用于逆转细胞老化的瞬时细胞重编程的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年3月13日提交的第62/642538号美国临时专利申请的优先权，该临时专利申请通过引用以其整体并出于所有目的并入本文。

关于在联邦政府资助的研究和开发下的公开的权利声明

此公开是以授权号r01ar070865和r01ar070864(美国国立卫生研究院(nih/niams))、授权号p01ag036695、r01ag23806(r37merit奖)、r01ag057433和r01ag047820(美国国立卫生研究院(nih))、美国退伍军人事务部(blr&d和rr&d成果审评)以及calpoly资助奖#tb1-01175，在政府支持下开发的。政府拥有本公开的一定权益。

背景技术：

老化的特征在于分子、细胞、组织和生物体水平上逐渐发生的功能丧失。在染色质水平上，老化与表观遗传错误的逐步积累相关，所述表观遗传错误最终导致异常基因调节、干细胞衰竭、衰老以及细胞/组织稳态失调。通过少量转录因子的过表达将核重编程成为多能性的技术，可以通过驱动表观遗传重编程将任何细胞的年龄和身份恢复为胚胎细胞的年龄和身份。由于对细胞身份的不良擦除所产生的对组织和器官的结构、功能和细胞类型分布的破坏，因此对细胞身份的不良擦除对于更生(rejuvenative)疗法的开发是有问题的。

发明简述

鉴于前述内容，需要一种避免去分化和细胞身份(cellidentity)丧失的使细胞更生(rejuvenatingcells)的改进方法。本公开解决了该需求，并且还提供了额外的益处。

本公开总体上涉及细胞更生、组织工程化和再生医学。确切地说，本公开涉及通过瞬时暴露于编码重编程因子的非整合型(non-integrated)mrna中而使老化细胞和组织更生以恢复功能性的组合物和方法，所述重编程因子使细胞更生，同时使得细胞保持在已分化状态。

本公开涉及利用更生的细胞的基于细胞的疗法。确切地说，本公开涉及通过瞬时暴露于编码重编程因子的非整合型mrna中而使老化细胞和组织更生以恢复功能性的方法，所述重编程因子使细胞更生，同时使得细胞保持在已分化状态。

在一个方面中，本文提供了使细胞更生的方法，所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染细胞不超过五(5)个连续日，从而产生更生的细胞。

在一个方面中，本文提供了用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症、神经变性病症和/或肌肉骨骼功能障碍的方法。所述方法包括施用治疗有效量的细胞，所述细胞包括编码了一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna。

在一个方面中，本文提供了用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症、神经变性病症和/或患有肌肉骨骼功能障碍的对象的方法。所述方法包括施用治疗有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna。

在一个方面中，本文提供离体使工程化的组织更生的方法。所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染所述组织不超过五(5)个连续日，从而产生更生的工程化组织。

在一个方面中，本文提供了一种药物组合物，包括通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染细胞不超过五(5)个连续日而获得的更生的细胞。

因此，在一个方面中，本公开包括一种使细胞更生的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染细胞，其中所述转染以每天一次执行至少两天且不超过4天；以及b)翻译一种或多种非整合型信使rna，以在细胞中产生一种或多种细胞重编程因子，导致细胞的瞬时重编程，其中所述细胞被更生而没有去分化为干细胞。所述方法可以在体外、离体或体内对细胞进行。

在某些实施方案中，用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna的转染以每天一次进行2天、3天或4天。

在某些实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

所述方法可以对任何类型的细胞进行。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞(例如人、非人灵长类、啮齿动物、猫、狗、牛、马、猪、山羊等)。例如，所述方法可以在成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞或骨骼肌干细胞上进行。在另一个实施方案中，所述细胞来自老年对象。

在某些实施方案中，所述瞬时重编程致使hp1γ、h3k9me3、层支持蛋白(laminasupportprotein)lap2α和sirt1的表达增加，gmscf、il18和tnfα的表达减少，核折叠减少，出泡减少，细胞自噬体形成增加，糜蛋白酶样蛋白酶体活性升高，线粒体膜电位提高或反应性氧簇(ros)减少。

在某些实施方案中，所述细胞在组织或器官内。根据本文所述的方法，瞬时重编程可以恢复组织或器官中的细胞的功能、提高组织或器官中的细胞的潜能(potency)、减少组织或器官内的衰老细胞的数量、增强组织或器官内的细胞的复制能力，或延长组织或器官内细胞的寿命。

在另一个方面中，本公开包括一种治疗对象的与年龄相关的疾病或病况的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染所述对象的细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述对象中的细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，导致所述细胞的瞬时重编程，其中所述细胞被更生而没有去分化为干细胞。所述细胞可以离体或在体内被转染。

在某些实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

在某些实施方案中，所述与年龄有关的疾病或病况是变性疾病、神经变性疾病、心血管疾病、外周血管疾病、皮肤疾病、眼部疾病、自身免疫疾病、内分泌失调、代谢失调、肌肉骨胳病症、消化系统疾病或呼吸系统疾病。

在另一个实施方案中，本公开包括一种治疗对象的涉及软骨变性的疾病或病况的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染所述对象的软骨细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述软骨细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，导致所述软骨细胞的瞬时重编程，其中所述软骨细胞被更生而没有去分化为干细胞。更生的软骨细胞可以被移植到例如对象的关节炎关节中。

所述方法可以离体、在体外或体内进行。在一个实施方案中，软骨细胞从得自对象的软骨样品中被分离，并被离体转染，然后被移植到对象中。

在某些实施方案中，涉及软骨变性的疾病或病况是关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)。

在某些实施方案中，治疗减轻对象中的炎症。

在某些实施方案中，治疗降低软骨细胞对rankl、inos、il6、il8、bdnf、ifnα、ifnγ和lif的表达，并增加软骨细胞对col2a1的表达。

在另一个方面中，本公开包括一种在对象中治疗涉及肌肉变性的疾病或病况的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染所述对象的骨骼肌干细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述骨骼肌干细胞中表达一种或多种细胞重编程因子，导致所述骨骼肌干细胞的瞬时重编程，其中所述骨骼肌干细胞被更生而不丧失其分化为肌肉细胞的能力。

所述方法可以离体、在体外或体内进行。在一个实施方案中，骨骼肌干细胞从得自对象的肌肉组织样品中被分离，并被离体转染，然后被移植到对象中需要修复或再生的肌肉中。

在一些实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

在一些实施方案中，治疗恢复骨骼肌干细胞的潜能。在一些实施方案中，治疗致使肌纤维再生。

本公开的方法可以对任何对象进行。在某些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人、非人灵长类、啮齿动物、猫、狗、牛、马、猪或山羊。在一些实施方案中，所述对象是老龄的。

鉴于本文的公开内容，本领域技术人员将容易想到本公开的这些和其他实施方案。

附图简述

图1a-1l示出，瞬时重编程将成纤维细胞中的老化生理性质恢复为更年轻的状态。图1a示出证明效果(ros)随处理持续时间的变化的代表性图：两天的瞬时重编程与四天相对比，这两者均有之后两天的放松期。所有箱形图和条形图都是在合并生物学和技术上的重复的所有单个细胞数据之后生成的，以方便查看。所示出的显著性水平允许对于患者之间的差异的一个成对比较的宽限。图1b示出使用免疫细胞化学对异染色质标志物h3k9me3和hp1γ的单细胞水平的定量。图1c示出使用免疫细胞化学对单个细胞中核层支持多肽lap2α的存在以及每个群体中异常核(皱折或出泡)的百分比的定量。图1d示出活细胞成像的结果，其具有在单个细胞中自噬体形成过程中裂解的带有荧光标签的底物，以及总群体中的糜蛋白酶样20s蛋白水解活性。图1e示出用线粒体特异性染料定量的单个细胞线粒体膜电位和ros水平。图1f示出sirt1免疫染色的单细胞定量。图1g示出单细胞上的端粒定量荧光原位杂交(qfish)的结果。图1h示出对于衰老人群的saβgal染色的结果。图1i示出使用用于多重细胞计数的分析物抗体偶联小珠的底板对炎性细胞因子谱的定量。图1j示出显示对于较长放松期(4天瞬时重编程后的4天和6天)保持年轻化转变的代表性图。然后，对每个队列中的细胞进行80个碱基对配对的末端读取rna测序，以得出针对每个组(年轻的、老化的和已处理的–r4x2)的转录组谱。图1k示出由老化特征定义的子空间中的主组分分析。图1l示出年轻的和老化的(x轴)与已处理的和老化的(y轴)之间的对数倍数变化比较。暗灰色点是所有老化特征的基因，而浅灰色点是也与处理特征重叠的基因，已处理的和老化的之间显著不同。大多数基因位于y＝x线，这表明通过处理的变化的量级与年轻的和老化的之间的差异的量级紧密匹配。通过学生t检验(student'st-test)，在已处理的和老化的之间以成对方式，以及在与年轻患者比较时以成组方式来计算显著性。p值：*<.05、**<.01、***<.001，星号的颜色与被比较的群体匹配。

图2a-2k示出，瞬时重编程将内皮细胞中的老化生理性质恢复为更年轻的状态。图2a示出证明效果(ros)随处理持续时间的变化的代表性图：两天的瞬时重编程与四天相对比，这两者均有之后两天的放松期。所有箱形图和条形图都是在合并生物学和技术上的重复的所有单个细胞的数据之后生成的，以方便查看。所示出的显著性水平允许对于患者之间的差异的一个成对比较的宽限。图2b示出使用免疫细胞化学对异染色质标志物h3k9me3和hp1γ的单细胞水平的定量。图2c示出使用免疫细胞化学对单个细胞中核层支持多肽lap2α的存在以及每个群体中异常核(皱折或出泡)的百分比的定量。图2d示出活细胞成像的结果，其具有在单个细胞中自噬体形成过程中裂解的带有荧光标签的底物，以及总群体中的糜蛋白酶样20s蛋白水解活性。图2e示出用线粒体特异性染料定量的单个细胞线粒体膜电位和ros水平。图2f示出sirt1免疫染色的单细胞定量。图2g示出单细胞上的端粒定量荧光原位杂交(qfish)的结果。图2h示出对于衰老人群的saβgal染色的结果。图2i示出显示对于较长放松期(4天瞬时重编程后的4天和6天)保持年轻化转变的代表性图。然后，对每个队列中的细胞进行80个碱基对配对的末端读取rna测序，以得出针对每个组(年轻的、老化的和已处理的–r4x2)的转录组谱。图2j示出由老化特征定义的子空间中的主组分分析。图2k示出年轻的和老化的(x轴)与已处理的和老化的(y轴)之间的对数倍数变化比较。暗灰色点是所有老化特征的基因，而浅灰色点是也与处理特征重叠的基因，已处理的和老化的之间显著不同。大多数基因位于y＝x线，这表明通过处理的变化的量级与年轻的和老化的之间的差异的量级紧密匹配。通过学生t检验，在已处理的和老化的之间以成对方式，以及在与年轻患者比较时以成组方式来计算显著性。p值：*<.05、**<.01、***<.001，星号的颜色与被比较的群体匹配。

图3a-3i示出，瞬时重编程减轻患病软骨细胞中的骨关节炎表型：所有箱形图和条形图都均合并生物学和技术上的重复，以方便查看。所示出的显著性水平允许对于患者之间的差异的一个成对比较的宽限。处理的是指优化的三天重编程和两天放松。图3a示出细胞存活能力染色的群体结果。图3b示出合成代谢因子col2a1的rna水平的qrt-pcr评估。图3c示出每个队列中atp浓度的定量。图3d示出抗氧化剂sod2的rna水平的qrt-pcr评估，注意年轻水平低于oa，因为sod2升高仅在存在ros时，即oa状态时才是有益的(图3e)。图3f和3g示出分解代谢因子mmp13(图3f)和mmp3(图3g)的rna水平的qrt-pcr评估。图3h和3i示出使用用于多重细胞计数的分析物抗体偶联小珠的底板对促炎因子rankl(图3h)和inos(图3i)谱的rna水平的rt-pcr评估。用学生t检验，在已处理的和老化的之间以成对方式，以及在与年轻患者比较时以成组方式来计算显著性。p值：*<.05、**<.01、***<.001。

图4a-4g示出，瞬时重编程恢复老化肌肉干细胞的潜能。图4a示出从静止状态测量musc激活。将新鲜分离的老化musc与在处理两天和放松一或两天后固定的edu一起孵育。所有箱形图和条形图都合并生物学和技术上的重复，以方便查看。所示出的显著性水平允许对于患者之间的差异的一个成对比较的宽限。图4b示出生物发光的量化结果，其是在移植和损伤后的不同时间点在将已处理的/未处理的+莹光素酶小鼠musc移植到ta肌肉中后11天从小鼠测量的。图4c示出在图4b中成像和定量的小鼠的ta肌肉横截面中gfp表达的免疫荧光染色的定量。图4d示出移植的musc的接受者的ta肌肉中来自供体的gfp+纤维的横截面积的定量。图4e示出在移植后60天后再次损伤(第二次损伤)的ta肌肉的生物发光成像的结果。进行第二次损伤以测试生物发光信号是否由于激活和扩张最初被移植并已植入基底层下的莹光素酶+/gfp+musc而增加。图4f示出生物发光的量化结果，其是在将已处理的莹光素酶+人musc移植到ta肌肉中后11天从小鼠测量的。图4g示出从不同年龄组的健康供体获得的已处理和未处理的musc之间生物发光比例的变化。通过学生t检验，在已处理的和老化的之间以成对方式，以及在与年轻患者进行比较时以成组方式来计算显著性。p值：*<.05、**<.01、***<.001，星号的颜色与被比较的群体匹配。

