链抗体，其中重链和轻链下标域通过间隔子连接。人恒定区显示不同个体之间的同种异型变体和同族同种异型变体，即不同个体在一个或多个多态性位置上可以是不同的。同族同种异型(isoallotype)与同种异型不同之处在于识别同族同种异型的血清与一个或多个其他同种型的非多态性区域结合。轻链和/或重链氨基或羧基末端的一个或多个氨基酸，例如重链c端的赖氨酸可在一部分或全部分子中缺失或衍化。在恒定区中可进行取代以减少或增加效应物功能，例如补体介导的细胞毒性或adcc(见例如winter等美国专利号5,624,821；tso等，美国专利号5,834,597；和lazar等,proc.natl.acad.sci.usa103:4005,2006),或延长人中的半衰期(见例如hinton等,j.biol.chem.279:6213,2004)。可修饰恒定区实现药物接头的位点特异性偶联。这些技术包括使用天然存在或工程化的半胱氨酸残基，二硫键桥、聚组氨酸序列，糖基工程化标记和转谷氨酰胺酶识别序列。使用细菌转谷氨酰胺酶的用于位点特异性偶联的取代的例子是n297s或n297q。用工程化半胱氨酸的用于位点特异性偶联的取代的例子是s239c(us20100158909；fc区的编号根据eu编号系统)。在一些方面，额外半胱氨酸残基的存在允许链间二硫键形成。这种链间二硫键形成可导致空间位阻，从而减少fc区-fcγr结合相互作用的亲和力。引入igg恒定区的fc区或附近的半胱氨酸残基也可作为与治疗剂偶联的位点(例如用硫醇特异性试剂，例如药物的马来酰亚胺衍生物偶联细胞毒性药物)。治疗剂的存在可导致空间位阻，从而进一步减少fc区-fcγr结合相互作用的亲和力。还可修饰抗体片段用于药物-接头的位点特异性偶联，见例如kim等,molcancerther2008；7(8)。b.重组抗体的表达可重组表达产生人源化或嵌合gpc3-1抗体。重组多核苷酸构建物通常包括表达控制序列，其与抗体链的编码序列可操作性连接，包括天然结合或异源启动子区域。优选表达控制序列是存在于能转化或转染真核宿主细胞的载体内的真核启动子系统。一旦载体已掺入合适宿主，宿主维持在适合高水平表达核苷酸序列的条件下，收集和纯化交叉反应抗体。哺乳动物细胞是表达编码免疫球蛋白及其片段的核苷酸区段的优选宿主。见winnacker,fromgenestoclones,(vchpublishers,ny,1987)。本领域已开发了许多能分泌完整异源蛋白质的合适宿主细胞系，包括cho细胞系(例如dg44),各种cos细胞系,hela细胞,hek293细胞,l细胞,和非抗体产生骨髓瘤包括sp2/0和ns0。优选细胞是非人的。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起始点，启动子，增强子(queen等,immunol.rev.89:49(1986)),和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点，rna剪切位点，聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自内源基因，巨细胞病毒、sv40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。见co等,j.immunol.148:1149(1992)。一旦表达，可根据本领域标准程序纯化抗体，包括hplc纯化，柱层析，凝胶电泳等(一般见scopes,《蛋白质纯化》(proteinpurification)(springer-verlag,ny,1982))。iii.核酸本发明还提供了编码任何本文所述的人源化重链和轻链的核酸。通常核酸还编码与成熟重链和轻链可变区融合的信号肽。核酸上的编码序列可以与调控序列可操作性连接，以确保编码序列的表达，这些调控序列例如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以分离形式存在或克隆入一个或多个载体。可通过例如固态合成或重叠寡核苷酸pcr合成核酸。编码重链和轻链的核酸可在例如表达载体内连接成一条连续的核酸，或可分离，例如每条克隆入其自己的表达载体中。在一个实施方式中，本公开提供了分离的多核苷酸，其编码抗体重链可变区，包括ha、hb、hc或hd所列氨基酸序列。例如，分离的多核苷酸可编码包含seqidno:1的氨基酸序列的抗体重链可变区。该分离的多核苷酸还可编码人igg重链恒定区。igg恒定区同种型是例如igg1、igg2、igg3或igg4。在一个实施方式中，igg恒定区的同种型是igg1。在另一个实施方式中，编码的igg1恒定区具有根据kabat系统所列的eu编号系统在残基239处有取代，即s239c的氨基酸序列。本公开还提供了表达载体，其包含分离的多核苷酸，该多核苷酸编码抗体重链可变区，包含ha、hb、hc或hd所列的氨基酸序列(例如seqidno:1或其变体)，还提供了包含表达载体的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如cho细胞。在另一个实施方式中，本公开提供了分离的多核苷酸，其编码抗体轻链可变区，包含la,lb,lc,ld,le,lb-q,或lb-v的氨基酸序列。例如，编码包含seqidno:2的氨基酸序列的抗体轻链可变区的分离的多核苷酸。该分离的多核苷酸还可编码人igg轻链恒定区。igg轻链恒定区的同种型是例如κ恒定区。本公开还提供了表达载体，其包含分离的多核苷酸，该多核苷酸编码抗体轻链可变区，包含la、lb、lc、ld、le、lb-q或lb-v所列的氨基酸序列(例如seqidno:2或其变体)，还提供了包含该表达载体的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如cho细胞。在另一个实施方式中，本公开提供了一种或多种分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列seqidno:1的抗体重链可变区，和包含seqidno:2的氨基酸序列的抗体轻链可变区，重链可变区和轻链可变区形成与人gpc3特异性结合的抗体或抗原结合片段。本公开还提供了包含该一种或多种分离的多核苷酸的表达载体，多核苷酸编码包含seqidno:1的氨基酸序列的抗体重链可变区和包含seqidno:2的氨基酸序列的抗体轻链可变区。