抗HPV31L1的单克隆中和抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗体药物
技术领域：
，尤其涉及抗hpv31l1的单克隆中和抗体及其应用。
背景技术：
：人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，简称hpv)是球形、双链dna病毒，病毒颗粒直径为55～60nm，核衣壳呈20面体对称，由72个主要衣壳蛋白l1的五聚体及次要衣壳蛋白l2组成。主要侵及人的上皮组织和细胞，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，进而诱发各种良、恶性增生病变。高危型hpv感染与多种恶性肿瘤的发生相关，低危型的hpv感染则引起肛门和生殖器疣。高危型hpv包括16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等，可导致宫颈上皮内瘤样病变(cin)和宫颈癌的发生，其中hpv16、hpv18作为最常见的致癌型别，其单克隆抗体研究的比较多，如中国发明专利：一种抗hpv16l1蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用(公开号cn105367652b)、一种可特异性识别hpv18l1蛋白的单克隆抗体及其应用(公开号cn108276491a)。我国新疆37722例女性样本中，hpv阳性率为14.02％，其中最常见的型别为hpv16(3.79％)，hpv52(2.47％)，hpv58(1.76％)，hpv53(1.35％)，hpv31(0.72％)；国家肿瘤医院一项研究表明，宫颈鳞癌中，最常见的高危hpv型别为：hpv16(69.5％)，hpv18(5.6％)，hpv58(2.2％)，hpv31(1.9％)，hpv52(1.4％)和hpv33(1.3％)；青岛中心医院和青岛肿瘤医院，共1664例患者，包括cin、scc、腺癌，在cin1-3、scc中，hpv16、52、31、33、58、51发生较多；我国湖南省1336例浸润性宫颈癌患者，最常见的hpv型别为：hpv16(50.6％)，hpv58(12.4％)，hpv52(10.9％)，hpv18(7.3％)，hpv33(5.5％)，hpv59(4.2％)，hpv39(4.0％)，hpv61(3.4％)，hpv31(3.3％)，hpv56(3.2％)。以上数据显示，无论是从hpv感染率，还是引起宫颈病变的比例，hpv31都是宫颈癌患者中常见的hpv型别之一，但目前其单克隆抗体的研究极少，这限制了利用单克隆抗体检测hpv31病毒、以及hpv31病毒的治疗。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗hpv31l1的单克隆中和抗体及其应用，该单克隆中和抗体可广泛应用于临床样本中hpv31病毒的感染检测，且能够用于hpv31感染患者的治疗。本发明提供的单克隆抗体，其重链的cdr区中至少一个的氨基酸序列具有如seqidno：1、2或3所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同一性的序列；其轻链的cdr区中至少一个的氨基酸序列具有如seqidno：4、5或6所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同一性的序列。本发明中，所述重链包含三个cdr区，所述cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno：1、2和3所示的氨基酸序列；所述轻链包含三个cdr区，所述cdr区的氨基酸序列分别具有如seqidno：4、5和6所示的氨基酸序列。其中，seqidno：1所示的序列为gysdtseyqwn；seqidno：2所示的序列为yiiysgstqyppsl；seqidno：3所示的序列为drqdgpsfsamly；seqidno：4所示的序列为kysqdlnkqtg；seqidno：5所示的序列为yaqplyp；seqidno：6所示的序列为lpydmlit；本发明中，所述单克隆抗体中，其重链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seqidno：7、8、9或10所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列；其轻链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seqidno：11、12、13或14所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列。本发明中，所述单克隆抗体中，所述重链的4个fr区的氨基酸序列分别具有如seqidno：7、8、9和10所示的氨基酸序列；所述轻链的4个fr区的氨基酸序列分别具有如seqidno：11、12、13和14所示的氨基酸序列。本发明中，所述与具有至少80％序列同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。本本发明实施例中，所述单克隆抗体的重链可变区包含seqidno：1、2或3所示的cdr区和seqidno：7、8、9和10所示的fr区。