图5a-5j示出瞬时重编程将从人成纤维细胞和内皮细胞中的老化生理性质恢复为更年轻的状态。成纤维细胞和内皮细胞得自其他健康的年轻个体和老化个体。图5a示出对于h3k9me3的表观遗传标志物和核标志物分布。图5b示出对于hp1γ的表观遗传标志物和核标志物分布。图5c示出对于lap2α的表观遗传标志物和核标志物分布。图5d示出对于sirt1的营养素和能量调节的分布。图5e示出对于线粒体膜电位的营养素和能量调节的分布。图5f示出对于线粒体ros的营养素和能量调节的分布。图5g示出自噬体中的分布以及大块废物的清除和衰老。图5h示出对于年轻细胞、老化细胞和已处理细胞的蛋白酶体活性。图5i示出年轻细胞、老化细胞和已处理细胞的衰老活性。图5j示出年轻细胞、老化细胞和已处理细胞中的分泌的细胞因子。

图6a-6i示出老化成纤维细胞和内皮细胞的转录组和甲基化组分析。图6a示出对于成纤维细胞的年轻转录组谱相对于老化转录组谱。数据显示，成纤维细胞中的961个基因(5.85％)(678个上调的，289个下调的)在年轻细胞和老化细胞之间有所不同，其显著性标准为p<.05和对数倍数变化截止值为+/-0.5。图6b示出对于成纤维细胞的pca分析。图6c示出对于成纤维细胞的表达分析。图6d示出对于内皮细胞的年轻谱相对于老化谱。数据显示，内皮细胞中的748个基因(4.80％)(389个上调的，377个下调的)在年轻细胞和老化细胞之间有所不同，其显著性标准为p<.05和对数倍数变化截止值为+/-0.5。图6e示出对于内皮细胞的pca分析。图6f示出对于内皮细胞的表达分析。图6g是在处理之前和之后由horvathclock评估的对于成纤维细胞的甲基化年龄的图，并且数据显示总体减少趋势。图6h是通过horvathclock在处理之前和之后评估的内皮细胞的甲基化年龄的图，并且数据显示了总体减少趋势。图6i是示出按处理状态、按性别、按患者和按细胞类型分开的在甲基化模式中的无监督聚类的树状图。聚类证明至少在比较成纤维细胞和内皮细胞时，细胞身份的共同保留。

图7a-7m示出在骨关节炎软骨细胞和间充质干细胞中的瞬时重编程。图7a-i是示出瞬时重编程减轻患病软骨细胞中炎性表型的数据。软骨细胞是从软骨活检中得自老化的诊断有晚期骨关节炎(oa)患者。评估了老化oa细胞和瞬时重编程的oa细胞的oa特异性表型。所有箱形图和条形图都结合了生物学和技术上的重复，以方便查看。通过第二个最严格的p值确立总显著性排名。用学生t检验计算出显著性，p值：*<.05、**<.01、***<.001。误差线显示rmse(均方根误差)。图7a示出通过使用基于甘油的荧光团测量atp浓度，在软骨细胞中处理后atp水平的升高。图7b示出通过细胞摄取超氧化物触发的荧光染料后的活单细胞成像而得的ros活性在处理后呈现信号减弱。图7c示出抗氧化剂sod2的rna水平的qrt-pcr评估的结果，其随着处理而升高。图7d示出在年轻的、老化的和老化的已处理的软骨细胞中的细胞增殖，其中老化的已处理的细胞向接近年轻细胞的水平转变。图7e示出来自qrt-pcr的数据，其反映了年轻的、老化的和老化的处理的软骨细胞中细胞外基质蛋白组分col2a1的rna水平的升高，其中老化的已处理的细胞向接近年轻细胞的水平转变。图7f是示出在处理后保留软骨形成身份和功能转录因子sox9的qrt-pcr水平的数据。图7g汇总rt-pcr评估，其示出处理降低了nf-κb配体rankl的细胞内rna水平。图7h汇总rt-pcr评估，其示出用于产生一氧化氮作为应答并传播炎性刺激的inos的处理水平下降，其转变为更接近年轻软骨细胞的水平。图7i是反映软骨细胞分泌的细胞因子谱的数据，其示出促炎细胞因子的增加随着处理而减少。图7j是示出在间充质干细胞中逐个患者的分布随处理向降低的p16水平转移的图。图7k是示出在间充质干细胞中逐个患者的分布随处理向降低的p21水平转移的图。图7l示出与老化的和已处理的间充质干细胞中细胞增殖的增加相对应的倍数变化。图7m示出与细胞衰老的减少相对应的衰老老化的和已处理的间充质干细胞的百分比。

图8a-8j示出了工程化皮肤组织的瞬时重编程的效果。图8a-8c示出对于成纤维细胞和角质化细胞的皮肤衰老参数。图8a示出结合针对形态学、结构和组织的度量的组织学评分，其显示通过mrna处理而不是通常市售的皮肤处理(视黄酸)的改善。图8b示出通过mrna处理的衰老参数的减少在图8b(saβgal)和图8c中的左图(p16)示出，并且炎性参数在图8c中的中间图(il-8)和图8c中的右图(mmp-1)中示出，并进一步与视黄酸的效果进行了比较。图8d-8j示出卫星细胞中的肌肉再生。图8d示出将已处理的莹光素酶⁺人musc移植到ta肌肉中后11天从小鼠测量的生物发光的定量结果。图8e示出10-30天龄、30-55天龄和60-80天龄队列的生物发光。从不同年龄组的健康供体获得的已处理和未处理的musc之间生物发光比例的变化。用学生t检验在已处理的和老化的之间以成对方式，以及在与年轻患者进行比较时以成组方式来计算显著性(年龄组10-30:n＝5；30-55:n＝7；60-80:n＝5)。p值：*<.05、**<.01、***<.001，星号的颜色与被比较的群体匹配。图8f示出损伤的并用老化的musc移植的老化肌肉的强直性力测量。解剖ta肌肉并离体进行电生理用于强直性测量。未移植的肌肉的力量产生的基准在年轻的(4个月，蓝色虚线)和老化的(27个月，红色虚线)小鼠中被测量。将已处理的老化的musc移植到老化的小鼠的ta肌肉中，并在30天后测量力量产生(n＝5)。图8g示出在移植和损伤后在不同时间点，已处理的、老化的和年轻的细胞中生物发光的定量结果(n＝10)。图8h示出在移植有老化的已处理的细胞和老化的未处理的细胞的小鼠的ta肌肉横截面上的免疫荧光染色的定量(n＝5)。图8i示出移植的musc的接受者的ta肌肉中来自供体的gfp+纤维的横截面积的定量(n＝5)。图8j示出在musc移植后60天后再次损伤(第二次损伤)的ta肌肉的生物发光成像的结果(n＝6)。进行第二次损伤以测试生物发光信号是否由于激活和扩张最初被移植并已植入基底层下的莹光素酶⁺/gfp⁺musc而增加。

图9a-9d示出用瞬时重编程的细胞对角膜上皮细胞的转染。图9a示出依据通过对在老化细胞相对于已处理细胞中p16的表达的测量而得的衰老的减少。图9b示出依据通过对在老化细胞相对于已处理的细胞中p21的表达的测量而得的衰老的减少。图9c示出老化细胞相对于已处理细胞中炎性因子il8的减少。图9d示出依据通过对pgc1α表达的测量而得的线粒体生物发生的增加。

图10是示出使用rnaeq分析，已处理细胞与老化细胞之间的细胞特异性标志物变化的p值的图。在8种成纤维细胞和50种内皮细胞标记物中，没有一种随着处理其各自的细胞类型时呈现出显著变化，表明保留了细胞身份。

图11示出老化的标志，其使用一组11种已建立的测定法而被分析。

发明详述

除非另有说明，本文所述技术的实践将采用所属领域技术范围内的医学、细胞生物学、药理学、化学、生物化学、分子生物学和重组dna技术以及免疫学的常规方法。文献中对这些技术充分解释。参见，例如，g.vunjak-novakovicandr.i.freshneycultureofcellsfortissueengineering(wiley-liss,1stedition,2006)；arthritisresearch:methodsandprotocols,vols.1and2:(methodsinmolecularmedicine,copeed.,humanapress,2007)；cartilageandosteoarthritis(methodsinmolecularmedicine,m.sabatinip.pastoureau,andf.deceuninckeds.,humanapress；2004)；handbookofexperimentalimmunology,vols.i-iv(d.m.weirandc.c.blackwelleds.,blackwellscientificpublications)；a.l.lehninger,biochemistry(worthpublishers,inc.,currentaddition)；以及sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(3rdedition,2001)。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上述的还是下述的，均以其全文通过引用并入本文中。

i.定义

在描述本公开时，将采用以下术语，并且意图如下所示而定义。

必须注意的是，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”均包括复数对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，所提及的“一个细胞”包括两个或更多个细胞的混合物，等等。

在整个说明书中，例如提及的“一个实施方案”、“一实施方案”、“另一实施方案”，“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“额外的实施方案”或“进一步实施方案”或其组合表示结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各个地方出现的前述短语不一定都指的是同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式来组合特定特征、结构或特性。

如本文所用，术语“约”是指包括指定值的值的范围，所属领域中的普通技术人员会认为其合理地类似于指定值。在实施方案中，术语“约”是指使用所属领域通常可接受的测量在标准差内。在实施方案中，约是指扩展到指定值的+/-10％的范围。在实施方案中，约是指指定值。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的步骤或要素或者一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或者一组步骤或要素。“由……组成”是指包括且限于短语“由……组成”之后的内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是所需的或强制性的，并且不可能存在其他要素。“基本上由……组成”是指包括在短语之后列出的任何要素，并且限于针对所列要素不干扰或不影响本公开中所规定的活性或功能的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是所需的或强制性的，但是没有其他要素是可选的，并且可能存在或者可能不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或功能。

如本文所用，术语“生物相容性”通常是指通常对接受者无毒并且不对对象造成任何重大不利影响的材料及其任何代谢产物或降解产物。

本文所用的术语“细胞”是指天然存在的或经修饰的完整活细胞。细胞可以从其他细胞分离，在培养物中或组织(部分或完整)或生物体内与其他细胞混合。本文所述的方法可以例如在包括单个细胞、细胞群体或包括细胞的组织或器官的样品上进行。

本文所用的涉及信使rna(mrna)的术语“非整合型的”是指未在染色体内或在染色体外整合到宿主基因组中也未整合到载体中的mrna分子。

本文所用的术语“转染”是指细胞对外源dna或rna的摄取。当将外源dna或rna引入细胞膜内部时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是所属领域中公知的。参见，例如，grahametal.(1973)virology,52:456,sambrooketal.(2001)molecularcloning,alaboratorymanual,3^rdedition,coldspringharborlaboratories,newyork,davisetal.(1995)basicmethodsinmolecularbiology,2^ndedition,mcgraw-hill,以及chuetal.(1981)gene13:197。此类技术可被用于将一个或多个外源dna或rna分子引入细胞中。所述术语是指dna或rna分子的稳定且瞬时的摄取。例如，转染可被用于将编码细胞重编程因子的mrna瞬时摄取到需要更生的细胞中。

本文所用的术语“瞬时重编程”是指将细胞暴露于细胞重编程因子足够的时间段以使细胞更生(即消除所有或某些老化标志)，但所述时间段不足以长到引起去分化为干细胞。所述瞬时重编程产生保留其身份(即，分化的细胞类型)的更生的细胞。

本文所用的术语“更生的细胞”是指这样的老化细胞，其已经用一种或多种细胞重编程因子处理或瞬时重编程，使得所述细胞具有较年轻细胞的转录组谱，同时仍保留一个或多个细胞身份标志物。

本文所用的术语“哺乳动物细胞”是指源自哺乳动物对象的适合移植到相同或不同对象中的任何细胞。所述细胞可以是异种的(xenogeneic)、自体的(autologous)或同种异体的(allogeneic)。所述细胞可以是直接从哺乳动物对象获得的原代细胞。所述细胞也可以是源自将从对象获得的细胞培养和扩增的细胞。在一些实施方案中，细胞已被基因工程化以表达重组蛋白和/或核酸。

本文所用的术语“干细胞”是指保留通过有丝分裂细胞分裂来更新自身的能力并且可以分化成各种专门细胞类型的细胞。哺乳动物干细胞可分为三大类：源自胚泡的胚胎干细胞、存在于成人组织中的成年干细胞以及存在于脐带中的脐带血干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可以分化为所有专门的胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞通过补充专门的细胞来充当人体的修复系统。全能干细胞是卵和精细胞融合产生的。受精卵前几个分裂产生的细胞也是全能性的。这些细胞可以分化为胚胎和胚外细胞类型。多能干细胞是全能细胞的后代，且可以分化为源自三个胚层中任何一层的细胞。多能干细胞只能产生密切相关的细胞家族的细胞(例如，造血干细胞分化为红细胞、白细胞、血小板等)。单能细胞只能产生一种细胞类型，但具有自我更新的特性，这使它们与非干细胞有所区别。诱导的多能干细胞是已经被重编程为胚胎样多能状态的一类衍生自成年细胞的多能干细胞。诱导的多能干细胞可衍生自例如成年体细胞，例如皮肤或血细胞。

