本发明属于禽用生物制品技术领域，进一步涉及卵黄抗体制备技术，具体涉及一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法。
背景技术：
近两年，非洲猪瘟在全国不少地区冒头的，人们的肉质结构逐渐倾向于家禽，大大促进了家禽养殖的集约化发展，在家禽养殖大幅增长的过程中，各种病毒病的发生几率也日益提升，其预防及治疗迫在眉睫。
鸡新城疫是由副粘病毒引起的高度接触性传染病，呈急性败血症状，常出现呼吸困难、便稀、神经紊乱、黏膜和浆膜出血等症状。对养鸡业危害严重，本病的主要传染源是病鸡和带毒鸡，其分泌物，粪便，以及被污染的饲料、饮水，非易感的野禽、外寄生虫、人畜等均可传播病源，传播途径主要是消化道、呼吸道及损伤的皮肤、黏膜等，一年四季均可发生，在非免疫区或免疫低下的鸡群，一旦有速发型毒株侵入，可迅速传播，呈毁灭性流行鸡新城疫，发病率和死亡率可达90％以上。
禽流感是由禽甲型流感病毒引起的一种急性传染病，发病时，呼吸道症状明显，如咳嗽、喷嚏、啰音、流泪，也可出现下痢、头部水肿或神经错乱，产蛋率显著下降，强毒感染时，突然发病，病程短，死亡率高达100％，产蛋母鸡的卵巢萎缩和输卵管退化或者输卵管、心包囊或腹膜，可见纤维浆性渗出物，肺坚实，是一种今年来高发的人禽共患病毒病。
鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病，以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征。从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果，发病率高达100％，2～3天内可波及60％～70％的鸡，发病后3～4天达到死亡高峰，是造成养殖业经济损失最大的一种家禽病毒病。
鸡马立克氏病是由一种疱疹病毒引起的一种鸡淋巴组织增生性肿瘤病，是其特征为外周神经淋巴样细胞浸润和增大，引起肢(翅)麻痹，以及性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤肿瘤病灶。本病是一种世界性疾病，目前是危害养鸡业健康发展的三大主要疫病之一，引起鸡群较高的发病率和死亡率。
卵黄抗体具有性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点在家禽、家畜传染病的防治中已得到广泛的应用在ph4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右，在诊断、预防和治疗人类和动物各种疾病中具有良好的应用价值。
由于卵黄抗体具备性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点，其制备与应用受到了越来越多的关注，然而现有技术的卵黄抗体普遍为单一抗体类别，仅用于一种疾病的防治，而家禽疫病日益呈现出若干种病原混合感染的现象，传统的单抗效果不佳，于是若要同时实现几种病的防治，多联卵黄抗体的开发即迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，该方法以解决现有技术难以同时实现鸡新城疫、h9亚型禽流感、传染性法氏囊、鸡马立克氏病等多种疾病防治的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是如何降低现有技术中多联卵黄抗体产品中的杂质含量。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：
1)全国范围内选取不同地区发病鸡场的病料，分离制得鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒四种种毒，灭活处理后按一定的体积比混合，制得抗原混合液；
2)向50份聚乙二醇溶液中加入4份蜂胶，边加热边搅拌，至溶解后，依次向其中加入2份黄芪多糖和3份鹰豆芽素a，搅拌均匀后，得到疫苗佐剂；
3)将步骤1)所得的抗原混合液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1～2.5):(1～3)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；
4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，蛋鸡产蛋前15天免疫1次，10天后二免，二免10天后再次加强免疫，病毒达标后，开始收集高免蛋；
5)取步骤4)所得的高免蛋清洗消毒，而后收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60～65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用。
6)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤5)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2～4小时，离心取上清备用；
7)向步骤6)分离的上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，充分搅拌，室温放置2～6小时后，以4200～5500r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱进行浓缩3～4倍后再用naoh调整ph值为6.8～7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
8)取步骤7)所述滤液，而后按终浓度0.1％(v/v)加入甲醛，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2～8℃保存，即得到所述一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体。
作为优选，步骤1)中灭活的病毒毒液是通过以下方法制备的：将4种毒种分别用灭菌生理盐水稀释103～104倍，经尿囊腔接种10～11日龄spf鸡胚，每胚0.1～0.2ml，封孔后，置36～37℃继续孵育120小时；接种后24小时照胚，弃去24小时前的死胚，之后每4小时照胚一次，24～120小时死亡的鸡胚随时取出，置于2～8℃冷却12～24小时；将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集典型病变鸡胚的尿囊液和胎儿。收集时逐个检查胚胎病变，凡胎儿腐败、胚液浑浊，或胎儿新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒所引起的特征性病变者，弃去不用。若干枚鸡胚的尿囊液和胎儿混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以4200r/min离心30分钟，取上清液置于灭菌容器内灭菌，即得病毒液，置-20℃保存备用。