本本发明实施例中，所述单克隆抗体的轻链可变区包含seqidno：4、5或6所示的cdr区和seqidno：11、12、13和14所示的fr区。一些实施例中，所述单克隆抗体的重链可变区依次包含seqidno：7、seqidno：1、seqidno：8、seqidno：2、seqidno：9、seqidno：3、seqidno：10；一些实施例中，所述单克隆抗体的轻链可变区依次包含seqidno：11、seqidno：4、seqidno：12、seqidno：5、seqidno：13、seqidno：6、seqidno：14。在一些具体实施例中，所述单克隆抗体的重链可变区具有如seqidno：15中任一项所示的氨基酸序列；轻链可变区具有如seqidno：16中任一项所示的氨基酸序列。在本发明中，所述单克隆抗体的重链恒定区为igg2a型，轻链恒定区为λ型。具体实施例中，所述单克隆抗体由保藏编号为cgmccno.19288的杂交瘤细胞株产生。本发明提供的单克隆抗体，其是以hpv31l1蛋白包被而成假病毒颗粒(vlp)作为免疫原，免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合，筛选得到能持续、稳定分泌抗hpv31的杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体。本发明获得的单克隆抗体具有良好的灵敏度和特异性，实验表明，该单克隆抗体与hpv31vlp的ic90低至2ng/ml，与测试的其它10个型别(hpv6、11、16、18、33、45、52、58、59、68)均没有交叉反应。因此，该抗体可应用于hpv31型的临床诊断以及hpv31型病毒感染的治疗或预防。本发明还提供了编码所述单克隆抗体或其功能性片段的多核苷酸。所述功能性片段包括重链的cdr区中至少一种，或轻链的cdr区中至少一种。具体的，编码seqidno：1所示cdr区的多核苷酸序列如seqidno：17所示；编码seqidno：2所示cdr区的多核苷酸序列如seqidno：18所示；编码seqidno：3所示cdr区的多核苷酸序列如seqidno：19所示；编码seqidno：4所示cdr区的多核苷酸序列如seqidno：20所示；编码seqidno：5所示cdr区的多核苷酸序列如seqidno：21所示；编码seqidno：6所示cdr区的多核苷酸序列如seqidno：22所示；一些具体实施例中，本发明提供的编码所述单克隆抗体重链可变区的多核苷酸序列如seqidno：23所示。本发明提供的编码所述单克隆抗体轻链可变区的多核苷酸序列如seqidno：24所示。在本发明的一些具体实施方案中，所述seqidno：17～24中任一项所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。本发明还提供了一种核酸载体，包括编码所述的单克隆抗体或其功能性片段的核苷酸。本发明还提供了含有所述的核酸载体的重组宿主。本发明所述的核酸载体能够在宿主体内表达产生所述抗体，该宿主在本发明中称为重组宿主。所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。本发明提供了两种所述单克隆抗体的制备方法，其一为：培养本发明所述的重组宿主，诱导所述单克隆抗体的表达；其二为：培养保藏编号为cgmccno.19288的杂交瘤细胞株，获得所述单克隆抗体。本发明还提供了经化学标记或生物标记的所述的单克隆抗体。所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、pap、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。本发明所述单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。所述固相介质或半固体介质是指本发明所述的单克隆抗体、经标记的单克隆抗体能够附着至其上的任何支持物，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、ipdms芯片、微孔板、聚苯乙烯平板、微粒、微载体、凝胶等。本发明所述的单克隆抗体、经标记的单克隆抗体和/或所述的偶联物在制备检测hpv31型的产品中的应用。所述hpv31型检测产品可作为hpv31病毒感染的辅助诊断工具，例如，其可为试剂组合或试剂盒。本发明研究表明，利用本发明提供的抗hpv31l1的单克隆中和抗体，采用间接elisa法、双抗夹心elisa法或免疫印迹法等，能检测hpv31l1/vlp/病毒。本发明还提供了检测hpv31的试剂盒，其包括所述单克隆抗体、经标记的单克隆抗体和/或所述的偶联物。一种hpv31感染的诊断方法，以本发明提供的试剂盒进行检测。一些实施例中，提供了间接elisa法检测hpv31的试剂盒，其中包括：本发明所述单克隆抗体。还包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、洗涤液、发光底物和终止液。其中，包被液为0.01m的ph为9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液为含有2％bsa的0.01m的ph为7.2的pbs缓冲液；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠igm；洗涤液为含有0.05％tween20的0.01m的ph为7.4的pbs缓冲液；发光底物tmb，终止液为2mh2so4。