本文所用的术语“转录组谱”是指一个细胞或细胞群体中所有rna分子的集合。这有时用来指所有rna或仅指mrna，取决于特定的实验。它与外显子组的不同之处在于，它仅包括在特定细胞群中存在的那些rna分子，并且除了分子身份外，通常还包括每个rna分子的量或浓度。获得转录组谱的方法包括dna微阵列和下一代测序技术，例如rna-seq。转录也可以通过单细胞转录组学在单个细胞水平上被研究。推断转录组序列的方法一般有两种。一种方法是将序列读取作图到参考基因组上，所述参考基因组可以是生物体本身的(正在研究其转录组)或是密切相关的物种的。另一种方法是从头转录组组装，其使用软件直接从短序列读取中推断出转录本。

本文所用的术语“均方根误差”或”rmse”是指残差的标准差(预测误差)。残差是离回归线数据点有多远的度量。rmse是这些残差如何分布的度量。换句话说，它指示数据集中在最适合的线周围的程度。

本文所用的术语“细胞存活能力”是指基于总细胞样品的存活或死亡的细胞数目的度量。本文所定义的高细胞存活能力是指所有细胞中85％以上，优选90-95％以上的细胞是可存活的细胞群体，并且更优选地，以含有99％以上可存活细胞的高细胞存活能力为特征的群体。

本文所用的术语“自噬体”是指具有双层膜的球形结构。它是大自噬的关键结构，所述大自噬是细胞质内容物(例如异常的细胞内蛋白质、过量或受损的细胞器)以及还有入侵微生物的细胞内降解系统。形成后，自噬体将细胞质组分递送至溶酶体。自噬体的外膜与溶酶体融合形成自溶酶体。溶酶体的水解酶降解自噬体递送的内容物及其内膜。

本文所用的术语“蛋白酶体活性”是指蛋白酶体(一种蛋白质复合物)通过蛋白水解(一种破坏肽键的化学反应)来降解不需要或受损的蛋白质。术语“糜蛋白酶样蛋白酶体活性”是指蛋白酶体的独特催化活性。

本文所用的术语“线粒体膜电位”是指由与krebs循环的活性相关的氧化还原转化产生的电位和质子梯度，并且用作用来制备atp的能量储备的中间形式。它是由质子泵产生的，并且是氧化磷酸化过程中能量储备的重要过程。通过选择性消除功能异常的线粒体，它在线粒体内稳态中起关键作用。

本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂或载体”是指可以任选地包含在本公开的组合物中并且不对患者造成明显不利毒理学作用的赋形剂。

本文所用的术语“活性氧簇”或”ros”是含氧的化学反应性化学物质。实例包括过氧化物、超氧化物、羟基、单线态氧和α-氧。在生物学背景中，ros是作为正常氧代谢的天然副产物而形成并且在细胞信号传导和内稳态中起重要作用。

本文所用的术语“与衰老相关的分泌表型”或”sasp”是指多种作为衰老细胞的典型特点的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶的阵列。衰老细胞是稳定的、不分裂的细胞，其仍具有代谢活性并表现出各种基因的上调，包括编码分泌蛋白(例如炎性细胞因子、趋化因子、细胞外基质重塑因子和生长因子)的基因。这些分泌的蛋白质在组织微环境中具有生理功能，在其中它们可以传播应激反应并与邻近细胞交流。所述表型称为衰老相关分泌表型(sasp)，其揭示衰老细胞的旁分泌功能，并且是将衰老细胞与非衰老、细胞周期停滞的细胞(例如静态细胞和终末分化的细胞)区分开来的重要特征。“sasp细胞因子”具体是指由衰老细胞产生以造成衰老相关分泌表型的细胞因子。所述细胞因子包括但不限于il18、il1a、groa、il22和il9。

本文所用的术语“甲基化谱”(methylationlandscape)是指细胞或细胞群体的dna甲基化模式。

本文所用的术语“表观遗传钟”是指可用于测量年龄的生化测试。所述测试基于dna甲基化水平。第一个多组织表观遗传钟，即horvath的表观遗传钟或“horvath钟”是由stevehorvath开发的(horvath2013)。

本文所用的术语“细胞重编程因子”是指可以将成年或分化的细胞转变为多能干细胞的一组转录因子。在本文的实施方案中，所述因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc，lin28和nanog。

“药学上可接受的盐”包括但不限于氨基酸盐，用无机酸制备的盐，例如氯化物、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、溴化物和硝酸盐，或由前述的任何一种的相应无机酸形式制备的盐，例如盐酸盐等，或者用有机酸制备的盐，例如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙基琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate)、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸盐(para-toluenesulfonate)、棕榈酸盐(palmoate)、水杨酸盐和硬脂酸盐，以及丙酸酯月桂硫酸酯(estolate)、葡庚糖酸盐(gluceptate)和乳糖醛酸盐(lactobionatesalt)。类似地，含有药学上可接受的阳离子的盐包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵(包括取代的铵)。

本文所用的术语“移植物”是指细胞、组织或器官从另一来源向对象的转移。所述术语不限于特定的转移方式。细胞可以通过任何合适的方法，例如通过注射或手术植入而被移植。

本文所用的术语“关节炎”包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎、狼疮相关性关节炎、幼年特发性关节炎、反应性关节炎、肠病性关节炎和牛皮癣关节炎。

本文所用的术语“与年龄有关的疾病或病况”是指与年龄相关的任何病况、疾病或病症，例如但不限于，神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病(huntington'sdisease)、肌萎缩性侧索硬化症、痴呆和中风)，心血管和外周血管疾病(例如动脉粥样硬化、外周动脉疾病(pad)、血肿、钙化、血栓形成、栓塞和动脉瘤)，眼部疾病(例如，与年龄有关的黄斑变性、青光眼、白内障、干眼症、糖尿病性视网膜病、视力丧失)，皮肤疾病(皮肤萎缩和变薄、弹性组织离解和皮肤起皱、皮脂腺增生或发育不全、老年性着色斑和其他色素沉着异常、毛发灰白(grayinghair)、脱发或稀疏以及慢性皮肤溃疡)，自身免疫性疾病(例如风湿性多肌痛(pmr)、巨细胞性动脉炎(gca)、类风湿性关节炎(ra)、结晶性关节病和脊柱关节病(spa))，内分泌和代谢功能障碍(例如成人垂体机能减退症、甲状腺功能减退症、淡漠型甲状腺毒症(apatheticthyrotoxicosis)、骨质疏松症、糖尿病、肾上腺功能不全，各种形式的性腺机能减退和内分泌恶性肿瘤)，肌肉骨胳疾病(例如，关节炎、骨质疏松症、骨髓瘤、痛风、佩吉特氏病(paget’sdisease)、骨折、骨髓衰竭综合征、关节强直、弥漫性特发性骨肥厚、血源性骨髓炎、肌肉萎缩、周围神经病变、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症(als)、假肥大型肌营养不良(duchennemusculardystrophy)、原发性侧索硬化和重症肌无力)，消化系统疾病(例如肝硬化、肝纤维化、巴雷特食管(barrett’sesophagus))，呼吸系统疾病(例如，肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、慢性支气管炎、肺栓塞(pe)、肺癌和感染)，以及与老化相关的任何其他疾病和病症。

本文所用的术语“涉及软骨变性的疾病或病症”是任何涉及软骨和/或关节变性的疾病或病症。术语“涉及软骨变性的疾病或病症”包括影响动物(包括人类)中脊椎盘或关节(例如，关节骨关节(articularjoints))的病况、病症、综合症、疾病和损伤，并且包括但不限于关节炎、软骨病(chondrophasia)、脊柱关节病、强直性脊柱炎、红斑狼疮、复发性多软骨炎和干燥综合征(sjogren'ssyndrome)。

本文所用的术语“肌肉变性疾病或病症”是任何涉及肌肉变性的疾病或病症。所述术语包括影响肌肉组织的病况、病症、综合征、疾病和损伤，例如但不限于肌肉萎缩、肌肉废用、肌肉撕裂、烧伤、外科手术、周围神经病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症(als)、假肥大型肌营养不良、原发性侧索硬化、重症肌无力、癌症、艾滋病、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病(copd)、肝病、肾衰竭、饮食失调、营养不良、饥饿、感染或使用糖皮质激素的治疗。

“治疗有效剂量或量”意指这样的更生细胞或非整合型信使rna的量，其在需要组织修复或再生的对象中引起阳性治疗反应，例如在治疗部位恢复功能和/或致使生成新组织的量。如本文所述，可以通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna在体外、离体或体内转染来产生更生的细胞。因此，例如，“阳性治疗反应”将是与疗法相关的对与年龄有关的疾病或病症的改善，和/或与疗法相关的对与年龄有关的疾病或病症的一种或多种症状的改善，例如恢复的组织功能性、减轻的疼痛、改善的体力(stamina)、增加的力量、增加的活动性和/或改善的认知功能。所需的(细胞或mrna)的确切量将因对象而异，这取决于对象的物种、年龄和一般状况、所治疗病况的严重性、施用方式等。基于本文提供的信息，所属领域中的普通技术人员可以使用常规实验来确定在任何情况下的适当“有效”量。

例如，再生的软骨细胞的治疗有效剂量或量意指这样的量，在当如本文所述施用时，其在具有软骨损伤或丧失的对象中引起阳性治疗反应，例如致使治疗部位(例如，受损的关节)处生成新软骨的量。例如，治疗有效剂量或量可用于治疗由外伤性损伤或变性疾病例如关节炎或其他涉及软骨变性的疾病引起的软骨损伤或丧失。优选地，治疗有效量恢复功能和/或减轻与软骨损伤或丧失有关的疼痛和炎症。

在另一个实例中，更生的骨骼肌干细胞的治疗有效剂量或量意指这样的量，在当如本文所述施用时，其在患有肌肉损伤或丧失的对象中引起阳性治疗反应，例如致使治疗部位(例如，受损的肌肉)处生成新肌纤维的量。例如，治疗有效剂量或量可用于治疗由外伤性损伤或涉及肌肉变性的疾病或病症引起的肌肉损伤或丧失。优选地，治疗有效量改善肌肉力量和功能。

本文所用的术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指任何脊椎动物对象，包括但不限于人类和其他灵长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农畜，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；啮齿动物，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野生鸟类和猎禽，例如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅等。在某些情况下，本公开的方法可用于实验动物、兽医应用以及针对疾病的动物模型的开发。所述术语不表示特定年龄。因此，成人和新生个体均意图被涵盖。

ii.方法

在详细描述本公开之前，应理解，本公开不限于特定的配方或工艺参数，其本身当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述本公开的特定实施方案的目的，且无意于进行限制。

尽管可以在本公开的实践中使用与本文所描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。

本公开涉及通过瞬时过表达影响例如线粒体功能、蛋白水解活性、异染色质水平、组蛋白甲基化、核层多肽(nuclearlaminapolypeptide)、细胞因子分泌或衰老的mrna使老化的细胞和组织更生以恢复功能性的方法。确切地说，发明人已经表明，编码oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog的mrna可用于使多种细胞类型更生，包括成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞和骨骼肌干细胞，同时使细胞保持在分化的细胞的状态。

为了进一步理解本公开，以下提供关于通过用mrna瞬时重编程使细胞更生的方法和使用这样的更生的细胞的基于细胞的疗法的更详细讨论。

a.更生细胞

在一个方面中，本文提供了一种使细胞更生的方法，所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染细胞不超过五(5)个连续日，从而产生更生的细胞。

在实施方案中，更生的细胞具有与年轻细胞相似的表型或活性谱。所述表型或活性谱包括转录组谱、一种或多种核和/或表观遗传标志物的基因表达、蛋白水解活性、线粒体健康和功能、sasp细胞因子表达和甲基化谱中的一个或多个。

在实施方案中，更生的细胞具有与年轻细胞的转录组谱更相似的转录组谱。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括选自rpl37、rhoa、srsf3、ephb4、arhgap18、rpl31、fkbp2、map1lc3b2、elf1、phf8、pol2s2、taf1和sin3a的一种或多种基因的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括rpl37的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括rhoa的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括srsf3的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括ephb4的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括arhgap18的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括rpl31的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括fkbp2的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括map1lc3b2的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括elf1的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括phf8的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括pol2s2的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括taf1的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括sin3a的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞的转录组谱包括rpl37、rhoa、srsf3、ephb4、arhgap18、rpl31、fkbp2、map1lc3b2、elf1、phf8、pol2s2、taf1和sin3a的基因表达增加。

在实施方案中，与参考值相比，更生的细胞显示一种或多种核和/或表观遗传标志物的基因表达增加。在实施方案中，一种或多种核和/或表观遗传标志物选自hp1γ、h3k9me3、层支持蛋白lap2α和sirt1蛋白。在实施方案中，更生的细胞呈现出hp1γ的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞呈现出h3k9me3的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞呈现出层支持蛋白lap2α的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞呈现出sirt1蛋白的基因表达增加。在实施方案中，更生的细胞呈现出hp1γ、h3k9me3、层支持蛋白lap2α和sirt1蛋白的基因表达增加。

在实施方案中，更生的细胞具有与年轻细胞的蛋白水解活性更相似的蛋白水解活性。在实施方案中，所述蛋白水解活性以细胞自噬体形成的增加、糜蛋白酶样蛋白酶体活性的提高或其组合来测量。在实施方案中，蛋白水解活性以细胞自噬体形成的增加来测量。在实施方案中，蛋白水解活性以糜蛋白酶样蛋白酶体活性的提高来测量。在实施方案中，所述蛋白水解活性以细胞自噬体形成的增加和糜蛋白酶样蛋白酶体活性的提高来测量。