还提供了包含一种或多种表达载体的宿主细胞。宿主细胞优选是哺乳动物细胞，例如cho细胞。在另一个实施方式中，本公开提供了第一和第二载体，包含多核苷酸，其编码包含seqidno:1的氨基酸序列的抗体重链可变区，和编码包含seqidno:2的氨基酸序列的抗体轻链可变区的多核苷酸，重链可变域和轻链可变域形成与人gpc3特异性结合的抗体或抗原结合片段。提供了包含载体的宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞例如cho细胞。iv.抗体药物偶联物抗gpc3抗体可与细胞毒性部分或细胞抑制部分偶联，形成抗体药物偶联物(adc)。特别适合与抗体偶联的分子是细胞毒性剂(例如化疗剂),前药转化酶，放射性同位素或化合物，或毒素(这些部分统称作治疗剂)。例如，抗gpc3抗体可与细胞毒性剂，例如化疗剂，或毒素(例如细胞抑制或杀细胞剂如相思豆毒素a、蓖麻毒蛋白a、假单胞菌外毒素或白喉毒素)偶联。细胞毒性剂的有用类别的例子包括例如dna小沟结合剂，dna烷基化剂，和微管蛋白打断剂。示范性细胞毒性剂包括例如微管蛋白裂解素，奥瑞他汀，喜树碱，卡奇霉素，多卡霉素，依托泊甙，美登素生物碱(例如dm1，dm2，dm3，dm4)，紫杉烷类，苯二氮杂类(例如吡咯并[1,4]苯二氮杂吲哚基苯二氮杂和恶唑烷酮苯二氮杂)和长春花碱。示范性抗体药物偶联物包括基于微管蛋白裂解素的抗体药物偶联物，意指药物组分是微管蛋白裂解素药物，基于奥瑞他汀的抗体药物偶联物意指药物组分是奥瑞他汀药物，美登素生物碱抗体药物偶联物意指药物组分是美登素生物碱，和苯二氮杂抗体药物偶联物指药物组分是苯二氮杂(例如吡咯并[1,4]苯二氮杂吲哚基苯二氮杂和噁唑烷酮苯二氮杂)。治疗剂与抗体偶联的技术是熟知的。(见例如alley等,currentopinioninchemicalbiology201014:1-9；senter,cancerj.,2008,14(3):154-169.)。治疗剂可以除非从抗体上切下(例如通过水解，通过蛋白水解降解，或通过切割剂)，否则活性减弱的方式偶联。在一些方面，治疗剂通过可切割接头与抗体连接，该接头对表达gpc3的癌细胞的胞内环境敏感，但对胞外环境基本不敏感，从而在偶联物被表达gpc3的癌细胞内化(例如在内体中或例如由于ph敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境中或在)时，从抗体上被切下。在一些方面，治疗剂还与抗体通过不可切割接头连接。发明人意外发现，包含季铵化微管蛋白裂解素药物-接头的靶向gpc3的adc能有效治疗gpc3表达异常，特别是当接头单元包括葡糖苷酸单元时。基于葡糖苷酸的接头是蛋白酶可切割接头例如缬氨酸-瓜氨酸和缬氨酸-丙氨酸的亲水替代物，利用胞内β-葡糖醛酸酶引发药物释放。239位或239/295位或294位的半胱氨酸变体(和双重半胱氨酸变体)也特别适用于偶联疏水药物，例如微管蛋白裂解素m，因为邻近聚糖残基的偶联位点能掩蔽疏水性药物。微管蛋白裂解素和与微管蛋白裂解素结合的葡糖苷酸接头在wo2016040684中进一步详述。在一个实施方式中，靶向gpc的adc在内化后将未修饰的微管蛋白裂解素m释放入细胞。因此，优选的用于本发明的具有季铵化微管蛋白裂解素药物单元的基于葡糖苷酸的药物接头化合物具有以下结构：的盐形式，尤其是药学上可接受的盐，其中a是拉伸单元；r2a是–c(＝o)r2b,其中r2b是甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-丙-1-基、2,2-二甲基-丙-1-基,或乙烯基，或r2a是甲基、乙基、丙基、异丙基、丙-2-烯-1-基或2-甲基-丙-2-烯-1-基，且r7b是–h或–oh。在更优选的实施方式中，季铵化微管蛋白裂解素药物单元涉及微管蛋白裂解素m，也称作(αs,γr)-γ-[[[2-[(1r,3r)-1-(乙酰氧基)-4-甲基-3-[甲基[(2s,3s)-3-甲基-2-[[[(2r)-1-甲基-2-哌啶基]羰基]-氨基]-1-氧代戊基]氨基]戊基]-4-噻唑基]羰基]氨基]-α-甲基-苯戊酸，具有cas号936691-46-2。因此，更优选的具有季铵化微管蛋白裂解素药物单元的基于葡糖苷酸的药物接头化合物具有上述结构，其中r2a是–c(＝o)ch3且r7b是氢。因此，用于本发明的特别优选的基于葡糖苷酸的药物接头化合物如下：的盐形式，特别是药学上可接受的盐，其中标着mdpr部分的氨基氮原子优选质子化，或由酸不稳定性保护基团，例如boc保护。其他特别优选的基于葡糖苷酸的药物接头化合物由乙基或正丙基取代基取代微管缬氨酸n-甲基取代基。其他更优选的实施方式，季铵化微管蛋白裂解素药物单元涉及微管蛋白裂解素m，其中微管缬氨酸部分的o-连接的乙酸酯取代基被o-连接的乙醚取代基取代(即r2a是乙基)。因此，其他用于本发明的特别优选的基于葡糖苷酸的药物接头化合物如下：的盐形式，特别是药学上可接受的盐。基于葡糖苷酸的微管蛋白裂解素药物接头化合物的制备如wo20160404684详述，在此特别引入以供参考。这些制备的例子如下面的反应流程：mdpr(boc)-oh的制备(转化为其活化酯mdpr(boc)-osu和mdpr(boc)-opff)如naturebiotech,2014,32,1059-1062所述，其过程在此特别引入以供参考；并且制备葡糖苷酸中间物，其经溴化以季铵化微管蛋白裂解素m，如molecularcancertherapeutics,2016,15,938-945中所述，其过程在此特别引入以供参考。本发明的抗体药物偶联物具有任一上述基于葡糖苷酸的药物接头化合物结构，其中抗gpc3抗体的239或239/295或294位的半胱氨酸变体残基通过michael加成与化合物的马来酰亚胺部分稠合，从而将该部分转化为琥珀酰亚胺部分，然后在其羰基碳之一处水解。微管蛋白裂解素m及其类似物的代表性抗体药物偶联物，其中微管缬氨酸残基的乙酸酯基团被醚或其他酯基取代，后者具有葡糖苷酸接头，与微管蛋白裂解素mep残基的叔胺氮通过氮原子季铵化连接，其可从上述的药物接头化合物制备，如以下例子：可任选的药学上可接受的盐形式，其中下标p表示药物荷载，通常为1-4，在一些方面为2或4，ab是抗gpc3抗体，s是来自半胱氨酸239或半胱氨酸295的硫原子。抗体或融合蛋白还可通过占据239或295的半胱氨酸与可检测标记物，例如酶，发色团或荧光标记偶联。