在此实施例中，hpv31感染的诊断方法为间接法。具体包括：将样本以包被液稀释后包被于酶标板，经洗涤后进行封闭，然后加入本发明所述单克隆抗体经孵育后，依次与酶标二抗、发光底物反应，终止反应后测定od450nm值。一些实施例中，提供了双抗夹心法elisa法检测hpv31的试剂盒，其中包括：抗hpv31vlp的多克隆抗体和本发明所述的单克隆抗体。还包括：酶标板、包被液、封闭液、洗涤液、发光底物和终止液。在此实施例中，对hpv31感染的诊断方法为双抗夹心法elisa法。一些实施例中，提供了免疫印迹法检测hpv31的试剂盒，其中包括本发明所述的单克隆抗体，还包括pvdf膜，封闭液、tbst、酶标二抗和ecl。具体的，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igm。在此实施例中，对hpv31感染的诊断方法为免疫印迹法。本发明所述的单克隆抗体、经标记的单克隆抗体和/或所述的偶联物在制备抗hpv31型病毒感染的制剂中的应用。本发明所述的单克隆抗体、经标记的单克隆抗体和/或所述的偶联物在制备防治肿瘤和/或疣的制剂中的应用。所述肿瘤细胞为宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌、阴茎癌、前列腺癌或膀胱癌；所述疣为生殖器疣、扁平疣或寻常疣。本发明还提供了一种药物或疫苗，其包括本发明所述的单克隆抗体、经标记的单克隆抗体和/或所述偶联物。所述药物的剂型为阴道凝胶、阴道清洗液、外用洗液、阴道栓剂、冻干粉或阴道泡腾片。一些实施例中，所述药物剂型为阴道凝胶，其包括本发明所述的单克隆中和抗体和辅料，所述辅料包括：依地酸二钠、卡波姆974p、聚卡波非aa-1、甘油，苯甲醇或三乙醇胺。一些实施例中，所述药物剂型为阴道清洗液，其包括本发明所述的单克隆中和抗体和辅料，所述辅料包括：甘油和生理盐水。一些实施例中，所述药物剂型为外用洗液，其包括本发明所述的单克隆中和抗体和辅料，所述辅料包括：甘油、纯化水、乙醇和发泡剂。还可以包括香精。一些实施例中，所述药物剂型为阴道栓剂，其包括本发明所述的单克隆中和抗体和辅料，所述辅料包括：纯化水、明胶、甘油和甘露醇。一些实施例中，所述药物剂型为冻干粉，其包括本发明所述的单克隆中和抗体和辅料，所述辅料包括：牛血清白蛋白和海藻糖。一些实施例中，所述药物剂型为阴道泡腾片，其包括本发明所述的单克隆中和抗体和辅料，所述辅料包括：碳酸氢钠、含有20％peg6000的乙醇溶液、柠檬酸、维生素c、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁。本发明还提供了一种hpv31感染的防治方法，给予本发明所述的药物或疫苗。本发明提供了抗hpv31l1的特异性的单克隆中和抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系，利用其中的一株中和活性效价最高的单克隆中和抗体，采用间接elisa法、双抗夹心elisa法、免疫杂交法等，可广泛应用于临床样本中hpv31病毒的感染检测；利用其中的一株中和活性效价最高的单克隆中和抗体，制备成阴道凝胶、阴道清洗液、外用洗液、阴道栓剂、冻干粉、阴道泡腾片等，用于hpv31感染患者的治疗，能有效提高hpv31患者的临床转阴率。本发明对女性的健康发展和公共卫生防控均具有重要的意义。附图说明图1示抗体纯化效果(m：分子量marker；1：变性后抗体；2：抗体)。生物保藏说明生物材料：31-2g7，分类命名：杂交瘤细胞，于2020年1月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.19288。具体实施方式本发明提供了抗hpv31l1的单克隆中和抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。抗体重链或轻链的“可变区”是该链的n端成熟区域，可变区的氨基酸组成和排列随抗体特异性的不同而有所变化。在可变区某些特定区域的氨基酸残基显示出更大的变异性，称为超变区，超变区是ig与抗原决定簇发生特异性结合的部位，故又称为互补决定区，即cdr区，而可变区的其他部位称为骨架区，其结构相对稳定。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(igg1，igg2，igg3，igg4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kda或大约214个氨基酸)包含一个由nh2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个cooh-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kda或大约450～550个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于fab，fv，scfv和fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。本发明中，所述“多核苷酸”是指有多个核苷酸聚合形成的生物大分子化合物，所述核苷酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸以及它们的修饰物，包括双链或单链的dna、cdna、rna、mrna等，其可为环状也可为线性，也可为环状载体中的一部分或基因组中的一个片段。