在实施方案中，与参考值相比，更生的细胞呈现改善的线粒体健康和功能。在实施方案中，改善的线粒体健康和功能以线粒体膜电位的升高、活性氧簇(ros)的减少或其组合来测量。在实施方案中，改善的线粒体健康和功能以线粒体膜电位的升高来测量。在实施方案中，改善的线粒体健康和功能以活性氧簇(ros)的减少来测量。在实施方案中，改善的线粒体健康和功能以线粒体膜电位的升高和活性氧簇(ros)的减少来测量。

在实施方案中，与参考值相比，更生的细胞显示一种或多种sasp细胞因子的基因表达减少。在实施方案中，一种或多种sasp细胞因子包括il18、il1a、groa、il22和il9。在实施方案中，更生的细胞呈现出il18表达减少。在实施方案中，更生的细胞呈现出il1a表达减少。在实施方案中，更生的细胞呈现出groa表达减少。在实施方案中，更生的细胞呈现出il22表达减少。在实施方案中，更生的细胞呈现出il9表达减少。在实施方案中，更生的细胞呈现出il18、il1a、groa、il22和il9表达减少。

在实施方案中，更生的细胞呈现出甲基化谱的逆转。在实施方案中，甲基化谱的逆转通过horvath钟估计来测量。

在实施方案中，参考值是从老化的细胞获得的。

在实施方案中，通过用编码一种或多种细胞重编程因子的mrna来瞬时重编程使细胞更生。瞬时重编程通过用非整合型mrna以每天一次转染细胞至少两天且不超过5天来完成。“非整合型”是指mrna分子没有在染色体内或在染色体外整合到宿主基因组中，也没有整合到载体中，这使得重编程是瞬时的，并且不破坏更生的细胞的身份(即细胞保持分化为其成年细胞类型的能力)。在实施方案中，细胞的瞬时重编程消除老化的多种标志，同时避免细胞完全去分化为干细胞。

在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过选自以下的转染方法来完成：lipofectamine和lt-1介导的转染、右旋糖酐(dextran)介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、电穿孔、mrna在脂质体中的包封和直接显微注射。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过lipofectamine和lt-1介导的转染来完成。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过右旋糖酐介导的转染来完成。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过磷酸钙沉淀来完成。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过聚凝胺介导的转染来完成。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过电穿孔来完成。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过mrna在脂质体中的包封来完成。在实施方案中，用信使rna转染细胞可以通过直接显微注射来完成。

细胞年龄逆转或更生是通过编码细胞重编程因子的一种或多种mrna的瞬时过表达实现的。此类细胞重编程因子可包括影响线粒体功能、蛋白水解活性、异染色质水平、组蛋白甲基化、核层多肽、细胞因子分泌或衰老的转录因子、表观遗传重塑物或小分子。在实施方案中，所述细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog中的一个或多个。在另一个实施方案中，细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。在某些实施方案中，细胞重编程因子由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成。

在实施方案中，本文提供的方法可以应用于需要更生的任何类型的细胞。所述细胞可以从其他细胞分离，在培养物中或组织(部分或完整)或生物体内与其他细胞混合。本文所述的方法可以例如在包括单个细胞、细胞群体或包括细胞的组织或器官的样品上进行。被选择用于更生的细胞将取决于对于治疗与年龄有关的疾病或病症的期望的治疗效果。

在实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在实施方案中，所述细胞是人类细胞。在实施方案中，所述细胞来自老年对象。

在实施方案中，本文提供的方法可以在神经系统、肌肉系统、呼吸系统、心血管系统、骨骼系统、生殖系统、外皮系统、淋巴系统、排泄系统、内分泌系统(例如，内分泌和外分泌)或消化系统的细胞、组织或器官上进行。如本文所述，任何类型的细胞均可潜在地被更生，包括但不限于上皮细胞(例如鳞状、立方、柱状和假复层上皮细胞)、内皮细胞(例如静脉、动脉和淋巴管内皮细胞)，以及结缔组织、肌肉和神经系统的细胞。此类细胞可以包括但不限于表皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、卫星细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、角质化细胞、基底细胞、成釉细胞、外分泌分泌细胞、肌上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、神经元(例如，感觉神经元、运动神经元和中间神经元)、胶质细胞(例如，少突细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、schwann细胞和卫星细胞)、柱细胞、脂肪细胞、周皮细胞、星状细胞、肺细胞、血液和免疫系统细胞(例如，红细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、t细胞、b细胞、自然杀伤细胞)、荷尔蒙分泌细胞、生殖细胞、间质细胞、晶状体细胞、感光细胞、味觉受体细胞和嗅细胞；以及来自肾脏、肝脏、胰腺、胃、脾脏、胆囊、肠、膀胱、肺、前列腺、乳房、泌尿生殖道、垂体细胞、口腔、食道、皮肤、毛发、指甲、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、眼、鼻或大脑的细胞和/或组织。

在一些实施方案中，所述细胞选自成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌干细胞、角质化细胞、间充质干细胞和角膜上皮细胞。在实施方案中，所述细胞是成纤维细胞。在实施方案中，所述细胞是内皮细胞。在实施方案中，所述细胞是软骨细胞。在实施方案中，所述细胞是骨骼肌干细胞。在实施方案中，所述细胞是角质化细胞。在实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在实施方案中，所述细胞是角膜上皮细胞。

在实施方案中，更生的成纤维细胞呈现出与年轻成纤维细胞的转录组谱相似的转录组谱。在实施方案中，与如上所述的参考值相比，更生的成纤维细胞呈现出一种或多种核和/或表观遗传标志物的基因表达增加。在实施方案中，更生的成纤维细胞具有与上述年轻细胞的蛋白水解活性更相似的蛋白水解活性。在实施方案中，与如上所述的参考值相比，更生的成纤维细胞呈现出改善的线粒体健康和功能。在实施方案中，更生的成纤维细胞呈现出甲基化谱的逆转。

在实施方案中，更生的内皮细胞呈现出与年轻内皮细胞的转录组谱相似的转录组谱。在实施方案中，与如上所述的参考值相比，更生的内皮细胞呈现出一种或多种核和/或表观遗传标志物的基因表达增加。在实施方案中，更生的内皮细胞具有与上述年轻细胞的蛋白水解活性更相似的蛋白水解活性。在实施方案中，与如上所述的参考值相比，更生的内皮细胞呈现出改善的线粒体健康和功能。在实施方案中，更生的内皮细胞呈现出甲基化谱的逆转。

在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出炎性因子表达减少和/或atp和胶原代谢增加。在实施方案中，炎性因子包括rankl、inos2、il6、ifnα、mcp3和mip1a。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出rankl表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出inos2表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出il6表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出ifnα表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出mcp3表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出mip1a表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出rankl、inos2、il6、ifnα、mcp3和mip1a的表达减少。在实施方案中，更生的软骨细胞呈现出atp和胶原代谢增加。在实施方案中，atp和胶原代谢通过增加的atp水平、降低的ros和增加的sod2表达、增加的col2a1表达和由软骨细胞的总体增殖中的一种或多种来测量。在实施方案中，atp和胶原代谢通过增加的atp水平来测量。在实施方案中，atp和胶原代谢通过降低的ros和增加的sod2表达来测量。在实施方案中，atp和胶原代谢通过增加的col2a1表达和由软骨细胞的总体增殖来测量。

在实施方案中，更生的骨骼肌干细胞呈现出更高的增殖能力、增强的分化为成肌细胞和肌纤维的能力、恢复从静止状态的较低的活化动力学、更生肌肉微生态位的能力、恢复肌肉中的年轻化力量或其组合。

在实施方案中，更生的角质化细胞呈现出更高的增殖能力、减少的炎性表型、更低的rnakl和inos2表达、降低的细胞因子mip1a、il6、ifna、mcp3的表达、增加的atp、升高的sod2和col2a1表达水平。

在实施方案中，更生的间充质干细胞呈现出衰老参数的降低、增加的细胞增殖和/或ros水平的降低。在实施方案中，更生的间充质干细胞呈现衰老参数的降低。在实施方案中，衰老参数包括p16表达、p21表达和阳性saβgal染色。在实施方案中，更生的间充质干细胞呈现增加的细胞增殖。在实施方案中，更生的间充质干细胞呈现ros水平的降低。在实施方案中，更生的间充质干细胞呈现出衰老参数的降低，增加的细胞增殖和/或ros水平的降低。

在实施方案中，更生的角膜上皮细胞呈现衰老参数的降低。在实施方案中，所述衰老参数包括p21的表达、p16的表达、线粒体生物发生pgc1α和炎性因子il8的表达中的一种或多种。在实施方案中，所述衰老参数包括p21。在实施方案中，所述衰老参数包括p16的表达。在实施方案中，所述衰老参数包括线粒体生物发生pgc1α。在实施方案中，所述衰老参数包括炎性因子il8的表达。在实施方案中，所述衰老参数包括一种p21的表达、p16的表达、线粒体生物发生pgc1α和炎性因子il8的表达。

本公开的方法可用于使培养中的细胞更生(例如，离体或体外)，以改善其用于细胞疗法的功能和潜能。用于治疗患者的细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，所述细胞源自患者或匹配的供体。例如，在离体疗法中，细胞直接从待治疗患者被获得，用编码细胞重编程因子的mrna转染，如本文所述，并重新植入患者中。这样的细胞可以例如从对患者进行的活检或外科手术中获得。可选地，需要更生的细胞可以用编码细胞重编程因子的mrna在体内直接转染。

可以使用所属领域已知的提供将编码细胞重编程因子的mrna瞬时摄取到需要更生的细胞中(即，用于瞬时重编程)的任何适当方法进行转染。在实施方案中，用于将mrna离体、体外或体内递送到对象的细胞中的方法可以包括选自以下的方法：lipofectamine和lt-1介导的转染、右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、电穿孔、将mrna封装在脂质体中、将mrna直接显微注射到细胞中，或其组合。

b.组合物

在一个方面中，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染细胞不超过五(5)个连续日而获得的更生的细胞。

在实施方案中，更生的细胞是自体的。在实施方案中，更生的细胞是同种异体的。

在一个实施方案中，所述一种或多种细胞重编程因子选自oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。在实施方案中，所述细胞重编程因子是oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

在实施方案中，更生的细胞呈现以下一种或多种：增加的hp1γ、h3k9me3、lap2α、sirt1表达，升高的线粒体膜电位和减少的活性氧簇，以及降低的sasp细胞因子的表达。在实施方案中，所述sasp细胞因子包括但不限于il18、il1a、groa、il22和il9中的一种或多种。

在某些实施方案中，用于细胞疗法的包括更生细胞的组合物还可以包括一种或多种额外的因子，例如营养素、细胞因子、生长因子、细胞外基质(ecm)组分、抗生素、抗氧化剂或免疫抑制剂，以改善细胞功能或存活能力。所述组合物还可以包括药学上可接受的载体。

生长因子的实例包括但不限于成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子β(tgf-β)、上皮调节蛋白、表皮生长因子(“egf”)、内皮细胞生长因子(“ecgf”)、神经生长因子(“ngf”)、白血病抑制因子(“lif”)、骨形态发生蛋白4(“bmp-4”)、肝细胞生长因子(“hgf”)、血管内皮生长因子-a(“vegf-a”)和胆囊收缩素八肽。

ecm组分的示例包括但不限于蛋白聚糖(例如硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素)、非蛋白聚糖多糖(例如透明质酸)、纤维(例如胶原和弹性蛋白)和其他ecm组分(例如纤连蛋白和层粘连蛋白)。

免疫抑制剂的示例包括但不限于甾体的(例如泼尼松)或非甾体的(例如西罗莫司(雷帕鸣(rapamune)，wyeth-ayerstcanada)，他克莫司(普乐可复(prograf)，fujisawacanada)和抗il2r达克珠单抗(赛尼哌(zenapax)，rochecanada)。其他免疫抑制剂包括15-脱氧精胍菌素、环孢菌素、甲氨蝶呤(methotrexate)、雷帕霉素、雷帕鸣(西罗莫司/雷帕霉素)、fk506或利索茶碱(lsf)。

也可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。实例包括但不限于碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合。

例如，可以包括用于预防或阻止(deter)微生物生长的抗微生物剂。适用于本公开的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、西吡氯铵(cetylpyridiniumchloride)、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)及其组合。抗微生物剂还包括也可用于预防细菌感染的抗生素。抗生素的实例包括阿莫西林、青霉素、磺胺药(sulfadrugs)、头孢菌素、红霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、甲基红霉素(chlarithromycin)、环丙沙星、阿奇霉素等。还包括抗真菌剂，例如咪康唑(myconazole)和特康唑(terconazole)。

也可以包括各种抗氧化剂，例如具有巯醇基(thiolgroup)的分子，例如还原型谷胱甘肽(gsh)或其前体，谷胱甘肽或谷胱甘肽类似物，谷胱甘肽单酯和n-乙酰半胱氨酸。其他适当的抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、维生素e、trolox、硫辛酸、lazaroids、丁基羟基苯甲醚(butylatedhvdroxyanisole)(bha)、维生素k等。

适用于可注射组合物的赋形剂包括水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷脂和表面活性剂。碳水化合物例如糖、衍生糖例如醛醇(alditol)、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖(raffinose)、松三糖、麦芽糊精、右旋糖酐、淀粉等；以及醛醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。所述赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(sodiumphosphatedibasic)及其组合。

酸或碱也可以作为赋形剂存在。可以使用的酸的非限制性实例包括选自由以下组成的组的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合。适当碱的实例包括但不限于选自由以下组成的组的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合。