后面这些adc结构与前者的联系是通过在琥珀酰亚胺部分的羰基之一处水解，在一些实施方式中在拉伸单元a由碱性单元组成时发生。其他示范性靶向gpc3的抗体药物偶联物如下所示：可任选的药学上可接受的盐形式，其中下标p表示药物荷载，通常为1-4，在一些方面为2或4，ab是抗gpc3抗体，s是来自半胱氨酸239或半胱氨酸295的硫原子。除了与药物或标记偶联，抗体还可通过可切割接头连接于抑制或掩蔽结构域，其抑制抗体结合(见例如wo2003/068934,wo2004/009638,wo2009/025846,wo2101/081173和wo2014103973)。可设计接头由对某些组织或病理特异性的酶切割，从而使得抗体能在所需的位置优先活化。掩蔽基团可通过与抗体结合位点直接结合起作用，或间接通过空间位阻起作用。药物荷载–“p”对于上述靶向gpc3的抗体药物偶联物，下标p代表抗体分子的药物荷载(结合于抗体分子的药物分子数)，是整数值。在包含一群抗体药物偶联物分子的组合物中，平均药物荷载(例如群组中每个抗体上的平均药物接头分子数目)是一个重要质量特征，因为其确定了可传递给靶细胞的药物量。平均药物荷载可以是整数或非整数值，但通常是非整数值。最佳平均药物荷载可以根据药物或药物接头组合的性质改变。在一些方面，抗体药物偶联物组合物的异质性将由药物接头分子与抗体分子偶联所使用的偶联技术决定。例如，在一些方面，用于将药物接头分子与抗体分子偶联的偶联技术将获得抗体上的药物接头分子分布和/或抗体分子上的药物接头数目不均匀的抗体药物偶联物组合物(例如，当用非位点特异性技术通过链间二硫键偶联时)。在其他方面，用于偶联药物接头分子的偶联技术将获得配体上药物接头分子分布和/或抗体分子上的药物接头数目基本均匀的抗体药物偶联物组合物(例如，当用位点特异性偶联技术时)。位点特异性和非位点特异性方法都通常会有很低的百分比的未偶联抗体分子。未偶联抗体分子的百分数也包括在平均药物荷载值中。在本发明的优选方面，对于包含一群抗体药物偶联物化合物的组合物，平均药物荷载为约2到14，优选约为2到10。对于本文中的微管蛋白裂解素m抗体药物偶联物例子，特别优选的平均药物荷载是约2。在一些方面，在抗体药物偶联物化合物群体中单个抗体分子上的实际药物荷载是1到4，1到3或1到2，主要药物荷载为2。在优选方面，约2的平均药物荷载是通过位点特异性偶联技术(例如引入抗体的工程化半胱氨酸)实现的。在本发明的一些其他方面，对于包含抗体药物偶联物化合物群体的组合物时，平均药物荷载是约3或约4，抗体药物偶联物化合物群体中单个抗体分子上的实际药物荷载是约1到8。在一些方面，在抗体药物偶联物化合物群体中单个抗体分子上的实际药物荷载是1到10(或6到10或6到8)。例如如果除了链间二硫键，药物接头与引入的半胱氨酸残基(例如根据eu编号系统引入239位的半胱氨酸残基)偶联，可实现较高的药物荷载。v.治疗性应用本文所述的靶向gpc3的抗体药物偶联物可用于治疗gpc3表达异常，例如表达gpc3的癌症。通常这样的癌症显示可在蛋白质(例如通过免疫试验)或rna水平测定的可检测水平的gpc3。一些这样的癌症显示与同一类型的非癌组织，优选来自相同病人的组织相比提高的gpc3水平。可任选的，在进行治疗前测定癌症中的gpc3水平。与gpc3表达相关的癌症例子包括肝细胞癌(hcc)和肺癌(gpc3在约70％的hcc和约20％的肺癌中表达)。其他癌症包括wilms肿瘤(肾母细胞瘤)，卵巢透明细胞癌，结直肠癌和肉瘤等。本发明的方法包括治疗患有表达gpc3的癌症患者，包括对患者给予本发明的抗体药物偶联物。癌症可以是任何表达gpc3的癌症，包括例如hcc，肺癌，wilms肿瘤，卵巢透明细胞癌，结直肠癌或肉瘤。在蛋白质表达增加癌细胞的治疗剂外排后，一些癌细胞产生对治疗剂的抗性。这些蛋白质包括p-糖蛋白，多药物抗性相关蛋白，肺抗性相关蛋白和乳癌抗性蛋白。可由本领域技术人员进行癌细胞中药物抗性的检测。检测外排蛋白的抗体或试验可购自例如promega,millipore,abcam,和sigma-aldrich。用本方法治疗的癌症可以是表达gpc3的多抗性癌。在一些方面，癌症将是多药物抗性gpc3+hcc。针对gpc3的抗体药物偶联物以有效方案给药，意指给药的剂量、途径以及给药频率延迟发作，减少严重性，抑制进一步恶化，和/或缓解至少一种癌症指征或症状。针对gpc3的偶联物的示范性剂量包括从约1.0μg/kg到约10mg/kg,1.0μg/kg到约5mg/kg,1.0μg/kg到约5mg/kg,从约1.0μg/kg到约1.0mg/kg,从约10μg/kg到约3mg/kg,从约10μg/kg到约2mg/kg,从约1.0μg/kg到1.0mg/kg,或从约1.0μg/kg到500.0μg/kg或从约1.0μg/kg到80.0,100.0,或200.0μg/kg。针对gpc3的微管蛋白裂解素m偶联物的示范性剂量通常为约1.0μg/kg到1.0mg/kg,或约1.0μg/kg到500.0μg/kg或约1.0μg/kg到80.0,100.0,或200.0μg/kg,虽然也可考虑其他剂量。给药可通过各种给药途径。在一些实施方式中，偶联物通过胃肠外，例如静脉内，肌肉内或皮下给药。为了给予adc治疗癌症，可通过静脉内或皮下给药递送入全身循环。在具体实施方式中，给药通过静脉内递送。静脉内给药可以是例如通过在例如30-90分钟内输注或通过一次推注。在一些方面，给药通过周围插入中央导管缓慢静脉推注(例如经30-60秒)。给药频率由许多不同因素决定，包括给药手段，靶位点，患者的生理状态，患者是人还是动物，以及其他给予的药物。频率可以是每日、每周、每月、每季度，或根据病人情况的改变或要治疗的癌症的进程改变的不规律间隔。静脉内给药的示范性频率是在连续的治疗期内一周两次到每季度一次，虽然也可以是更高或更低频率。静脉给药的其他示范性频率是在连续治疗过程中每三周一次或在每周一次到每月一次之间，虽然也可以是更高或更低的给药频率。对于皮下给药，示范性给药频率是每日到每月，虽然可以是更高或更低的给药频率。用于胃肠外给药的药物组合物优选是无菌的，基本等渗且在gmp条件下生产。药学组合物可以单位剂型(即单次给药剂量)提供。药学组合物可用一种或多种生理上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂配制。具体的制剂取决于所选的给药途径。