本发明中，所述“核酸载体”是指重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，质粒整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。本发明中，“宿主细胞”一般为含有核酸载体和/或感兴趣基因的原核或真核宿主。用使用重组dna技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。所述“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。本发明中，所述检测hpv31型病毒通过免疫学检测的方法。所述免疫学检测是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对定性、定量或定位研究细胞内抗原(多肽和蛋白质)，或抗体的技术，这样的技术包括但不限于酶联免疫分析法(间接、直接或双抗体夹心法)、免疫荧光、放射免疫分析法、免疫印迹、免疫组化、免疫共沉淀、染色质共沉淀等。本发明所述药物中含有至少一种功能成分，还包括可药用的载体。所述功能成分包括本发明提供的抗体。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如pbs(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1、杂交瘤细胞的建立1.动物免疫利用大肠杆菌表达系统，制备hpv31型的l1蛋白的病毒包装颗粒，作为抗原，首次免疫将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只balb/c小鼠每次注射量为100μg，免疫3只小鼠；并与首次免疫的第7天、第14天、21天，采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液，进行加强免疫，第14天经小鼠尾静脉采血，分离血清，利用间接elisa方法检测抗体效价，小鼠血清抗体效价分别为＞1∶32000、1∶8000、1∶16000，选择效价最高的1号小鼠用于融合。间接elisa法的操作步骤如下：用200ng/孔的hpv31vlp包板，阴性对照(nc)孔加入含5％脱脂奶粉的pbs溶液100μl，4℃过夜；弃去孔中液体，pbs洗板3次，加入含5％脱脂奶粉的pbs溶液，200μl/孔，室温封闭1小时；弃去孔中液体，pbs洗板1次，加入一抗(尾血从1∶500至1∶32000进行2倍梯度稀释；杂交瘤细胞培养上清1∶1稀释；小鼠腹水从1∶1000至1∶100万进行10倍梯度稀释；纯化抗体1μg/ml至0.0005μg/ml进行2倍梯度稀释)，室温孵育1小时；弃去孔中液体，pbs洗板3次，加入hrp偶联的羊抗鼠iggfc(1∶2000倍稀释)，室温孵育1小时；pbs洗板5次，加入底物a和b液，50μl/孔，室温避光反应30min；加入1mol/l硫酸终止反应，上酶标仪测定a450值。凡a450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性。2.杂交瘤细胞的制备及筛选取抗体效价最高的1号小鼠用于融合。融合前3天用与福氏不完全佐剂混合的免疫原进行加强免疫。按常规方法收集小鼠的脾细胞与sp2/0细胞按5∶1的比例以500g/l的peg4000进行融合。用hat培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接elisa法筛选阳性杂交瘤细胞株。从384株细胞株中筛选到148株阳性细胞株，选择活性较高的96株细胞株，经过10代培养，挑选能够稳定分泌抗hpv31l1-vlp抗体的细胞株共计7株，间接elisa结果见表1所示。表1稳定分泌hpv31l1-vlp抗体的细胞株上清液间接elisa检测结果克隆号1b101d32a52g73c124c84h11阴性a4501.6741.3891.7561.9781.4581.8731.4880.0363.杂交瘤细胞分泌上清液中抗体特异性检测利用间接elisa法，包被抗原分别为hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58、59、68的l1vlp蛋白，100ng/孔。对上述5株杂交瘤细胞分泌在细胞上清液的抗体进行检测，结果显示1d3、2g7、4h11这三株杂交瘤细胞仅对hpv31l1-vlp蛋白反应为阳性，对其他型别的hpv检测结果均为阴性，确定该3株杂交瘤细胞为型别特异性抗体。综合表1和表2检测结果，选择效价最高的特异性抗体2g7，进行后续的研发。表2：杂交瘤细胞分泌上清液中抗体特异性检测结果克隆号1b101d32a52g73c124c84h116l1vlp-------11l1vlp-----+-16l1vlp--+----18l1vlp-------31l1vlp+++++++33l1vlp+---+--45l1vlp-------52l1vlp-------58l1vlp-------59l1vlp-------68l1vlp-------实施例2：单克隆抗体的制备和鉴定1.