通常，任何单个赋形剂的最佳量是通过常规实验确定的，即通过制备含有变化量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其他参数，并然后确定达到最佳性能的而没有明显不良影响的范围。然而，通常，赋形剂将在组合物中以赋形剂的约1重量％到约99重量％，优选地约5重量％到约98重量％，更优选地约15重量％到约95重量％的量存在，其最优选地浓度为少于30重量％。这些前述药物赋形剂与其他赋形剂一起在"remington:thescience&practiceofpharmacy",19thed.,williams&williams,(1995),the"physician’sdeskreference",52nded.,medicaleconomics,montvale,nj(1998),以及kibbe,a.h.,handbookofpharmaceuticalexcipients,3rdedition,americanpharmaceuticalassociation,washington,d.c.,2000中描述。

c.施用

本公开的方法可以用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况。例如，涉及通过用编码重编程因子的非整合型mrna转染的细胞瞬时重编程的细胞疗法(例如，在体外、离体或体内)可用于治疗对象的各种与年龄相关的疾病和病况，例如但不限于，神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症、痴呆和中风)，心血管和外周血管疾病(例如动脉粥样硬化、外周动脉疾病(pad)、血肿、钙化、血栓形成、栓塞和动脉瘤)，眼部疾病(例如，与年龄有关的黄斑变性、青光眼、白内障、干眼症、糖尿病性视网膜病、视力丧失)，皮肤疾病(皮肤萎缩和变薄、弹性组织离解和皮肤起皱、皮脂腺增生或发育不全、老年性着色斑和其他色素沉着异常、毛发灰白、脱发或稀疏以及慢性皮肤溃疡)，自身免疫性疾病(例如风湿性多肌痛(pmr)、巨细胞性动脉炎(gca)、类风湿性关节炎(ra)、结晶性关节病和脊柱关节病(spa))，内分泌和代谢功能障碍(例如成人垂体机能减退症、甲状腺功能减退症、淡漠型甲状腺毒症、骨质疏松症、糖尿病、肾上腺功能不全，各种形式的性腺机能减退和内分泌恶性肿瘤)，肌肉骨胳疾病(例如，关节炎、骨质疏松症、骨髓瘤、痛风、佩吉特氏病、骨折、骨髓衰竭综合征、关节强直、弥漫性特发性骨肥厚、血源性骨髓炎、肌肉萎缩、周围神经病变、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症(als)、假肥大型肌营养不良、原发性侧索硬化和重症肌无力)，消化系统疾病(例如肝硬化、肝纤维化、巴雷特食管)，呼吸系统疾病(例如，肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、慢性支气管炎、肺栓塞(pe)、肺癌和感染)，以及与老化相关的任何其他疾病和病症。

在一个方面中，本文提供了用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性疾病、神经变性疾病和/或肌肉骨骼功能障碍的方法。所述方法包括施用治疗有效量的细胞，所述细胞包括编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna。

通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna进行转染的治疗的至少一个治疗有效周期可以施用于对象用于治疗与年龄有关的疾病或病况。

在实施方案中，所述与年龄相关的疾病或病况选自眼睛、皮肤或肌肉骨骼功能障碍。

在实施方案中，所述对象患有软骨变性病症。在实施方案中，所述病症选自关节炎、软骨病、脊柱关节病、强直性脊柱炎、红斑狼疮、复发性多软骨炎和干燥综合征。在实施方案中，所述病症是关节炎。在实施方案中，所述病症是软骨病。在实施方案中，所述病症是脊柱关节病。在实施方案中，所述病症是强直性脊柱炎。在实施方案中，所述病症是红斑狼疮。在一些实施方案中，所述病症是复发性多软骨炎。在一些实施方案中，所述病症是干燥综合征。

在实施方案中，治疗减少一种或多种炎性因子的表达和/或增加atp和胶原代谢。在实施方案中，炎性因子选自rankl、inos2、il6、ifnα、mcp3和mip1a。在实施方案中，atp和胶原代谢通过增加的atp水平、降低的ros和增加的sod2、增加的col2a1和由软骨细胞的总体增殖中的一种或多种来测量。

在实施方案中，用通过在细胞培养物中离体或体外转染而更生的细胞对对象的治疗，用于移植更生的细胞的组合物通常但不一定通过注射或外科手术植入施用于需要组织再生或修复的区域中。

在一些实施方案中，所述治疗有效量的更生的细胞选自成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌干细胞、角质化细胞、间充质干细胞和角膜上皮细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是成纤维细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是内皮细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是软骨细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是骨骼肌干细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是角质化细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是间充质干细胞。在实施方案中，治疗有效量的更生的细胞是角膜上皮细胞。

在实施方案中，更生的角膜上皮表现出衰老参数的降低。在实施方案中，所述衰老参数包括p21和p16的表达、线粒体生物发生pgc1α和炎性因子il8的表达中的一种或多种。

在一个实施方案中，软骨损伤或丧失区域内的软骨细胞用足以致使软骨细胞的更生以及在治疗部位生成新的软骨的有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna在体内被转染。可选地，通过离体或体外转染产生的更生的软骨细胞可以局部施用于软骨损伤或丧失区域，例如对象的受损的关节或其他适当治疗部位。更生的软骨细胞的治疗有效剂量或量意指在患有软骨损伤或丧失的对象中引起阳性治疗反应的量，例如致使在治疗部位(例如，受损的关节)生成新的软骨的量。例如，治疗有效剂量或量可用于治疗由外伤性损伤或变性疾病，例如关节炎或其他涉及软骨变性的疾病引起的软骨损伤或丧失。优选地，治疗有效量恢复功能和/或减轻与软骨损伤或丧失有关的疼痛和炎症。

在另一个实施方案中，骨骼肌干细胞用足以致使骨骼肌干细胞的更生(即恢复潜能)并且在治疗部位(例如，受损的肌肉)生成新肌纤维的有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna在体内被转染。可选地，通过离体或体外转染产生的更生的骨骼肌干细胞可以局部施用于需要修复或再生的受损的肌肉中。例如，治疗有效剂量或量可用于治疗由外伤性损伤、肌肉萎缩或涉及肌肉变性的疾病或病况引起的肌肉损伤或丧失。更生的骨骼肌干细胞的治疗有效剂量或量意指在患有肌肉损伤或丧失的对象中引起阳性治疗反应的量，例如致使在治疗部位(例如，受损的肌肉)生成新肌纤维的量。优选地，治疗有效量改善肌肉力量和功能，减轻疼痛，改善体力和/或增加活动性。

在一个方面中，本文提供了如本文以上所述的用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症和/或患有肌肉骨骼功能障碍的对象的方法。如本文以上所述，所述方法包括施用治疗有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna。

在实施方案中，对象中的细胞可以通过在体内用有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna转染来被更生。

在一个方面中，本文提供离体使工程化的组织更生的方法。所述方法包括用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染组织不超过五(5)个连续日，从而产生更生的工程化的组织。

在实施方案中，所述工程化的组织呈现出衰老参数、促炎因子的减少，组织学评分的改善或其组合。在实施方案中，工程化的组织呈现出一种或多种衰老参数的降低。在实施方案中，所述衰老参数选自p16表达、阳性saβgal染色和促炎因子il8和mmp1表达。在实施方案中，工程化的组织呈现出p16表达的降低。在实施方案中，工程化的组织呈现出阳性saβgal染色的减少。在实施方案中，工程化的组织呈现出促炎细胞因子il8和mmp1表达的减少。在实施方案中，工程化的组织呈现出组织学评分的改善。在实施方式中，组织学评分包括形态学、组构(organization)和/或质量。

在实施方案中，工程化的组织是工程化的皮肤组织和类器官。

d.试剂盒

本公开还提供了包括一个或多个容器的试剂盒，所述容器容纳包括用于细胞的瞬时重编程的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna的组合物。试剂盒可进一步包括转染剂、用于培养细胞的培养基，以及任选地一种或多种其他因子，例如生长因子、ecm组分、抗生素等。编码细胞重编程因子的mrna和/或其他组合物可以是液体形式或冻干的。所述试剂盒还可包括保存或维持mrna使其免受降解的组分。所述组分可以是无rna酶的或免受rna酶的。用于组合物的合适容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料制成，包括玻璃或塑料。容器可以具有无菌取药口(accessport)(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。

所述试剂盒可以进一步包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(ringer'ssolution)或右旋糖溶液。它还可以含有对最终用户有用的其他材料，包括其他药学上可接受的配制溶液，例如缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头和注射器或其他递送装置。所述递送装置可以预填充有组合物。

所述试剂盒还可包括包装插页，所述包装插页含有用于治疗与年龄有关的疾病或病况的方法的书面说明。所述包装插页可以是未经批准的包装插页草稿，或可以是食品药品监督管理局(fda)或其他监管机构批准的包装插页。

在一些实施方案中，所述试剂盒包括编码选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组中的一种或多种细胞重编程因子的mrna。在一个实施方案中，试剂盒包括编码oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog细胞重编程因子的mrna。

iii.实验

以下是用于执行本公开的特定实施方案的示例。这些示例的提供仅出于说明性目的，并且无意以任何方式限制本公开的范围。

已经尽力确保对于所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是，当然应该允许一些实验误差和偏差。

应理解，本文描述的示例和实施方案仅用于说明目的，并且基于此的各种修改或改变将被建议给所属领域中的技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的以其全文通过引用并入本文。

实施例

实施例1：瞬时和非整合型细胞重编程促进老化的多方面逆转

本文所述的实验描述了可以通过瞬时重编程方案实现的年龄逆转作用的程度，其在细胞身份不可逆转丧失之前就停止了。最近的证据还表明，部分转基因重编程可以改善与年龄相关的标志，并延长早衰小鼠的寿命。然而，尚不清楚这种“表观遗传更生”形式将如何广泛应用于自然老化，且重要的是它如何安全地转化至人类细胞。本文的数据表明，基于mrna技术的瞬时重编程在从人临床样品中获得的体细胞和干细胞中逆转生理老化的标志，减少与年龄有关的疾病表型，并恢复随年龄而减少的再生反应。本文所述的瞬时细胞重编程的非整合型方法为一种新的、更为可转化的策略铺平了道路，所述一种新的、更为可转化的策略用于旨在面向再生医学的离体细胞更生治疗和用于为了延缓或逆转自然老化的生理衰退以及与年龄有关疾病的发病机制的体内组织更生疗法。

为了测试是否可以在无返回点之前实现对细胞年龄的任何实质性和可测量的重编程，以及是否其可以导致对细胞功能和生理性质的改善，评估了瞬时重编程对来自其他健康人对象的两种不同细胞类型(成纤维细胞和内皮细胞)的老化的生理性质的作用，并将其与取自年轻供体的相同细胞类型比较。成纤维细胞来自切碎的手臂和腹部皮肤活检(年轻对照为25-35岁，n＝3，且老化的组为60-70岁，n＝3)，而内皮细胞是从髂静脉和动脉的胶原酶消化液中提取的(年轻对照为15-25岁，n＝3，且老化的组为45-50岁，n＝3)。

使用了非整合型重编程方案。所述方案基于表达oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog(oskmln)的mrna的混合物而被优化。探索了多个重编程持续时间，并且尽管两种细胞类型都早在r2x2(两次重编程转染，具有恢复为基础状态的两天放松期)就呈现出许多老化参数中的快速变化，但最明显的作用是在r4x2(图1a和图2a)。在每天转染12-15次后，无论供体的年龄如何，该方案始终产生诱导性多能干细胞(ipsc)集落；基于观察到内源多能性相关的lncrna的第一个可检测到的表达发生在第5天，我们推断我们的平台中的pnr发生在重编程的大约第5天。因此，采用瞬时重编程方案，其中oskmln连续四天每天被转染，并在中断后两天进行基因表达分析。

在相同的三个队列(年轻的(y)、未处理的老化的(ua)和已处理的老化的(ta))中对两种细胞类型均进行双末端批量rna测序。首先，对于每种细胞类型比较年轻的和未处理的老化细胞(“yvsua”)的分位数标准化转录组。数据显示，成纤维细胞中的961个基因(5.85％)(678个上调的，289个下调的)以及内皮细胞中的748个基因(4.80％)(389个上调的，377个下调的)在年轻细胞和老化细胞之间有所不同，其中显著性标准为p<.05和对数倍数变化截止值为+/-0.5(图6)。这些基因集针对许多已知的老化途径而被富集，其在分子特征数据库中的标志性基因集集合中被识别。当绘制在每个基因均值之上或之下的表达定向图时，观察到对于成纤维细胞和内皮细胞两者的经处理细胞和年轻细胞之间的明显相似性，其与老化细胞相反。在该基因集空间中进行主组分分析(pca)，并确定年轻群体和老化群体随第一主组分(pc1)是可分离的，这解释了成纤维细胞中64.8％的变化和内皮细胞中60.9％的变化。有趣的是，处理的细胞也随pc1聚集到更接近于更年轻的群体(图1k和2j)。

使用上文所定义的相同的显著性标准，比较了未处理和经处理的老化群体(“uavs.ta”)，并发现成纤维细胞中的1042个基因(734个上调的，308个下调的)和内皮细胞基因中992个基因(461个上调的，531个下调的)是差异表达的。有趣的是，同样在这些基因集中，我们发现了对于分子特征数据库中的老化途径的富集。当比较每种细胞类型中年轻的相对于未处理的老化的(“yvsua”)以及未处理的老化的相对于经处理的老化的(“uavsta”)的图谱时，观察到成纤维细胞的重叠率为24.7％(比值比为4.53，p<0.05)并且内皮细胞的重叠率为16.7％(比值比为3.84，p<0.05)，其基因表达变化的方向与年轻人的相符(即如果年轻的中较高，那么经处理的老化的中也较高)；每种细胞类型中，低于0.5％移动方向相反。