为了注射，偶联物可配制在水性溶液中，优选在生理上相容的缓冲液例如hank溶液，ringer溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射位点的不适)。溶液可以包含配制剂，如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是冻干形式，用于在使用前用合适的载剂(例如无菌无热原的水)构建。偶联物在液体制剂中的浓度可宽幅变化。在一些方面，adc的浓度为约0.5mg/ml到约30mg/ml,约0.5mg/ml到约10mg/ml,约1mg/ml到约10mg/ml,约2mg/ml到约10mg/ml,或约2mg/ml到约5mg/ml。用本发明偶联物治疗可与化疗、放射、干细胞治疗、手术、以及其他有效针对所治疗疾病的疗法联合，包括要治疗的具体疾病的标准护理。因此，本发明包括本文所述的治疗疾病和病况的方法，作为单独治疗或与例如治疗这些疾病和/或病况的护理或调查药物标准联合治疗。治疗癌症的方法包括对需要的病人给予有效量的本发明的针对gpc3的抗体药物偶联物与额外的抗癌药或其他治疗癌症的药剂的组合。联合治疗的一些药物包括：索拉非尼,雷戈非尼,尼莫单抗,多柔比星,femox(吉西他滨和奥沙利铂),阿霉素(doxorubin),顺铂,卡铂,多西它赛,吉西他滨,紫杉醇,培美曲塞,长春瑞滨,和丝裂霉素c。在一个实施方式，索拉非尼,雷戈非尼,尼莫单抗,多柔比星,femox(吉西他滨和奥沙利铂),阿霉素(doxorubin),顺铂,卡铂,多西它赛,吉西他滨,紫杉醇,培美曲塞,长春瑞滨,和丝裂霉素c中的一种或多种在联合治疗中与针对gpc3的本发明的adc一起给予。在另一个实施方式，索拉非尼,雷戈非尼,尼莫单抗,多柔比星,femox(吉西他滨和奥沙利铂),阿霉素(doxorubin),顺铂,卡铂,多西它赛,吉西他滨,紫杉醇,培美曲塞,长春瑞滨,和丝裂霉素c中的一种或多种在联合治疗中与本发明的人源化gpc3-1adc一起给予。在另一个实施方式，索拉非尼,雷戈非尼,尼莫单抗,多柔比星,femox(吉西他滨和奥沙利铂),阿霉素(doxorubin),顺铂,卡铂,多西它赛,吉西他滨,紫杉醇,培美曲塞,长春瑞滨,和丝裂霉素c中的一种或多种在联合治疗中与本发明的hgpc3-1ec-sgd-6859一起给予。本发明的任何特征、步骤、元素、实施方式或方面可与任何其他方面联合使用，除非另有说明。虽然出于方便理解的目的，通过阐述和举例的方式详细描述了本发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于所附权利要求书的范围。实施例下面实施例中所述的细胞系维持在美国典型培养物保藏中心(atcc)或德国布伦瑞克的德国微生物菌种保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,braunschweig,germany)(dmsz),或其他已知特别指出的条件的培养物中。方法抗体筛选用跨越氨基酸残基375-563的重组gpc3免疫小鼠，识别前导抗体gpc3-1(见图1)。从产生gpc3抗体的小鼠脾脏和淋巴结收集淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合。在杂交瘤生长培养基中过夜回收融合的细胞。回收后，旋转沉淀细胞，然后铺在半固体培养基上。孵育杂交瘤，挑出产生igg的杂交瘤克隆。筛选来自该杂交瘤品系的抗体作为在gpc3表达细胞系上的adc。来自几个表位类型的抗体显示了adc活性。基于其卓越的adc细胞毒性，以及其具有膜上靠近蛋白酶切割位点，可导致脱落的表位筛选前导抗体。竞争结合实验100,000个gpc3阳性细胞被转移到96孔板中，与3-5nmalexafluor-488标记的mgpc3-1以及递增浓度的(从10pm到2um)未标记的人源化或鼠gpc3-1mab一起冰上孵育1小时。离心细胞，用pbs洗涤3次，重悬浮于125μlpbs+2％fbs溶液中。用流式细胞仪分析荧光，用饱和荧光信号百分数确定标记的gpc3-1mab结合百分数。通过将数据与具有可变斜率的s形剂量-响应曲线拟合，外推ec50。饱和结合实验将100,000个gpc3阳性细胞转移到96孔板中。加入浓度范围为10pm到5μm的alexafluor-488标记的gpc3mab，在冰上孵育细胞30分钟。离心沉淀细胞，用pbs+1％bsa溶液洗涤3次，重悬浮于125μlpbs+2％fbs中。用流式细胞仪分析荧光，用饱和荧光信号百分数确定结合百分数，然后计算表观kd。表面等离子体共振测定的亲和力人gpc3(hgpc3gp3-h5258)购自acrobiosystems，并用piercenhs-lc-lc-生物素以摩尔比1.5:1生物素/蛋白比生物素化。在装有高精确链霉亲和素(sax)生物传感器的octetred384系统(fortebio)上，用gpc3作为探针，使用hgpc3-1ec作为分析物，进行生物层干扰量度法(bli)。测定结合hgpc3的双价结合为2.04e-10m(kdiss2.3e-5/kon1.134e5)，х2＝0.59，r2＝0.9998，结合为600秒，解离为1800秒，对于8个浓度点400,160,64,25.6,10.2,4.1和1.64nm以1:1比例拟合。测定hgpc3-1ec(hble)的结合亲和力(kd)为14nm(图6)。人源化抗体的设计人源化抗体衍生自鼠gpc3-1抗体。制备了4种人源化重链(ha-hd)和7种人源化轻链(la-le)，在不同位置掺入回复突变。在一些情况下，回复突变匹配鼠种系，但其他情况下并不是如此(例如在体细胞突变的情况下)。匹配人源化重链和轻链。序列比对见图2-5和表1-5。在用ha,hb,hc,hd,和la,lb,和lc变体的最初人源化后，产生其他l-链变体以克服cdr-l1(seqidno:13)中发现的可能脱氨基序(“ng”)(表5)。表1：hgpc3-1可变重(vh)链变体中的人源化突变表2：hgpc3-1可变轻(vl)链变体中的人源化突变vl变体kv外显子受体序列供体框架残基受体cdr残基hvlakv2-30/kj2无无hvlbkv2-30/kj2l46无hvlb-qkv2-30/kj2l46无hvlb-vkv2-30/kj2l46无hvlckv2-30/kj2l45,l46,l105,l106无hvldkv2-30/kj2l46l28hvlekv2-30/kj2l46无表3：hgpc3-1重链变体中的特异性框架突变*鼠残基表4：hgpc3-1轻链变体中的特异性框架突变*鼠残基表5：hgpc3-1轻链变体中的特异性cdr-l1脱氨突变抗体药物偶联物的产生抗体药物偶联物如us62/465,129(2017年2月28日提交)和us62/561,151(2017年9月20日)所述制备，使用本文所述的抗gpc3抗体。