小鼠腹水制备抗hpv31l1的单克隆抗体选择成年balb/c小鼠，腹腔接种杂交瘤细胞31-2g7，每只小鼠1×106-2×106个，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水。将腹水离心(13000r/min30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，用proteing亲和柱纯化抗体，按间接elisa法检测腹水和纯化抗体效价，结果表明，腹水稀释10万倍为阳性，纯化抗体稀释到1ng/ml仍为阳性。2.抗体的纯度测定将纯化后的抗体进行12％sds-page电泳，结果表明纯度在95％以上，见图1所示，其中1.变性后抗体为轻链和重链两条带，2.抗体为单一条带。3.抗体的亚型鉴定采用间接elisa法，使用各种抗小鼠免疫球蛋白亚型(igg1、igg2a、igg2b、igg3、iga、igm)的抗体，鉴定杂交瘤细胞31-2g7产生的抗体的亚型，结果表明为igg2a亚型。4.抗体轻链及重链可变区序列测定提取31-2g7杂交瘤细胞的mrna，反转录为cdna，使用可变区通用引物进行高保真pcr扩增，将pcr产物片段插入到t载体内进行dna序列测定，31-2g7的可变区基因序列：重链如seqidno.23所示，轻链如seqidno.24所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。31-2g7的可变区氨基酸序列：重链可变区如seqidno.15所示，轻链可变区如seqidno.16所示。利用上述鉴定的序列，通过已知的抗体工程技术，可以制备各种基因工程抗体，例如重组抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双抗体等，并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特性。实施例3：抗体中和活性检测通过假病毒-细胞中和模型，检测抗体的中和活性能力。先将抗体用pbs稀释成1000ng/ml，然后将抗体进行2倍比梯度稀释到0.06ng/ml，取50μl各浓度抗体与50μl合适浓度的hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58、59、68假病毒在96孔板中4℃孵育一小时，并设定阴性血清对照、阳性血清对照、细胞对照和假病毒对照。然后将各混合液分别加入预先铺有293ft细胞的96孔板中在细胞培养箱中培养72小时。之后观察荧光情况，收集细胞用流式细胞术检测荧光，若有抑制作用，按照荧光抑制率＝(1-实验组/对照组)×100％，计算荧光抑制率，将荧光抑制率大于50％和90％分别作为该单抗对假病毒的中和滴度。结果表明，抗体仅对hpv31假病毒有抑制作用，50％抑制率浓度为0.5ng/ml，90％抑制率浓度为2ng/ml；对hpv6、11、16、18、33、45、52、58、59、68假病毒均没有抑制作用。表明抗体31-2g7为效价高、特异性好的hpv31病毒中和抗体。实施例4：单克隆抗体31-2g7在hpv31病毒诊断的应用利用实施例2得到的单克隆抗体31-2g7，可利用间接elisa法、双抗夹心elisa法、免疫印迹法等，用于检测样本中的hpv31l1/vlp/病毒含量。1.间接elisa法测定样品中的hpv31l1/vlp/病毒含量(1)将检测样本适当稀释于0.01mph9.6碳酸盐缓冲液包被液中，100μl/孔，同时设置复孔，另设样品稀释液为阴性对照孔、不同浓度的标准品为阳性对照孔，盖上封板膜室温孵育2h或4℃包被过夜。(2)倒空液体并拍干残留液体，用0.01mph7.4pbs-tween20洗液洗板三次。(3)用2％bsa-0.01mph7.2的pbs封闭1小时。(4)同上洗板3次。(5)加入1∶100倍比稀释的单克隆抗体31-2g7，0.1ml/孔，室温反应2小时。(6)同上洗板3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠igm，0.1ml/孔，室温反应1小时。(7)用洗涤液浸泡板5min后，同上洗板3次后，加入底物(3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺，tmb)室温避光反应5～10分钟。(9)2mh2so4终止反应，450nm测定其od值。(10)根据检测数据，对照标准曲线，确定样品中的hpv31l1/vlp/病毒含量。2.双抗夹心法elisa测定样品中的hpv31vlp/病毒含量将单克隆抗体31-2g7作为捕获抗体，制备可特异性识别hpv31vlp/病毒的检测抗体，配备本领域已知其他相关检测试剂，利用双抗夹心法elisa测定样品中的hpv31vlp/病毒含量。其中可特异性识别hpv31vlp/病毒的检测抗体制备方法：使用hpv31l1-vlp免疫新西兰大白兔，制备抗hpv31l1-vlp的多克隆抗体。具体方法如下：在第0周进行初免，每只取500μl0.2mg/ml的hpv31l1-vlp溶液与500μl弗氏完全佐剂进行充分乳化，形成油包水的乳浊液，进行多点背部皮下注射免疫，免疫2只新西兰大白兔。分别在第2周、5周、8周、11周加强免疫4次，每次每只免疫500μl0.2mg/ml的hpv31vlp溶液与500μl弗氏不完全佐剂的乳浊液；第6周、9周、12周采血检测。间接elisa结果显示，hpv31l1-vlp免疫的两只新西兰大白兔5免后均能诱导出高达1.0x107稀释倍数的高效价抗血清，该多克隆血清经过纯化，作为检测试剂开发中的检测抗体，命名为pab-31。