接下来，这些转录组学谱用于验证瞬时重编程后细胞身份的保留。为此，使用已建立的细胞身份标志物，我们证实在处理后没有显著变化(图10)。另外，我们无法检测任何多能性相关标志物的表达(转染了oskmlnmrna除外)(图10)。总而言之，对转录组学特征的分析表明，瞬时重编程触发更年轻的基因表达谱，同时保留细胞身份。

基于dna甲基化水平的表观遗传钟是跨组织和细胞类型的最准确的年龄分子生物学标志物，且可预测许多与年龄相关的情况包括寿命。已知典型重编程因子(oskm)的外源表达用来将原代细胞的表观遗传年龄恢复为出生前状态。为了测试oskmln的瞬时表达是否可以逆转表观遗传钟，使用了两个适用于人成纤维细胞和内皮细胞的表观遗传钟：horvath首创的泛组织表观遗传钟(pan-tissueepigeneticclock)(基于353个胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤对)以及皮肤和血液钟(基于391个cpg)。

根据泛组织表观遗传钟，瞬时oskmln显著(双向混合效应模型p值＝0.023)恢复了dna甲基化年龄(平均年龄差＝-3.40年，标准误差1.17)。与成纤维细胞(平均年龄差＝-1.84，se＝1.46，图6g)相比，内皮细胞(平均年龄差＝-4.94年，se＝1.63，图6h)中的更生作用更明显。用皮肤和血液表观遗传钟可以获得定性相似但显著性较低的结果(总体更生作用-1.35年，se＝0.67，单向混合效应模型p值＝0.042，内皮细胞和成纤维细胞中的平均更生分别为-1.62年和-1.07)。

这些结果提示，分析了瞬时重编程对细胞生理老化的多种标志的作用。使用了涵盖老化标志的一组11种已建立的测定法(图11)，并且大多数分析是使用单细胞高通量成像进行的，以捕获单细胞中的定量变化和整个细胞群体中的分布变化。所有分析均在每个单独的细胞系中分开进行(总共19个成纤维细胞系：3个年轻的，8个老化的和8个经处理的老化的；总共17个内皮细胞系：3个年轻的，7个老化的和7个经处理的老化的)。在每个成对的样本集中进行统计分析；随后按年龄类别汇总了数据以便于表示(有关使用的统计方法的详细说明，请参见“材料和方法”)。通过采用编码gfp的mrna的相同转染方案进行对照实验。

为了扩展关于表观遗传学的发现，进行了实验以通过免疫荧光(if)来定量测量表观遗传抑制标志物h3k9me3，与异染色质相关的蛋白hp1γ和核层支持蛋白lap2α(图1b、1c、2b、2c、5a-c)。与年轻细胞相比，老化的成纤维细胞和内皮细胞对于所有三个标记物均显示核信号中的减少。老化细胞的处理致使两种细胞类型中这些标志物的增加。接下来，通过测量自噬体的形成和糜蛋白酶样蛋白酶体活性(随着年龄而降低)来检查细胞的蛋白水解活性中所涉及的两种途径。处理将两种途径提高到类似于或甚至高于年轻细胞的水平，表明重编程中的早期步骤促进了降解的生物分子的主动清除(图1d、2d、5g-h)。

在能量代谢方面，老化的细胞显示出线粒体活性降低、活性氧簇(ros)积累和营养素感应失调。因此，通过测量细胞中的线粒体膜电位、线粒体ros和sirtuin1蛋白(sirt1)的水平来测试处理对老化的细胞的作用。瞬时重编程增加了两种细胞类型中的线粒体膜电位(图1e左图、2e左图、5e)，而它降低了ros(图1e右图、2e右图、5f)并增加了成纤维细胞中sirt1蛋白的水平，这与年轻细胞类似(图1f、2f和5d)。衰老相关的β-半乳糖苷酶染色显示老化的内皮细胞中的衰老细胞数量显著减少(图1h、2h和5i)。所述减少伴随着内皮细胞中促炎性衰老相关的分泌表型(sasp)细胞因子(5j)的再次减少。最后，在两种细胞类型中，通过定量荧光原位杂交测量的端粒长度均未呈现出随处理而显著延伸(图1g和2g)，这表明细胞未去分化为端粒酶活性可被重新激活的干细胞样状态。

接下来，评估了这些作用的持久性，并发现从中断重编程四天和六天后，大多数被显著保留。通过在连续两天被转染的成纤维细胞和内皮细胞中重复相同的实验集合，研究了这些生理更生性变化的显现有多快。值得注意的是，数据显示，处理两天后，大多数更生作用已经可见，尽管大多数较为适中。

总的来说，该数据表明oskmln的瞬时表达可以在转录组、表观遗传学和细胞水平上诱导人细胞中细胞年龄的快速、持续逆转。重要的是，这些数据表明“细胞更生”的过程-本文称为“表观遗传学老化重编程”或“era”-非常早且迅速地参与了ipsc重编程过程。这些表观遗传和转录变化发生在细胞身份的任何表观遗传重编程进行之前。

随着era对细胞老化的有益作用的这些指示，进行了实验以研究era是否还可以逆转与老化相关的炎性表型。在获得内皮细胞中这种逆转的初步证据之后(图5j)，将分析扩展到了骨关节炎，该疾病与老化密切相关并且特征在于影响关节内软骨细胞的明显炎性谱。从由于其晚期oa而接受全关节置换手术的60-70岁老龄患者的软骨中分离出软骨细胞，并将处理结果与从年轻个体中分离出的软骨细胞进行比较。瞬时重编程进行了两或三天，且从中断重编程两天后进行分析，尽管随处理时间更长跨患者的效果更一致。处理显示rankl和inos2的促炎性细胞因子(图7i)的细胞内mrna水平以及细胞分泌的炎性因子水平(图3h-i和7i)显著降低。另外，如线粒体ros减少和抗氧化物sod2(该基因已在oa中显示被下调)的rna水平升高(图3d、3e、7b和7d)所揭示的，era促进细胞增殖(图3a和7d)，增加atp产生(图3c和7a)和降低氧化应激。era不会影响sox9(对于软骨细胞身份和功能核心的转录因子)的表达水平，并且显著增加col2a1(关节软骨中的主要胶原蛋白)的表达水平(图3b、7e和7f中的qrt-pcr)，表明软骨细胞身份的保留。总之，这些结果表明，oskmln的瞬时表达可以促进老化的oa软骨细胞中基因表达和细胞生理性质被部分逆转至更健康的状态。

干细胞丧失功能和再生能力代表老化的另一个重要标志。进行实验以评估瞬时重编程对损害再生的体干细胞中与年龄相关的变化的作用。首先，在小鼠来源的骨骼肌干细胞(musc)上测试了瞬时重编程的效果。将musc处理2天同时使用人造龛将它们保持在静止状态。最初的实验是用通过facs分离的年轻的(3个月)和老化的(20-24个月)鼠musc进行的。老化的musc的处理减少了第一次分裂的时间(接近于静止年轻musc的更快活化动力学)以及线粒体质量。此外，处理部分挽救了降低的单个musc形成群落的能力。这些细胞被进一步培养，且数据表明处理并没有改变肌原性标志物myod的表达，而是提高了它们分化为肌管的能力，这表明瞬时重编程不会破坏肌原性命运，但可以增强肌原性潜力。

接下来，测试了musc在体内再生新组织的功能和潜能。为此，用表达萤光素酶和绿色荧光蛋白(gfp)的慢病毒转导年轻的、老化的或瞬时重新编程的老化的musc，然后将细胞移植到免疫受损小鼠的受损胫骨前(ta)肌肉中。纵向生物发光成像(bli)最初显示，用已处理的老化的musc移植的肌肉呈现出最高的信号(第4天，图4b)，但到移植后第11天，它与具有年轻musc的肌肉相当；相反，具有未处理的老化musc的肌肉在移植后的所有时间点均呈现出较低的信号(图4b)。免疫荧光分析进一步揭示，相比于用未处理的老化的musc移植的ta中，在用已处理的老化的musc移植的ta中源自供体的(gfp⁺)肌纤维数目更高(图4c)。此外，相比于其未处理的对应物，来自已处理的老化细胞的gfp⁺肌纤维呈现出增加的横截面积，并且实际上甚至高于年轻对照(图4d)。总之，这些结果表明，瞬时重编程的老化musc的组织再生潜力得到了改善。3个月后，对所有小鼠进行尸检，且未发现赘生病变或畸胎瘤。

为了测试该处理的潜在长期益处，在细胞移植后60天诱发第二次损伤，并且数据再次显示，用瞬时重编程的老化musc移植的ta肌肉产生更高的bli信号(图4e)。

肌肉减少症是一种与年龄有关的病况，其特征是肌肉质量和力量产生的下降。同样，在小鼠中，肌肉功能呈现出随年龄而逐步退化。为了测试老化的musc的瞬时重编程是否会改善基于细胞的治疗用于恢复老年小鼠肌肉的生理功能，进行了电生理学以测量从年轻的(4个月)或老化的(27个月)免疫受损小鼠分离的ta肌肉中的强直性力的产生。数据显示，与年轻小鼠相比，来自老化的小鼠的ta肌肉具有较弱的强直性力，表明年龄相关的力量产生的丧失(图8f)。接下来，从老化的小鼠(20-24个月)中分离musc。在处理老化的musc之后，将细胞移植到老化的(27个月)免疫受损小鼠的心脏毒素损伤的ta肌肉中。提供了三十(30)天以给移植的肌肉足够的时间来完全再生。进行电生理学以测量强直性力的产生。用未处理的老化musc移植的肌肉呈现出与来自老化对照小鼠的未移植肌肉相当的力量(图4h)。相反，接受已处理的老化musc的肌肉呈现出的强直性力与来自年轻对照小鼠的未移植肌肉相当。这些结果支持瞬时重编程与基于musc的疗法相结合，可以将老化的肌肉的生理功能恢复为年轻肌肉的生理功能。

最后，将这些结果转化至人musc。重复这项研究，使用从不同年龄范围(10至80岁)的患者获得的手术样本，并用表达gfp和荧光素酶的慢病毒载体转导它们。与在小鼠中一样，与来自同一个体的未处理musc相比，移植的、瞬时重编程的老化musc导致bli信号增加，并且与年轻musc所观察到的bli信号相似(图8d)。有趣的是，具有已处理的和未处理的musc的对侧肌肉之间的bli信号在年龄较大组(60-80岁)中比在年龄较小组(10-30岁或30-55岁)中更高，这表明era将老化细胞中的丧失功能恢复到更年轻的水平(图8e)。综上所述，这些结果表明，瞬时重编程将老化musc的潜能部分地恢复到与年轻musc的潜能相似的程度，而不会损害它们的命运，并因此具有作为再生医学中的细胞疗法的潜力。

结合来自>65岁老年患者的成纤维细胞和角质化细胞，重建(reconstitute)体外三维(3d)工程化皮肤，并通过向培养基中添加重编程因子混合物来转染。进行组织学分析以评估质量，并指定数值分数(图8a)。与对照的未处理和视黄酸处理的样品相比，用通过增加的数值得分来测量到重编程因子观察到了更生。

离体培养视网膜上皮细胞，并用oskmn瞬时重编程2天或3天。结果显示p16(图9a)、p21(图9b)、il8和(图9c)pgc1a(图9d)的表达显著减少。

对诱导多能干细胞(ipsc)进行核重编程是一个多阶段的过程，包括启动、成熟和稳定化。完成这样一个动态且复杂的“表观遗传重编程”后，ipsc不仅是多能性的，而且是年轻的。本文中的数据表明，当尚未进行细胞身份的表观遗传擦除时，瞬时细胞重编程的基于mrna的平台可以非常迅速地逆转起始阶段中老化的标志。数据显示，更生的过程发生在老化的人细胞中，其中患病细胞和老化干细胞中失去的功能在保留细胞身份的同时得以恢复。

实施例2：方法

mrna转染：使用厂商的方案使用mrna-in(mtiglobalstem)用于成纤维细胞和软骨细胞以减少细胞毒性，以及使用lipofectaminemessengermax(thermofisher)用于内皮细胞和musc(其更难被转染)来转染细胞。转染后4小时，为成纤维细胞和内皮细胞更换培养基，但不为软骨细胞或musc更换培养基，因为需要过夜孵育以产生显著的mrna摄取。gfpmrna和oskmnl混合物中单个因子的免疫染色均证实了递送效率。mrna合成和转染优化与jensdurruthy-durruthy(也是塞巴斯蒂亚诺实验室(sebastianolab)的成员)以及esibio的设施一起完成，其作为顾问。

成纤维细胞的分离和培养：使用在其60-70岁(老化的)和30-40岁(年轻的)的混合男女患者的2mm穿刺活检，对健康患者的来自上臂中部或腹部的内侧的活检进行分离。从这些外植体中培养出细胞，并保持在eagle的最低必需培养基中，其中earl的盐补充有非必需氨基酸、10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。

内皮细胞的分离和培养：在coriell研究所，从死于头部突然受伤但除此之外在其45-50岁(老化的)和青少年(年轻的)是健康的供体在死前取出的髂动脉和静脉中进行分离。用胶原酶消化组织，并使用从内腔释放的细胞开始培养。将细胞保持在补充有2mml-谷氨酰胺、15胎牛血清、.02mg/ml内皮生长补充剂、.05mg/ml肝素和1％青霉素/链霉素的培养基199中。