igg1mab的半胱氨酸突变体的制备一般如us20100158909所述。药物接头sgd-6859与抗-gpc3抗体通过引入抗体igg1链239位的半胱氨酸残基的硫醇基团偶联，平均药物荷载是每个抗体约2个药物。239位有半胱氨酸的抗体命名中带有ec。体外细胞毒性实验抗体药物偶联物(adc)处理前24小时将细胞系铺板。用adc指定剂量处理细胞，37℃孵育96小时。在一些实验中，包括非抗原结合的adc作为阴性对照。用celltiterglo(promega公司,madison,wi)根据厂商说明书测量细胞系的细胞活力。细胞在室温下与celltiterglo试剂一起孵育25分钟，在envision读板仪(perkinelmer,waltham,ma)上测定发光。结果报道为ic50,与载剂处理的细胞相比实现活力半最大减少所需的化合物浓度(对照＝100％)。体内活性研究皮下hcc和肺癌模型对裸鼠皮下接种5x105jhh7或2.5x106hep3b或2.5x106huh7hcc细胞。nsg小鼠皮下接种1x106nci-h661细胞。用卡尺检测肿瘤生长，用公式(0.5x[长度x宽度2])计算平均肿瘤体积。当平均肿瘤体积达到约100cm3时，不处理或用单剂人源化gpc3-1adc腹膜内对小鼠给药。当肿瘤体积达到约400mm3时，对小鼠实施安乐死。所有动物程序遵循动物护理和使用委员会批准的方案，在实验动物护理评估和评估协会核准的设施内进行。sgd-5937或sgd-6859当与s239c或天然半胱氨酸偶联时，马来酰亚胺和微管蛋白裂解素m乙酸盐稳定性的体内评估在scid小鼠中评估作为药物-接头化学函数的药物稳定性，该品系用在异植体模型中。制备人源化igg偶联物，其含有mp葡糖苷酸-微管蛋白裂解素m(sgd-6859)和mdpr葡糖苷酸-微管蛋白裂解素m(sgd-5937)，以4-药物/mab荷载在天然半胱氨酸上，以2-药物/mab荷载在工程化的s239c上。以单剂腹膜内3mg/kg对scid小鼠给予偶联物，然后在给药后4和10日进行肢端放血(terminalbleeds)。将来自每只动物的血样用离心处理成血浆，装入edta包裹的eppendorf管内。用抗人捕获亲和树脂(igselect,gehealthcare)在2-8℃批量纯化血浆3小时。用pbsph7.4(1x)+0.5mnacl洗涤结合样品，用50mm甘氨酸,ph3洗脱。用trisph7.4中和洗脱样品，用pngasef(newenglandbiolabsinc)去糖基化，然后用10mmdtt还原。用反相uplc(plrp8um,agilent，结合质谱检测(watersxevog2-sqtof))分析每个样品。用来自未荷载和药物荷载(乙酰化和去乙酰化)抗体峰的解卷积质量的总离子计数的相对比值计算每个样品的药物-抗体比(dar)。用荷载药物的轻链和重链物质的总离子计数计算完整药物(％乙酰化)，用42道尔顿的损失评估。结果实施例1：人源化mab的设计和测试用highv1-18/highj4或highv1-69-2/highj4重链可变区人种系和higk2-30/higkj2轻链可变区人种系作为人受体序列构建了数种人源化gpc3-1抗体。抗体在要回复突变为小鼠抗体或小鼠种系序列的氨基酸残基选择中有所不同。选择称作hble的抗体(重链可变区如seqidno:1(vhb)所示，轻链可变区如seqidno:2(vle)所示)作为前导人源化gpc3-1抗体，基于：(i)其结合特征(见表6和7)，(ii)其递送药物的能力，和(iii)与其他变体相比回复突变的数目。命名为hala的抗体(具有称作vha的重链可变区和称作vla的轻链可变区的抗体),命名为halb的抗体(具有称作vha的重链可变区和称作vlb的轻链可变区的抗体),命名为halc的抗体(具有称作vha的重链可变区和称作vlc的轻链可变区的抗体),命名为hbla的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vla的轻链可变区的抗体),命名为hblb的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vlb的轻链可变区的抗体),命名为hblc的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vlc的轻链可变区的抗体),命名为hbld的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vld的轻链可变区的抗体),命名为hble的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vle的轻链可变区的抗体),命名为hblb-q的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vlb-q的轻链可变区的抗体),命名为hblb-v的抗体(具有称作vhb的重链可变区和称作vlb-v的轻链可变区的抗体),命名为hcla的抗体(具有称作vhc的重链可变区和称作vla的轻链可变区的抗体),命名为hclb的抗体(具有称作vhc的重链可变区和称作vlb的轻链可变区的抗体),命名为hclc的抗体(具有称作vhc的重链可变区和称作vlc的轻链可变区的抗体),命名为hdla的抗体(具有称作vhd的重链可变区和称作vla的轻链可变区的抗体),命名为hdlb的抗体(具有称作vhd的重链可变区和称作vlb的轻链可变区的抗体)和命名为hdlc的抗体(具有称作vhd的重链可变区和称作vlc的轻链可变区的抗体)可用于本发明代替hble抗体。vha,vhb,vhc,vhd,vla,vlb,vlb-q,vlb-v,vlc,vld,和vle序列见图2-5。表6：hgpc3-1抗体变体的hgpc3结合表7：hgpc3-1脱氨变体的hgpc3结合实施例2：hgpc3-1ecsgd-6859/sgd-6183的体外抗肿瘤活性对一组表达gpc3的hcc细胞系，包括jhh7、huh7和hep3b评估人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1sgd-6183抗体药物偶联物的细胞毒性活性。