1.从通过大规模体外转录过程(ivt)合成的信使rna(mrna)制备物中去除杂质的方法,所述方法包括:
在包含变性盐与还原剂的组合的缓冲液中沉淀所述ivt合成的mrna;
捕获沉淀的mrna;以及
将捕获的mrna溶解于溶液中,从而纯化所述mrna。
2.如权利要求1所述的方法,其还包括在沉淀所述mrna之前使所述mrna加帽和加尾的步骤。
3.如权利要求1所述的方法,其中通过大规模ivt过程获得的mrna制备物中的杂质包括蛋白质、不完全的rna转录物、核苷酸和盐,所述蛋白质包括用于ivt、加帽和加尾的酶。
4.如权利要求1所述的方法,其中通过所述方法获得的纯化的mrna大于合成的mrna的量的至少90%。
5.如权利要求1所述的方法,其中通过所述方法获得的纯化的mrna基本上不含任何酶杂质。
6.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约1mgmrna。
7.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约10gmrna。
8.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约100gmrna。
9.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约1kgmrna。
10.如权利要求1所述的方法,其中用于所述沉淀步骤的缓冲液还包含醇。
11.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(5):(3)的体积比存在的条件下进行。
12.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(3.5):(2.1)的体积比存在的条件下进行。
13.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(2.8):(1.9)的体积比存在的条件下进行。
14.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(2.3):(1.7)的体积比存在的条件下进行。
15.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(2.1):(1.5)的体积比存在的条件下进行。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述变性盐是硫氰酸胍。
17.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以2m或更高、3m或更高、4m或更高、5m或更高、或者6m或更高、7m或更高的最终浓度存在。
18.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以高于至少3m的最终浓度存在。
19.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以高于至少4m的最终浓度存在。
20.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以5m的最终浓度存在。
21.如权利要求1所述的方法,其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(b-me)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、三(3-羟丙基)膦(thpp)、二硫赤藓糖醇(dte)和二硫代丁胺(dtba)。
22.如权利要求1所述的方法,其中所述还原剂是二硫苏糖醇(dtt)。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中dtt以大于1mm且至多约200mm的最终浓度存在。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中dtt以2.5mm至100mm的最终浓度存在。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中dtt以5mm至50mm的最终浓度存在。
26.如权利要求1所述的方法,其中所述dtt的浓度是5mm、10mm、15mm或20mm。
27.如权利要求1所述的方法,其中沉淀所述mrna的步骤进行一次以上。
28.如权利要求1所述的方法,其中沉淀所述mrna的步骤仅进行一次。
29.如权利要求1所述的方法,其中捕获所述mrna的步骤还包括对所述mrna进行过滤、离心、固相可逆吸附或它们的组合。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述过滤是切向流过滤(tff)。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述过滤是深度过滤(df)。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中使用nutsche过滤器进行过滤。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述过滤与离心组合进行。
34.如权利要求1所述的方法,其中溶解所述捕获的mrna的步骤在水溶液中进行。
35.如权利要求1所述的方法,其中所述捕获的mrna的步骤进一步在包含较低盐浓度的合适缓冲液中进行透析。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中基本上不含任何蛋白质杂质是少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、少于1%的蛋白质杂质或者是0%的蛋白质杂质。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纯化的mrna基本上不含盐。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纯化的mrna包含至少大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或约100%的编码蛋白质的全长mrna。