作为优选，步骤4)所述病毒达标是指母鸡血清中新城疫抗体血凝抑制效价≥211、h9亚型流感抗体血凝抑制效价≥212、马立克氏病毒抗体血凝抑制效价≥210、法氏囊抗体琼扩效价≥1:256时；
作为优选，步骤5)种所述的清洗消毒高免蛋和收集发卵黄的方法为：取步骤4)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。
作为优选，步骤6)中所述的酸化用水的制备方法为：预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备，稀释调制ph值5.0后冷却至4℃。
本发明的优点及有益效果是：
本发明提供了一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，该技术方案可以实现同时对家禽养殖中鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒等多种病原进行免疫应答，采用了中药免疫佐剂，可高效刺激免疫反应，相比化学试剂佐剂应激性小，为卵黄抗体的临床应用奠定了基础。
本发明所提供的用于鸡病毒病的多联卵黄抗体采取了分级超滤浓缩的纯化除杂工艺，尤其是利用截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱，提升了抗体纯度降低了大分子杂质，降低了产品临床应用不良反应的发生率。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所涉及的鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒四种毒株均为市场病例野毒中分离得到。
本发明中的黄芪多糖以及鹰豆芽素a均可以在市场上购买得到。
实施例1鸡病毒病的多联精制卵黄抗体的制备
(1)灭活病毒疫苗的制备
①灭活抗原病毒混合液的制备
全国范围内选取不同地区发病鸡场的病料，分离制得鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒4种种毒；将4种毒种分别用灭菌生理盐水稀释103倍，经尿囊腔接种10～11日龄spf鸡胚，每胚0.1ml，封孔后，置36℃继续孵育120小时；接种后24小时照胚，弃去24小时前的死胚，之后每4小时照胚一次，24小时死亡的鸡胚随时取出，置于2～8℃冷却12小时；将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集典型病变鸡胚的尿囊液和胎儿。收集时逐个检查胚胎病变，凡胎儿腐败、胚液浑浊，或胎儿新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒所引起的特征性病变者，弃去不用。若干枚鸡胚的尿囊液和胎儿混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以4200r/min离心30分钟，取上清液置于灭菌容器内灭菌，即得病毒液，置-20℃保存备用；
②疫苗佐剂的制备
向50份聚乙二醇溶液中加入4份蜂胶，边加热边搅拌，至溶解后，依次向其中加入2份黄芪多糖和3份鹰豆芽素a，搅拌均匀后，得到疫苗佐剂；
③灭活多联病毒疫苗的制备
将步骤(1)-①灭活抗原病毒混合液和步骤(1)-②中疫苗佐剂以1～:1(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；
(2)制备高免鸡蛋
选择健康高产蛋鸡，将步骤(1)制备的灭活病毒多联疫苗免疫健康高产蛋鸡，蛋鸡开产前15天免疫1次，10天后二免，二免10天后再次加强免疫，至母鸡血清中新城疫抗体血凝抑制效价≥211、h9亚型流感抗体血凝抑制效价≥212、马立克氏病毒抗体血凝抑制效价≥210、法氏囊抗体琼扩效价≥1:256时，开始收集高免蛋，即为多联卵黄抗体的高免蛋；
(3)制备多联精制卵黄抗体
①分离蛋清蛋黄
将上述步骤(2)制备的高免鸡蛋用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆；
②抗体提取及纯化
向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后取1份步骤(3)-①所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2小时，离心取上清液，并向上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，充分搅拌，室温放置2小时后，以4200r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱进行浓缩3倍后再用naoh调整ph值为6.8，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
③制备精制卵黄抗体
取(3)-②所述滤液，而后按终浓度0.1％(v/v)加入甲醛，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，检验合格，2～8℃保存，即得到所述一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体。
实施例2：多联精制卵黄抗体效力检验
1、试验方法
用4～7日龄spf鸡105只，随机分为a/b/c/d/e/f/g7组，每组15只。a组为本发明治疗组(注射1ml本发明)，b/c/d/e组均为普通抗体治疗组(注射1ml普通单抗体)，f组为不治疗攻毒组(注射1ml生理盐水)，g组为空白对照组(不注射任何药品不攻毒)，7组隔离饲养。连续观察10日，记录发病情况如下表。
表本发明效力检测结果
2、试验结果分析
观察期内，不治疗组和普通单抗治疗组肉鸡均出现了家禽病毒病疾病症状，死亡率40％-60％，本发明治疗组肉鸡全部健活，观察期结束后对死亡和不死亡的肉鸡全部进行剖检，治疗组和不治疗不攻毒组组织器官和体重均正常，可见本发明可有效治疗鸡新城疫、禽流感、鸡传染性法氏囊病和鸡马立克氏病的混合感染。
实施例3
一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：
1)全国范围内选取不同地区发病鸡场的病料，分离制得鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒四种种毒，灭活处理后按一定的体积比混合，制得抗原混合液；
2)向50份聚乙二醇溶液中加入4份蜂胶，边加热边搅拌，至溶解后，依次向其中加入2份黄芪多糖和3份鹰豆芽素a，搅拌均匀后，得到疫苗佐剂；
3)将步骤1)所得的抗原混合液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1～2.5)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；
4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，蛋鸡产蛋前15天免疫1次，10天后二免，二免10天后再次加强免疫，病毒达标后，开始收集高免蛋；