如图7所示，人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1sgd-6183抗体药物偶联物在所有三种细胞系中都有活性。对一组表达gpc3的肺癌细胞系，包括nci-h661和nci-h446评估人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1sgd-6183抗体药物偶联物的细胞毒性活性。如图8所示，人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1sgd-6183抗体药物偶联物在两种细胞系中都有活性。实施例3：人源化gpc3-1ecsgd-6859或gpc3-1(s239c,q295c)sgd-5937或gpc3-1sgd-6183对hcc肿瘤的体内抗肿瘤活性在三种皮下hcc异植体模型jhh7,huh7和hep3b中测试hgpc3-1ecsgd-6859或hgpc3-1ecsgd-5937或hgpc3-1sgd-6183的活性。对携带已建立(～100mm3)的肿瘤的裸鼠对于jhh7模型施用hgpc3-1ecsgd-5937或hgpc3-1sgd-6183，如图9所示,对于huh7肿瘤模型施用hgpc3-1ecsgd-6859或hgpc3-1sgd-6183，如图10所示,以及对于hep3b肿瘤模型施用hgpc3-1ecsgd-6859或hgpc3-1sgd-6183，如图11所示。用hgpc3-1ecsgd-6859或hgpc3-1ecsgd-5937或hgpc3-1sgd-6183处理与未处理对照相比减少肿瘤生长。在几种小鼠中一次adc给药后获得可持续消退。在一个皮下肺癌异植体模型nci-h661中测试hgpc3-1(s239c,q295c)sgd-5937或hgpc3-1sgd-6183的活性。对携带已建立(～100mm3)肿瘤的nsg小鼠施用hgpc3-1(s239c,q295c)sgd-5937或hgpc3-1sgd-6183，如图12所示。用hgpc3-1(s239c,q295c)sgd-5937或hgpc3-1sgd-6183处理与未处理对照相比减少肿瘤生长。在几种小鼠中一次adc给药后获得可持续消退。数据证明hgpc3-1ecsgd-6859或hgpc3-1ecsgd-5937或hgpc3-1sgd-6183显示在表达gpc3的hcc异植体模型中显著剂量依赖性抗肿瘤活性，hgpc3-1(s239c,q295c)sgd-5937或hgpc3-1sgd-6183在表达gpc3的肺异植体模型中显示显著的剂量依赖性抗肿瘤活性。实施例4：sgd-5937或sgd-6859当与s239c或天然半胱氨酸偶联时，马来酰亚胺和微管蛋白裂解素m乙酸盐稳定性的体内评估微管蛋白裂解素m的脱乙酰化显著减少其效力。制备h00ecsgd-6859或h00ecsgd-5937，作为偶联于s239c的dar2adc。制备h00ecsgd-6859或h00ecsgd-5937，作为偶联于天然半胱氨酸的混和平均dar4adc。scid小鼠腹膜内给予3mg/kg的adc之一。通过plrp-ms在给药后0、4和10天评估马来酰亚胺稳定性和微管蛋白裂解素m乙酸盐稳定性。与天然半胱氨酸偶联的sgd-6859和sgd-5937在与s239c偶联比较时都显示了提高了马来酰亚胺和微管蛋白裂解素m不稳定性(图13)。数据显示，与s239c的偶联导致更稳定的dar，并且保护对效力关键性的微管蛋白裂解素m乙酸盐。序列表<110>西雅图基因公司（seattlegenetics,inc.）<120>磷脂酰肌醇聚糖3抗体及其偶联物<130>4700-00111pc<150>us62/631,353<151>2018-02-15<160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>115<212>prt<213>人工序列<220><223>hb重链可变区<400>1gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015thrvallysilesercyslysvalserglytyrthrphethrasptyr202530glumethistrpvalglnglnalaproglylysglyleuglutrpmet354045glyglyileaspprogluthrglyglythralatyrasnglnlysphe505560lysglyargvalthrleuthralaasplysserthraspthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095glyargtyrtyrserphealatyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valserser115<210>2<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>le轻链可变区<400>2aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugly151015glnproalaserilesercysargserserglnserilevalhisser202530asnalaasnthrtyrleuglntrppheglnglnargproglyglnser354045proargleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcyspheglnval859095serhisvalprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105110<210>3<211>445<212>prt<213>人工序列<220><223>具有突变igg1的hb重链<400>3gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015thrvallysilesercyslysvalserglytyrthrphethrasptyr202530glumethistrpvalglnglnalaproglylysglyleuglutrpmet354045glyglyileaspprogluthrglyglythralatyrasnglnlysphe505560lysglyargvalthrleuthralaasplysserthraspthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095glyargtyrtyrserphealatyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valserseralaserthrlysglyproservalpheproleualapro115120125serserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuval130135140lysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyala145150155160leuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnsersergly165170175leutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleugly180185190thrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlys195200205valasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcys210215220proprocysproalaprogluleuleuglyglyprocysvalpheleu225230235240pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu245250255valthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallys260265270pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys275280285proargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleu290295300thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys305310315320valserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlys325330335alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser340345350argaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys355360365glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln370375380progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly385390395400serphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpgln405410415glnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn420425430histyrthrglnlysserleuserleuserproglylys435440445<210>4<211>219<212>prt<213>人工序列<220><223>le的轻链<400>4aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugly151015glnproalaserilesercysargserserglnserilevalhisser202530asnalaasnthrtyrleuglntrppheglnglnargproglyglnser354045proargleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcyspheglnval859095serhisvalprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105110argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu115120125glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe130135140tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln145150155160serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser165170175thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu180185190lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser195200205provalthrlysserpheasnargglyglucys210215<210>5<211>330<212>prt<213>人工序列<220><223>突变重链恒定区<400>5alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys151015serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr202530pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser354045glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser505560leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr65707580tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys859095lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys100105110proalaprogluleuleuglyglyprocysvalpheleuphepropro115120125lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys130135140valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp145150155160tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu165170175gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu180185190hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn195200205lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly210215220glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspglu225230235240leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr245250255proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn260265270asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe275280285leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn290295300valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr305310315320glnlysserleuserleuserproglylys325330<210>6<211>330<212>prt<213>人工序列<220><223>天然存在的重链恒定区<400>6alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys151015serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr202530pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser354045glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser505560leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr65707580tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys859095lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys100105110proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro115120125lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys130135140valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp145150155160tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu165170175gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu180185190hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn195200205lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly210215220glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspglu225230235240leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr245250255proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn260265270asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe275280285leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn290295300valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr305310315320glnlysserleuserleuserproglylys325330<210>7<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链恒定区<400>7argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu151015glnleulysserglythrala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