结合本领域已知其他相关检测试剂，经过条件摸索和优化，我们利用单克隆抗体31-2g7作为捕获抗体以及pab-31作为检测抗体构建了elisa的试剂盒。通过病人样本检测，我们发现该双抗夹心elisa检测试剂盒不识别其它hpv高危亚型(像hpv16、hpv18、hpv26、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73、hpv82)的病人样本，只特异性识别hpv31病人样本。由此可见，该elisa可用于hpv31感染的临床快速检测。3.免疫印迹法检测样本中hpv31l1蛋白单克隆抗体31-2g7作为一抗，利用免疫印迹法westernblotting，检测样本中的hpv31l1蛋白，具体步骤如下：(1)sds聚丙烯酰胺凝胶电泳：方法参见f.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社1998)。采用10％分离胶和5％浓缩胶，电泳条件为电压150v，溴酚蓝染料带距离胶底边1.5cm左右终止电泳。(2)电转移：方法参见f.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社1998)。用电转移方式将其转移至pvdf(0.45μm)膜上。(3)免疫印迹：电转膜结束后，膜在5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭1小时后，用本发明制备的单抗(1μg/ml)作为一抗，室温孵育2小时或4℃反应过夜，用tbst(tbs加入0.5％tween-20)洗涤3次，每次10min。(4)以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igm作为二抗，室温反应2h，用上述方法洗涤后用ecl作用1min，于全自动化学发光成像仪(bio-radversadoc5000mp)曝光成像。实施例5：预防或治疗hpv31病毒感染的制剂利用实施例2得到的单克隆中和抗体31-2g7，制成阴道凝胶、阴道清洗液、外用洗液、阴道栓剂、冻干粉、阴道泡腾片等，用于hpv31病毒感染的预防和治疗。1.单克隆中和抗体31-2g7阴道凝胶的配制按照以下比例和工艺配制hpv阴道凝胶：纯化水中加入依地酸二钠(0.2wt％～0.8wt％)、卡波姆974p(0.5wt％～1.5wt％)、聚卡波非aa-1(0.1wt％～0.3wt％)、甘油(4wt％～8wt％)，加热搅拌均匀并充分溶胀，待冷却至室温时，加入苯甲醇(1wt％～7wt％)、抗hpv31l1单克隆中和抗体31-2g7(终浓度为5ng/ml)充分搅拌均匀，最后加入三乙醇胺(0.6wt％～1.0wt％)，边加入边搅拌，使成为均质凝胶。将上述制得的hpv阴道凝胶，3ml/支装入一次性阴道洗涤器。本品用于hpv31病毒阳性的女性阴道/生殖道使用。凝胶中的单克隆中和抗体31-2g7与hpv31病毒特异性结合，有效阻断hpv31病毒的进一步感染，并在卡波姆凝胶的包裹下，将hpv31病毒排出体内，达到转阴目的。2.单克隆中和抗体31-2g7阴道清洗液的配制按照以下比例和工艺配制阴道清洗液：将甘油(4wt％～8wt％)、抗hpv31l1单克隆中和抗体31-2g7(终浓度为10ng/ml)充分溶于生理盐水中，过滤除菌，3ml/支装入一次性阴道清洗装置。本品用于hpv31病毒阳性的女性阴道/生殖道清洗。洗液中的单克隆中和抗体31-2g7与hpv31病毒特异性结合，有效阻断hpv31病毒的进一步感染，并将hpv31病毒排出体内，达到转阴目的。3.单克隆中和抗体31-2g7外用洗液的配制按照以下比例和工艺配制外用洗液：将甘油(4wt％～8wt％)、抗hpv31l1单克隆中和抗体31-2g7(终浓度为20ng/ml)充分融入纯化水中混合均匀；玫瑰香精(0.1wt％～1wt％)加入乙醇(0.5wt％～1wt％)溶解，再加天然植物发泡剂(1wt％～3wt％)混匀，在搅拌下加于甘油/抗hpv31l1单克隆抗体31-2g7混合液，搅匀、过滤除菌。将外用洗液灌入带压泵头的塑料瓶中，每瓶100ml。本品用于日常男女生殖部位的清洗，用时取本品适量涂于私处，轻揉片刻冲洗干净即可，有效预防hpv31病毒的感染。4.单克隆中和抗体31-2g7阴道栓剂的配制按照以下比例和工艺制备阴道栓剂：取300g纯化水，加热至90℃，加入200g明胶充分溶胀，冷却并维持在到60度左右，加入500g甘油，边加入边搅拌均匀，待甘油明胶基质中水分蒸发至1000g时，加入600g甘露醇，边加入边搅拌使其充分溶解，冷却至40℃以下，加入抗hpv31l1单克隆中和抗体31-2g7(终浓度为5ng/g)，低速搅拌均匀，倒于栓剂模具中，常规低温静置后取出，塑封。本品用于hpv31病毒阳性的女性阴道/生殖道使用，栓剂中的单克隆中和抗体31-2g7与hpv31病毒特异性结合，有效阻断hpv31病毒的进一步感染，并将hpv31病毒排出体内，达到转阴目的。5.单克隆中和抗体31-2g7冻干粉的配制按照以下比例和工艺制备冻干粉：抗hpv31l1单克隆中和抗体31-2g7(终浓度为5ng/ml)、牛血清白蛋白(0.1mg/ml～1mg/ml)、海藻糖(3wt％～10wt％)充分溶于纯化水中，3ml/支装于西林瓶中，5.0mbar压力下冻干3-4小时，封口保存。