核免疫细胞化学：用hbss洗涤细胞，然后用pbs中的15％多聚甲醛固定15分钟。然后用pbs中1％bsa和.3％tritonx-100的封闭溶液封闭细胞30分钟。然后将一抗应用在pbs中1％bsa和.3％tritonx-100中，并允许其在4℃下孵育过夜。第二天，将细胞用hbss洗涤，然后转换至相应的alexaflour标记的二抗，并孵育2小时。然后再次洗涤细胞，并然后用dapi染色30分钟。最后，将细胞转换至hbss用于成像。

自噬体形成染色：用hbss洗涤细胞，并转换至含有基于lc3的荧光自噬体标志物(sigma)的染色溶液。然后将细胞在5％co2下于37℃孵育20分钟。然后使用hbss/ca/mg将细胞洗涤两次。然后使用celltrackerdeepred(细胞标记染料)将细胞染色15分钟。然后将细胞转换至hbss/ca/mg，用于用operetta的单细胞成像。

蛋白酶体活性测量：首先用prestoblue(thermo)(细胞存活能力染料)对孔染色10分钟。使用tecan荧光读板仪读取孔信号。然后，将细胞用hbss/ca/mg洗涤，然后转换至含有llvy-r110荧光底物(sigma)的原始培养基，所述荧光底物被糜蛋白酶样20s蛋白酶体活性裂解。然后将细胞在5％co2下于37℃孵育2小时，然后在tecan荧光读板仪上再次读取。

线粒体膜电位染色：将四甲基罗丹明、甲酯、高氯酸盐(thermo)添加到细胞培养基中，该染料基于线粒体的膜电位而被线粒体螯合。然后将细胞在5％co2下于37℃孵育30分钟。然后将细胞用hbss/ca/mg洗涤2次，然后使用celltrackerdeepred染色15分钟。最后，用operetta在新鲜hbss/ca/mg中对细胞成像。

线粒体ros测量：用hbss/ca/mg洗涤细胞，然后转换到含有mitosox的hbss/ca/mg，mitosox是一种被线粒体中的超氧化物氧化的荧光染料。然后将细胞在5％co2下于37℃孵育10分钟。然后将细胞用hbss/ca/mg洗涤两次，然后使用celltrackerdeepred染色15分钟。最后，用operetta在新鲜的hbss/ca/mg中对细胞成像。

saβgal组织化学：将细胞用hbss/ca/mg洗涤两次，然后用pbs中15％多聚甲醛固定6分钟。然后将细胞用hbss/ca/mg漂洗3次，然后用x-gal显色底物染色，用内源b半乳糖苷酶裂解。将细胞保持在染色溶液中，并在环境co2下于37℃孵育过夜。第二天，用hbss/ca/mg再次洗涤细胞，然后转换至70％甘油溶液用于在莱卡明场显微镜下成像。

细胞因子测定：这项工作是与斯坦福大学人类免疫监测中心一起进行的。收集细胞培养基，并在rt下以400rcf旋转10分钟。然后将上清液用液氮速冻直至分析。使用人63-plex试剂盒(ebiosciences/affymetrix)进行分析。将小珠添加到96孔板中，并在biotekelx405洗涤器中洗涤。将样品添加到含有混合的抗体连接小珠的板中，并在室温下孵育1小时，然后在4℃下振荡孵育过夜。在定轨振荡器上以500-600rpm进行冷孵育和室温孵育步骤。过夜孵育后，将板在biotekelx405洗涤器中洗涤，并然后在室温下振荡添加生物素化的检测抗体75分钟。如上所述洗涤板，并加入抗生蛋白链菌素-pe。在室温下孵育30分钟后，如上进行洗涤，并将读取缓冲液添加至孔。每个样品一式两份进行测量。使用luminex200仪器读取板，其中每个细胞因子每个样品的下限为50个小珠。将radixbiosolutions的定制测定对照小珠添加到所有孔中。

抗体：将以下5种一抗用于核测量：兔抗组蛋白h3k9me3组蛋白甲基化(1:4000)，小鼠抗hp1γ异染色质标志物(1:200)，兔抗lap2α(1:500)核组织蛋白，小鼠抗laminina/c核包膜标志物和兔抗sirt1(1:200)。

rna测序和数据分析

洗涤细胞并由trizol(thermo)消化。使用总rna纯化试剂盒(norgenbiotekcorp)分离总rna，并通过rna分析筛选带(r6k筛选带，agilent)评估rna质量，将rin>9的rna反转录为cdna。使用truseqrna样品制备试剂盒v2(illumina)，使用1μg总rna制备cdna文库。由agilentbioanalyzer2100评估rna质量，将rin>9的rna反转录为cdna。使用增加有分子标引的优势的truseqrna样品制备试剂盒v2(illumina)，使用500ng的总rna来制备cdna文库。在任何pcr扩增步骤之前，将所有cdna片段末端随机连接至一对包含8bp独特分子标引的连接物。然后将分子标引的cdna文库进行pcr扩增(15个循环)，并然后使用bioanalzyer和qubit进行qc。成功qc后，将它们在illuminanextseq平台上测序以获得80bp的单末端读取。修剪读取，每个末端2个核苷酸，以去除低质量的部分，并改善在基因组上的作图。通过除去重复项但跟踪数据库中每个样品中每个序列发生多少次来压缩得到的78个核苷酸读取。然后使用精确匹配将独特的读取作图到人基因组。这会错读跨外显子-外显子边界的读取，以及带有错误和snp/突变的读取，但对估计每个基因的表达水平没有实质性影响。然后为每个作图的读取被分配来自潜在基因组的注释。在多个注释的情况下(例如在基因的内含子中出现的mirna)，使用基于启发法的层次结构为每个读取赋予唯一身份。然后将其用于识别属于每个转录本的读取，并确定转录本上每个位置的覆盖范围。该覆盖范围是不均匀且凸起的，因此我们使用此覆盖范围的中位数作为基因表达值的估计值。为了比较不同样品中的表达，使用了分位数标准化。在matlab中进行进一步的数据分析。然后计算表达水平的比率以估计倍数变化的对数(以2为底)。使用学生t检验来确定具有p<.05截止值的显著性。encode基因分析用于转录因子鉴定，其由斯坦福生物医学信息学研究中心的buttelab开发并使其公开可得。

小鼠：c57bl/6雄性小鼠和nsg小鼠获自杰克逊实验室。nod/mrkbomtac-prkdcscid雌性小鼠获自taconicbiosciences。小鼠被安置和维护在退veteransaffairspaloaltohealthcaresystems的veterinarymedicalunit中。动物方案已被斯坦福大学的实验动物护理的管理小组批准。

人类骨骼肌标本：对象的年龄范围为10至78岁。在患者知情同意后，取人肌肉活检样本，作为斯坦福大学机构审查委员会批准的人类研究方案的部分。根据临床程序的可用性，所有实验均使用新鲜的肌肉样本进行。在样本分离一到十二小时内开始用于细胞分析的样品处理。在所有研究中，标准差反映使用真实生物学重复(即独特的供体)的研究得出的数据中的变化性。数据与供体身份无关。

musc分离和纯化：从后肢收获肌肉，并进行机械离解以产生破碎的肌肉悬浮液。然后在胶原酶ii-ham的f10溶液(每毫升500个单位；invitrogen)中消化45-50分钟。洗涤后，用胶原酶ii(每毫升100单位)和dispase(每毫升2单位；thermofisher)进行第二次消化30分钟。洗涤、过滤所得的细胞悬浮液，并用vcam-生物素(克隆429；bdbioscience)、cd31-fitc(克隆mec13.3；bdbioscience)，cd45-apc(克隆30-f11；bdbioscience)和sca-1-pacific-blue(克隆d7；biolegend)抗体以1:100的稀释度染色。从新鲜的手术样本50,51中纯化人musc。仔细地从脂肪和纤维化组织中解剖手术样品，并按照针对小鼠组织所述的制备分离的肌肉悬浮液。然后将得到的细胞悬浮液洗涤、过滤并用抗cd31-alexafluor488(克隆wm59；biolegend；#303110，1:75)，抗cd45-alexafluor488(克隆hi30；invitrogen；#mhcd4520，1:75)，抗cd34-fitc(克隆581；biolegend；#343503，1:75)，抗cd29-apc(克隆ts2/16；biolegend；#303008，1:75)和抗ncam-生物素(克隆hcd56；biolegend；#318319，1:75)染色。然后洗涤未结合的一抗，并将细胞在链霉亲和素-pe/cy7(biolegend)中于4℃孵育15分钟，以检测ncam-生物素。在配有488-nm、633-nm和405-nm激光的校准bd-facsariaii或bdfacsariaiii流式细胞仪上进行细胞分选以获得musc群体。将一小部分分选的细胞铺板，并对pax7和myod染色，以评估分选群体的纯度。对于facs门控策略的信息，请参阅“补充信息”。

生物发光成像：使用xenogenivis-spectrum系统(caliperlifesciences)进行生物发光成像。使用2％异氟烷以2.5l/min(n＝4)的流速麻醉小鼠。施用溶解在无菌pbs中的d-荧光素(50mg/ml，biosynthinternationalinc.)的腹膜内注射。注射后立即以最高分辨率(小分档)以最大灵敏度(f-stop1)对小鼠成像30秒。每分钟进行30秒的曝光，直到生物发光信号的峰值强度开始减弱。保存每个图像以供后续分析。在盲法下进行成像：进行成像的研究人员不知道对于移植的细胞的实验条件的同一性。

生物发光图像分析：使用4.0版livingimage软件(caliperlifesciences)对每个图像进行分析。将手动生成的圆放置在感兴趣区域的顶部，并调整大小以完全围绕肢体或接受者小鼠上的指定区域。类似地，将感兴趣的背景区域放置在小鼠的移植的腿外侧的区域上。

组织收集：将ta肌肉从骨头上仔细切开、称重，并放入0.5％pfa溶液中固定过夜。然后将肌肉移至20％蔗糖溶液中3个小时，或直至肌肉达到其饱和点并开始下沉。然后将组织包埋并冷冻在最佳切割温度(oct)培养基中，并保存在-80℃直至切片。在莱卡cm3050s低温恒温器上进行切片，所述低温恒温器被设置为产生10μm的切片。将切片封固在fisherbrandcolorfrost载片上。将这些载片保存在-20℃，直到可以进行免疫组织化学。

组织学：使用0.5％电子显微镜级多聚甲醛将ta肌肉固定5小时，并然后将其转移到20％蔗糖过夜。然后将肌肉在oct中冷冻，以10μm厚度冷冻切片并染色。对于苏木精和曙红(sigma)或gomorritrichrome(richard-allanscientific)的比色染色，根据制造商推荐的方案处理样品。

musc免疫染色：pbs中的20％驴血清/0.3％triton的1小时封闭步骤被用来防止对于所有样品的不需要的一抗结合。应用一抗，并允许其在4℃下于pbs中的20％驴血清/0.3％triton孵育过夜。用0.3％pbst洗涤4次后，加入荧光偶联的二抗，并在室温下于0.3％pbst中孵育1小时。额外漂洗3次后，使用fluoview封固剂封固每个载片。

抗体：在该研究中使用以下抗体。标明每种抗体的来源。小鼠：gfp(invitrogen，#a11122，1:250)；萤光素酶(sigma-aldrich，#l0159，1:200)；胶原i(cedarlanelabs，#cl50151ap，1:200)；hsp47(abcam，#ab77609，1:200)。

成像：使用标准荧光显微镜和10x或20x空气物镜对样品成像。volocity成像软件被用于调整激发和发射滤光片，并带有只要有可能就被使用的预编程的alexafluor滤光设置。在第一轮成像期间优化所有曝光时间，并然后在所有后续成像期间保持恒定。

图像分析：图像j用于通过使用颜色阈值插件创建仅对胶原阳性的区域的蒙版来计算胶原组成的面积百分比。然后将该面积除以使用自由绘图工具发现的样品总面积。所有其他分析均使用volocity软件进行，并使用免费绘图工具手动进行纤维计数，并且还手动进行核、emhc+纤维、肌肉神经接点和血管的计数。

慢病毒转导：将萤光素酶和gfp蛋白报告子亚克隆到第三代hiv-1慢病毒载体(cd51xdps，systembio)中。为了转导新鲜分离的musc，将细胞以30,000-40,000个细胞/孔的密度接种在poly-d-赖氨酸(milliporesigma，a-003-e)和ecm包被的8孔室载片(milliporesigma，pezgs0896)上，并且用每孔5μl浓缩病毒和8μg/ml聚凝胺(santacruzbiotechnology，sc-134220)孵育。将板在25℃下以3200g旋转5分钟，并以2500g旋转1小时。然后将细胞用新鲜培养基洗涤两次，从平板上刮下，并根据实验条件以最终体积重悬。

mitotracker染色和流式细胞仪分析：将进行重编程的musc和对照用纯hamsf10(无血清或pen/strep)洗涤两次。随后，将musc用0.5μm的mitotrackergreenfm(thermofisher，m7514)和dapi在37℃下染色30分钟，用纯hamsf10洗涤3次，并使用bdfacsariaiii流式细胞仪分析。

统计分析：除非另有说明，所有统计分析均使用matlabr2017a(mathworks软件)或graphpadprism5(graphpad软件)进行。对于统计分析，使用t检验。所有误差线均表示s.e.m.；*p<0.05；**p<0.001；***p<0.0001。

