信使RNA纯化的方法和组合物与流程

文档序号:26003813发布日期:2021-07-23 21:21阅读:来源:国知局

技术特征:

1.从通过大规模体外转录过程(ivt)合成的信使rna(mrna)制备物中去除杂质的方法,所述方法包括:

在包含变性盐与还原剂的组合的缓冲液中沉淀所述ivt合成的mrna;

捕获沉淀的mrna;以及

将捕获的mrna溶解于溶液中,从而纯化所述mrna。

2.如权利要求1所述的方法,其还包括在沉淀所述mrna之前使所述mrna加帽和加尾的步骤。

3.如权利要求1所述的方法,其中通过大规模ivt过程获得的mrna制备物中的杂质包括蛋白质、不完全的rna转录物、核苷酸和盐,所述蛋白质包括用于ivt、加帽和加尾的酶。

4.如权利要求1所述的方法,其中通过所述方法获得的纯化的mrna大于合成的mrna的量的至少90%。

5.如权利要求1所述的方法,其中通过所述方法获得的纯化的mrna基本上不含任何酶杂质。

6.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约1mgmrna。

7.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约10gmrna。

8.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约100gmrna。

9.如权利要求1所述的方法,其中在所述ivt反应中合成至少约1kgmrna。

10.如权利要求1所述的方法,其中用于所述沉淀步骤的缓冲液还包含醇。

11.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(5):(3)的体积比存在的条件下进行。

12.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(3.5):(2.1)的体积比存在的条件下进行。

13.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(2.8):(1.9)的体积比存在的条件下进行。

14.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(2.3):(1.7)的体积比存在的条件下进行。

15.如权利要求1所述的方法,其中沉淀在mrna、变性缓冲液和醇以1:(2.1):(1.5)的体积比存在的条件下进行。

16.如权利要求1所述的方法,其中所述变性盐是硫氰酸胍。

17.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以2m或更高、3m或更高、4m或更高、5m或更高、或者6m或更高、7m或更高的最终浓度存在。

18.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以高于至少3m的最终浓度存在。

19.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以高于至少4m的最终浓度存在。

20.如权利要求1所述的方法,其中硫氰酸胍以5m的最终浓度存在。

21.如权利要求1所述的方法,其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(b-me)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、三(3-羟丙基)膦(thpp)、二硫赤藓糖醇(dte)和二硫代丁胺(dtba)。

22.如权利要求1所述的方法,其中所述还原剂是二硫苏糖醇(dtt)。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中dtt以大于1mm且至多约200mm的最终浓度存在。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中dtt以2.5mm至100mm的最终浓度存在。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中dtt以5mm至50mm的最终浓度存在。

26.如权利要求1所述的方法,其中所述dtt的浓度是5mm、10mm、15mm或20mm。

27.如权利要求1所述的方法,其中沉淀所述mrna的步骤进行一次以上。

28.如权利要求1所述的方法,其中沉淀所述mrna的步骤仅进行一次。

29.如权利要求1所述的方法,其中捕获所述mrna的步骤还包括对所述mrna进行过滤、离心、固相可逆吸附或它们的组合。

30.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述过滤是切向流过滤(tff)。

31.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述过滤是深度过滤(df)。

32.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中使用nutsche过滤器进行过滤。

33.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述过滤与离心组合进行。

34.如权利要求1所述的方法,其中溶解所述捕获的mrna的步骤在水溶液中进行。

35.如权利要求1所述的方法,其中所述捕获的mrna的步骤进一步在包含较低盐浓度的合适缓冲液中进行透析。

36.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中基本上不含任何蛋白质杂质是少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、少于1%的蛋白质杂质或者是0%的蛋白质杂质。

37.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纯化的mrna基本上不含盐。

38.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纯化的mrna包含至少大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%或约100%的编码蛋白质的全长mrna。


技术总结
本发明尤其提供用于纯化mRNA的方法,其涉及通过在包含变性盐与还原剂组合的缓冲液中沉淀体外转录过程(IVT)合成的mRNA,然后捕获沉淀的mRNA以及将捕获的mRNA溶解在溶液中以获得纯化的mRNA,从通过大规模IVT合成的信使RNA制备物中去除杂质。

技术研发人员:乔纳森·阿比萨尔;乔雷尔·E·瓦加斯;弗兰克·德罗萨;阿努莎·迪亚斯
受保护的技术使用者:川斯勒佰尔公司
技术研发日:2019.11.08
技术公布日:2021.07.23
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