本品用于日常家庭或医疗机构对女性阴道清洗，用时加入3ml生理盐水充分溶解，软管注入阴道清洗，其中单克隆中和抗体31-2g7与hpv31病毒特异性结合，有效阻断hpv31病毒的进一步感染，并将hpv31病毒排出体内，达到转阴目的。6.单克隆中和抗体31-2g7阴道泡腾片的配制按照以下比例和工艺制备阴道泡腾片：(1)将碳酸氢钠(35wt％)60℃干燥2h，加20wt％peg6000乙醇液适量制成软材，14目尼龙筛制粒60℃干燥备用；(2)柠檬酸(11wt％)、维生素c(25wt％)、乳糖(12wt％)、微晶纤维素(15wt％)粉碎，加于2％羟丙甲基纤维素醇液中搅匀，制成软材，14目尼龙筛制粒60℃干燥备用；(3)加入单克隆中和抗体31-2g7冻干粉1g，微粉硅胶8g、硬脂酸镁8g，混匀，压制成1000片，铝塑水泡眼包装。本品用于hpv31病毒阳性的女性阴道/生殖道填塞，使用方便，泡腾片中的单克隆中和抗体31-2g7与hpv31病毒特异性结合，有效阻断hpv31病毒的进一步感染，达到转阴目的。7.hpv31病毒感染治疗/预防制剂的安全性测试依据《消毒技术规范》2002版，对上述制备的阴道凝胶、阴道清洗液、外用洗液、阴道栓剂、冻干粉、阴道泡腾片，进行阴道黏膜刺激试验，实验对象为家兔，刺激反应为阴性，表明安全性符合要求。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中生方政生物技术股份有限公司;北京中生方政生物技术有限公司<120>抗hpv31l1的单克隆中和抗体及其应用<130>mp2002038<160>24<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glytyrseraspthrserglutyrglntrpasn1510<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tyrileiletyrserglyserthrglntyrproproserleu1510<210>3<211>13<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aspargglnaspglyproserpheseralametleutyr1510<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4lystyrserglnaspleuasnlysglnthrgly1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tyralaglnproleutyrpro15<210>6<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6leuprotyraspmetleuilethr15<210>7<211>25<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aspvalglnleuglngluserglyalavalleuvallysprosergln151015serleuserleuthrcysthrvalthr2025<210>8<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8trpileargglnpheproglyglnlysleuglutrpmetgly1510<210>9<211>34<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9lysserargileserilethrargproileserlysasnglnphephe151015leuglnleuasnservalalasergluaspthralathrtyrtyrcys202530alagly<210>10<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10trpglyglnglythrservalthrvalserser1510<210>11<211>23<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aspileglnmetglnglnserproserserleuseralaserleugly151015proargvalthrilethrcys20<210>12<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12trptyrglnhislysleuglyargglymetargleuleuilegln151015<210>13<211>32<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13glyileproserargpheserglyserglyserglyargasptyrser151015leuglnileserasnleugluproglnaspilealathrtyrtyrcys202530<210>14<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14pheglyglyglythrlysleuglutyrlys1510<210>15<211>122<