尽管已经说明和描述了本公开的优选实施例，但是将理解的是可以在不脱离本公开的精神和范围下在其中进行多种改变。

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p实施方案

实施方案p1.一种使细胞更生的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染所述细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)翻译所述一种或多种非整合型信使rna以在所述细胞中产生所述一种或多种细胞重编程因子，致使所述细胞的瞬时重编程，其中所述细胞被更生而没有去分化为干细胞。

实施方案p2.实施方案p1的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。

实施方案p3.实施方案p2的方法，其中所述细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案p4.实施方案p1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

实施方案p5.实施方案p4的方法，其中所述细胞是人类细胞。

实施方案p6.实施方案p1的方法，其中所述细胞来自老年对象。

实施方案p7.实施方案p1的方法，其中所述细胞是成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞或骨骼肌干细胞。

实施方案p8.实施方案p1的方法，其中所述瞬时重编程致使hp1γ、h3k9me3、层支持蛋白lap2α和sirt1蛋白的表达增加，核折叠减少，起泡减少，细胞自噬体形成增加，糜蛋白酶样蛋白酶体活性升高，线粒体膜电位提高或活性氧簇(ros)减少。

实施方案p9.实施方案p1的方法，其中所述细胞在组织或器官内。

实施方案p10.实施方案p9的方法，其中瞬时重编程减少所述组织或器官内的衰老细胞的数量。

实施方案p11.实施方案p9的方法，其中瞬时重编程减少gmscf、il18和tnfα的表达。

实施方案p12.实施方案p9的方法，其中治疗恢复组织或器官内细胞的功能、增加组织或器官内细胞的潜能、增强组织或器官内细胞的存活能力或增加组织或器官内细胞的复制能力或寿命。

实施方案p13.实施方案p1的方法，其中所述方法在体外、离体或体内进行。

实施方案p14.实施方案p1的方法，其中所述转染以每天一次进行3天或4天。

实施方案p15.一种治疗对象的与年龄相关的疾病或病况的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来在体内或离体转染需要更生的细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，致使所述细胞的瞬时重编程，其中所述细胞被更生而没有去分化为干细胞。

实施方案p16.实施方案p15的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。

实施方案p17.实施方案p16的方法，其中所述细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案p18.实施方案p15的方法，还包括将更生的细胞移植到所述对象中。

实施方案p19.实施方案p15的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病况是变性疾病。

实施方案p20.实施方案p15的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病况是神经变性疾病或肌肉骨胳疾病。

实施方案p21.一种用于治疗对象的涉及软骨变性的疾病或病症的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna在体内或离体转染需要更生的软骨细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述软骨细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，致使所述软骨细胞的瞬时重编程，其中所述软骨细胞被更生而没有去分化为干细胞。

实施方案p22.实施方案p21的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。

实施方案p23.实施方案p22的方法，其中所述细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案p24.实施方案p21的方法，其中所述涉及软骨变性的疾病或病症是关节炎。

实施方案p25.实施方案p24的方法，其中所述关节炎是骨关节炎或类风湿性关节炎。

实施方案p26.实施方案p21的方法，其中治疗减轻所述对象中的炎症。

实施方案p27.实施方案p21的方法，其中所述转染是离体进行的，并且所述更生的软骨细胞被移植到所述对象的关节炎关节中。

实施方案p28.实施方案p27的方法，其中所述软骨细胞是从获自所述对象的软骨样品中分离的。

实施方案p29.实施方案p21的方法，其中治疗降低由软骨细胞的rankl、inos、il6、il8、bdnf、ifnα、ifnγ和lif的表达，并增加由软骨细胞的sox9和col2a1的表达。

实施方案p30.实施方案p21的方法，其中所述对象是老年对象。

实施方案p31.实施方案p21的方法，其中所述对象是哺乳动物对象。

实施方案p32.实施方案p31的方法，其中所述哺乳动物对象是人类对象。

实施方案p33.一种用于在对象中治疗涉及肌肉变性的疾病或病症的方法，所述方法包括：a)用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna在体内或离体转染骨骼肌干细胞，其中所述转染以每天一次进行至少两天且不超过4天；以及b)在所述骨骼肌干细胞中表达所述一种或多种细胞重编程因子，致使所述骨骼肌干细胞的瞬时重编程，其中所述骨骼肌干细胞被更生而不丧失其分化为肌肉细胞的能力。

实施方案p34.实施方案p33的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自由oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog组成的组。

实施方案p35.实施方案p34的方法，其中所述细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案p36.实施方案p33的方法，其中所述转染是离体进行的，并且所述更生的骨骼肌干细胞被移植到所述对象中的需要修复或再生的肌肉中。

实施方案p37.实施方案p33的方法，其中所述骨骼肌干细胞是从获自所述对象的肌肉样品中分离的。

实施方案p38.实施方案p33的方法，其中治疗致使肌纤维的再生。

实施方案p39.实施方案p33的方法，其中治疗恢复骨骼肌干细胞的潜能。

实施方案p40.实施方案p33的方法，其中所述对象是老年对象。

实施方案p41.实施方案p33的方法，其中所述对象是哺乳动物对象。

实施方案p42.实施方案p41的方法，其中所述哺乳动物对象是人类对象。

实施方案

实施方案1.一种使细胞更生的方法，所述方法包括通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染细胞不超过五(5)个连续日，从而产生更生的细胞。

实施方案2.实施方案1的方法，其中所述更生的细胞的转录组谱变得与年轻细胞的转录组谱更相似。

实施方案3.实施方案2的方法，其中所述更生的细胞的转录组谱包括选自rpl37、rhoa、srsf3、ephb4、arhgap18、rpl31、fkbp2、map1lc3b2、elf1、phf8、pol2s2、taf1和sin3a中的一种或多种基因的基因表达增加。

实施方案4.前述实施方案中的任一项的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出一种或多种核和/或表观遗传标志物的基因表达增加。

实施方案5.实施方案4的方法，其中所述标志物选自hp1γ、h3k9me3、层支持蛋白lap2α和sirt1蛋白。

实施方案6.前述实施方案中的任一项的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出蛋白水解活性增加。

实施方案7.实施方案6的方法，其中蛋白水解活性增加以细胞自噬体形成增加、糜蛋白酶样蛋白酶体活性增加或其组合而被测量。

实施方案8.前述实施方案中的任一项的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出改善的线粒体健康和功能。

实施方案9.实施方案8的方法，其中改善的线粒体健康和功能以线粒体膜电位升高、活性氧簇(ros)减少或其组合而被测量。

实施方案10.前述实施方案中的任一项的方法，其中与参考值相比，所述更生的细胞呈现出一种或多种sasp细胞因子的表达减少。

实施方案11.实施方案10的方法，其中所述sasp细胞因子包括il18、il1a、groa、il22和il9的一种或多种。

实施方案12.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述更生的细胞呈现出甲基化谱的逆转。

实施方案13.实施方案12的方法，其中所述甲基化谱的逆转通过horvath钟估计来测量。

实施方案14.实施方案4-13中的任一项的方法，其中所述参考值是从老化的细胞获得的。

实施方案15.前述实施方案中的任一项的方法，其中用信使rna转染所述细胞包括选自以下的方法：lipofectamine和lt-1介导的转染、右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、电穿孔、mrna在脂质体中的包封和直接显微注射。

实施方案16.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案17.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案18.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

实施方案19.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述细胞是人类细胞。

实施方案20.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述细胞来自老年对象。

实施方案21.前述实施方案中的任一项的方法，所述细胞选自成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌干细胞、角质化细胞、间充质干细胞和角膜上皮细胞。

实施方案22.实施方案21的方法，其中所述细胞是间充质干细胞。

实施方案23.实施方案22的方法，其中更生的间充质干细胞呈现出衰老参数(p16、p21和阳性saβgal染色)的降低，细胞增殖增加和/或ros水平降低。

实施方案24.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述方法在体外、离体或体内进行。

实施方案25.实施方案24的方法，其中所述方法在体内进行。

实施方案26.实施方案25的方法，其中所述细胞在组织或器官内。

实施方案27.实施方案25-27中的任一项的方法，其中所述方法减少所述组织或器官内的衰老细胞的数量。

实施方案28.实施方案25-27中的任一项的方法，其中所述方法降低il18、il1a、groa、il22和il9的一种或多种的表达。

实施方案29.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述方法恢复所述细胞的功能、增加所述细胞的潜能、增强所述细胞的存活能力、增加所述细胞的复制能力或寿命，或其组合。

实施方案30.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述转染以每天一次进行5天。

实施方案31.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述转染以每天一次进行4天。

实施方案32.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述转染以每天一次进行3天。

实施方案33.实施方案1-24中的任一项的方法，其中所述转染以每天一次进行2天。

实施方案34.一种用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症、神经变性病症和/或肌肉骨骼功能障碍的方法，所述方法包括施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞包括编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna。

实施方案35.实施方案34的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案36.实施方案34-35中的任一项的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案37.实施方案34-36中的任一项的方法，其中所述对象患有与年龄有关的疾病或病况。

实施方案38.实施方案34的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病况选自眼睛、皮肤或肌肉骨骼功能障碍。

实施方案39.实施方案34-36中的任一项的方法，其中所述对象患有软骨变性病症。

实施方案40.实施方案39的方法，其中所述病症选自关节炎、软骨病、脊柱关节病、强直性脊柱炎、红斑狼疮、复发性多软骨炎和干燥综合征。

实施方案41.实施方案39或40中的任一项的方法，其中治疗降低炎性因子的表达和/或增加atp和胶原代谢。

实施方案42.实施方案41的方法，其中所述炎性因子选自rankl、inos2、il6、ifnα、mcp3和mip1a。

实施方案43.实施方案42的方法，其中atp和胶原代谢通过atp水平增加、ros减少和sod2增加、col2a1增加和由软骨细胞的总体增殖中的一种或多种来测量。

实施方案44.实施方案34-36中的任一项的方法，其中所述对象患有肌肉骨骼功能障碍。

实施方案45.实施方案34-44中的任一项的方法，其中施用治疗有效量的细胞包括注射或外科手术植入。

实施方案46.实施方案34-45中的任一项的方法，其中所述治疗有效量的更生的细胞选自成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌干细胞、角质化细胞、间充质干细胞和角膜上皮细胞。

实施方案47.实施方案46的方法，其中所述治疗有效量的更生的细胞是角膜上皮细胞。

实施方案48.实施方案47的方法，其中所述更生的角膜上皮呈现出衰老参数的降低。

实施方案49.实施方案48的方法，其中所述衰老参数包括p21和p16的表达、线粒体生物发生pgc1α和炎性因子il8的表达中的一种或多种。

实施方案50.一种用于治疗对象的与年龄相关的疾病或病况、软骨变性病症和/或患有肌肉骨骼功能障碍的对象的方法，所述方法包括施用治疗有效量的编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna。

实施方案51.实施方案50的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案52.实施方案50-51-48中的任一项的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子包括oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。

实施方案53.实施方案50-52中的任一项的方法，其中所述对象患有与年龄相关的疾病或病况。

实施方案54.实施方案53的方法，其中所述与年龄相关的疾病或病况选自眼睛、皮肤或肌肉骨骼功能障碍。

实施方案55.实施方案50-52中的任一项的方法，其中所述对象患有软骨变性病症。

实施方案56.实施方案55的方法，其中所述病症选自关节炎、软骨病、脊柱关节病、强直性脊柱炎、红斑狼疮、复发性多软骨炎和干燥综合征。

实施方案57.实施方案50-52中的任一项的方法，其中所述对象是患有肌肉骨骼功能障碍的对象。

实施方案58.实施方案50-57中的任一项的方法，其中施用治疗有效量的一种或多种非整合型信使rna包括直接注射到靶细胞中。

实施方案59.实施方案58的方法，其中所述靶细胞选自上皮细胞、内皮细胞、结缔组织细胞、肌肉细胞和神经系统细胞。

实施方案60.一种离体使工程化的组织更生的方法，所述方法包括通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna来转染所述组织不超过五(5)个连续日，从而产生更生的工程化的组织。

实施方案61.实施方案60的方法，其中所述工程化的组织呈现出衰老参数降低、促炎因子降低、组织学评分改善或其组合。

实施方案62.实施例60或61中的任一项的方法，其中所述工程化的组织是工程化的皮肤组织。

实施方案63.实施方案60-62中的任一项的方法，其中所述衰老参数选自p16和阳性saβgal染色和促炎因子il8和mmp1

实施方案64.实施方案60-63中的任一项的方法，其中所述组织学评分包括形态学、组构和/或质量。

实施方案65.一种包括更生的细胞的药物组合物，其中所述更生的细胞通过用编码一种或多种细胞重编程因子的一种或多种非整合型信使rna转染细胞不超过五(5)个连续日来获得。

实施方案66.前述实施方案中的任一项的方法，其中所述一种或多种细胞重编程因子选自oct4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog

实施方案67.实施方案65或66的组合物，其中所述细胞呈现以下一种或多种：hp1γ、h3k9me3、lap2α、sirt1的表达增加，线粒体膜电位增加和活性氧簇减少，sasp细胞因子的表达减少。

实施方案68.实施方案67的组合物，其中所述sasp细胞因子包括il18、il1a、groa、il22和il9中的一种或多种。

实施方案69.实施方案65-68中的任一项的组合物，还包括选自营养素、细胞因子、生长因子、细胞外基质(ecm)组分、抗生素、抗氧化剂和免疫抑制剂的一种或多种额外的组分。

实施方案70.实施方案65-69中的任一项的组合物，还包括药学上可接受的载体。

实施方案71.实施方案65-70中的任一项的组合物，其中所述细胞是自体的或同种异体的。