5)取步骤4)所得的高免蛋清洗消毒，而后收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用。
6)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤5)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2小时，离心取上清备用；
7)向步骤6)分离的上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，充分搅拌，室温放置2小时后，以4200r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍后再用naoh调整ph值为6.8，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
8)取步骤7)所述滤液，而后按终浓度0.1％(v/v)加入甲醛，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2℃保存，即得到所述一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中灭活的病毒毒液是通过以下方法制备的：将4种毒种分别用灭菌生理盐水稀释103～104倍，经尿囊腔接种10～11日龄spf鸡胚，每胚0.1ml，封孔后，置36℃继续孵育120小时；接种后24小时照胚，弃去24小时前的死胚，之后每4小时照胚一次，120小时死亡的鸡胚随时取出，置于2℃冷却12小时；将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集典型病变鸡胚的尿囊液和胎儿。收集时逐个检查胚胎病变，凡胎儿腐败、胚液浑浊，或胎儿新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒所引起的特征性病变者，弃去不用。若干枚鸡胚的尿囊液和胎儿混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以4200r/min离心30分钟，取上清液置于灭菌容器内灭菌，即得病毒液，置-20℃保存备用。
步骤4)所述病毒达标是指母鸡血清中新城疫抗体血凝抑制效价≥211、h9亚型流感抗体血凝抑制效价≥212、马立克氏病毒抗体血凝抑制效价≥210、法氏囊抗体琼扩效价≥1:256时；
步骤5)种所述的清洗消毒高免蛋和收集发卵黄的方法为：取步骤4)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。
步骤6)中所述的酸化用水的制备方法为：预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备，稀释调制ph值5.0后冷却至4℃。
实施例4
一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：
1)全国范围内选取不同地区发病鸡场的病料，分离制得鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒四种种毒，灭活处理后按一定的体积比混合，制得抗原混合液；
2)向50份聚乙二醇溶液中加入4份蜂胶，边加热边搅拌，至溶解后，依次向其中加入2份黄芪多糖和3份鹰豆芽素a，搅拌均匀后，得到疫苗佐剂；
3)将步骤1)所得的抗原混合液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1：3)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；
4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，蛋鸡产蛋前15天免疫1次，10天后二免，二免10天后再次加强免疫，病毒达标后，开始收集高免蛋；
5)取步骤4)所得的高免蛋清洗消毒，而后收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用。
6)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤5)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置4小时，离心取上清备用；
7)向步骤6)分离的上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，充分搅拌，室温放置6小时后，以4200r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kd的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍后再用naoh调整ph值为7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
8)取步骤7)所述滤液，而后按终浓度0.1％(v/v)加入甲醛，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2～8℃保存，即得到所述一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中灭活的病毒毒液是通过以下方法制备的：将4种毒种分别用灭菌生理盐水稀释104倍，经尿囊腔接种10～11日龄spf鸡胚，每胚0.1ml，封孔后，置37℃继续孵育120小时；接种后24小时照胚，弃去24小时前的死胚，之后每4小时照胚一次，120小时死亡的鸡胚随时取出，置于8℃冷却24小时；将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集典型病变鸡胚的尿囊液和胎儿。收集时逐个检查胚胎病变，凡胎儿腐败、胚液浑浊，或胎儿新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒所引起的特征性病变者，弃去不用。若干枚鸡胚的尿囊液和胎儿混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以5500r/min离心30分钟，取上清液置于灭菌容器内灭菌，即得病毒液，置-20℃保存备用。
步骤4)所述病毒达标是指母鸡血清中新城疫抗体血凝抑制效价≥211、h9亚型流感抗体血凝抑制效价≥212、马立克氏病毒抗体血凝抑制效价≥210、法氏囊抗体琼扩效价≥1:256时；
步骤5)种所述的清洗消毒高免蛋和收集发卵黄的方法为：取步骤4)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。
步骤6)中所述的酸化用水的制备方法为：预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备，稀释调制ph值5.0后冷却至4℃。