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15aspvalglnleuglngluserglyalavalleuvallysprosergln151015serleuserleuthrcysthrvalthrglytyrseraspthrserglu202530tyrglntrpasntrpileargglnpheproglyglnlysleuglutrp354045metglytyrileiletyrserglyserthrglntyrproproserleu505560lysserargileserilethrargproileserlysasnglnphephe65707580leuglnleuasnservalalasergluaspthralathrtyrtyrcys859095alaglyaspargglnaspglyproserpheseralametleutyrtrp100105110glyglnglythrservalthrvalserser115120<210>16<211>106<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>16aspileglnmetglnglnserproserserleuseralaserleugly151015proargvalthrilethrcyslystyrserglnaspleuasnlysgln202530thrglytrptyrglnhislysleuglyargglymetargleuleuile354045glntyralaglnproleutyrproglyileproserargphesergly505560serglyserglyargasptyrserleuglnileserasnleuglupro65707580glnaspilealathrtyrtyrcysleuprotyraspmetleuilethr859095pheglyglyglythrlysleuglutyrlys100105<210>17<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17tacagcgacaccagcgagtaccagtggaac30<210>18<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tacatcatctacagcggcagcacccagtacccccccagcctg42<210>19<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gacaggcaggacggccccagcttcagcgccatgctgtac39<210>20<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20aagtacagccaggacctgaacaagcagaccggc33<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21tacgcccagcccctgtacccc21<210>22<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22ctgccctacgacatgctgatcacc24<210>23<211>366<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23gacgtgcagctgcaggagagcggcgccgtgctggtgaagcccagccagagcctgagcctg60acctgcaccgtgaccggctacagcgacaccagcgagtaccagtggaactggatcaggcag120ttccccggccagaagctggagtggatgggctacatcatctacagcggcagcacccagtac180ccccccagcctgaagagcaggatcagcatcaccaggcccatcagcaagaaccagttcttc240ctgcagctgaacagcgtggccagcgaggacaccgccacctactactgcgccggcgacagg300caggacggccccagcttcagcgccatgctgtactggggccagggcaccagcgtgaccgtg360agcagc366<210>24<211>318<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24gacatccagatgcagcagagccccagcagcctgagcgccagcctgggccccagggtgacc60atcacctgcaagtacagccaggacctgaacaagcagaccggctggtaccagcacaagctg120ggcaggggcatgaggctgctgatccagtacgcccagcccctgtaccccggcatccccagc180aggttcagcggcagcggcagcggcagggactacagcctgcagatcagcaacctggagccc240caggacatcgccacctactactgcctgccctacgacatgctgatcaccttcggcggcggc300accaagctggagtacaag318当前第1页12