本申请是申请号为201680010458.2，申请日为2016年2月19日，发明名称为“层粘连蛋白用于使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的用途”的中国专利申请的分案申请。本发明涉及细胞分化和细胞疗法的领域。
背景技术：
：：自它们的发现以来，人诱导的多能细胞(hipsc)和人胚胎干细胞(hesc)已经作为用于替代患病细胞的、身体的任何专门细胞的可再生来源进行了集中研究[1,2]。已经预见到它们用于治疗宽范围的疾病，诸如严重的心脏病[3]、神经学疾病[4]、肝病[5]和视网膜疾病[6]以及糖尿病[7,8]。肝病影响全世界数百万人。迄今为止，当患者具有严重代谢性肝障碍时，肝移植是唯一治愈选项。约37,000位患者处于欧洲和美国的肝移植的等候名单上。在欧洲每年进行超过5500例肝移植，并且遗传性代谢疾病占所述适应症的26％(欧洲肝移植登记)。但是，每年小于1/3的在肝等候名单上的患者可以接受肝移植，并且由于供体器官的短缺，在处于肝移植的等候名单上期间死亡的患者的数目(约10％)已经在近年增加。在过去的15年中，从尸体肝分离的肝细胞向患者的肝中的移植已经作为肝移植的临床替代方案出现[9,10]，特别是对于这样的天生代谢疾病：其中肝功能得到维持并且存在单一酶缺陷。在具有1型crigler-najjar(cn1)的患者中首次证实了移植的人肝细胞的代谢功能的确凿证据[11]。细胞移植以后，患者的临床状态和生活质量得到改善，5％ugt1a1活性的恢复导致胆红素血症和光疗治疗的50％下降。该有潜力的研究打开了用于治疗超过40位受遗传性代谢肝病影响的患者的途径，所述患者主要具有cn1和尿素循环障碍，但是也具有1型糖原贮积病、婴儿雷弗素姆病、进行性2型家族性肝内胆汁淤积和vii型血友病[9]。肝细胞移植允许一些儿童在等待肝移植时避免新的神经学损伤。相对少量的输入肝细胞(1.5-2x109个细胞)足以改善一些受影响的患者的代谢缺乏。但是，持久的稳定效应当然需要重复的细胞输注[12]。对于它在临床实践中的一般和常规应用，该方案具有其它重要限制。可得到的肝移植物会将肝移植区分优先次序，仅具有边缘质量的那些被用于肝细胞分离。由此，分离的肝细胞具有可变的质量和数量。它们快速地分化，并且不可在培养物中繁殖，且不会较好地耐受冷冻保存。共同地，这些限制强调了探究功能性人肝细胞的其它来源的需要。近年来，几个研究组报道了hesc和hipsc向肝细胞样细胞(hlc)的体外分化，其中使用模仿肝胚胎发育阶段的不同培养条件[5,13-21]。hlc没有表现出完全成熟肝细胞的功能，但是具有更接近胚胎人肝细胞的表型，表达例如afp[22]。它们可以移入、在某种程度上繁殖并在移植进免疫受损的动物的肝脏中以后维持肝功能性，所述动物经过化学损伤、照射或遗传操作以给移植的肝细胞提供选择性生长优势，诸如过表达尿激酶型纤溶酶原激活物以诱导组成性受体肝损伤和再生刺激的小鼠[5,14,17,23-25,60]。一些研究探究了hlc的治疗潜力并成功地治疗了化学诱导的致命性肝功能衰竭的多个鼠模型[26-33]。尽管如此，所述肝具有从内源性肝细胞再生它自身的惊人能力。由此，hlc对肝代谢功能的短暂支持足以从急性肝衰竭挽救回小鼠。相反，对于遗传性肝疾病的治疗，hlc必须在体内充分分化且具有长期功能以在患病的动物中表达缺失的成熟肝代谢功能。到目前为止，尚未证实将人遗传性肝病模型化的动物的成功代谢校正，在所述动物中，移植的hlc在受体肝中不具有选择性的存活和生长优势。耿氏大鼠(cn1的动物)具有在ugt1a1中的天然突变，从而在出生后不久造成ugt1a1活性的完全丧失和高胆红素血症。胆红素缀合物在胆汁中的完全缺失会提供容易的、明确的和灵敏的读出来评价ugt1a1活性的恢复。因而，耿氏大鼠构成宝贵的且方便的模型来跟踪体内肝细胞成熟和移植的肝细胞的治疗潜力。如在cn1患者中一样，肝细胞移植以后ugt1a1活性的部分恢复会导致显著的代谢校正[37-39]。在考虑hlc用于临床应用之前，一个关键问题也是使用符合gmp(良好生产规范)的肝分化方案生产它们。当前的肝分化方案通常含有饲养细胞-条件培养基、血清、动物起源的基质(诸如matrigeltm)、小鼠饲养细胞、用于改善肝分化的病毒载体，或在gmp中不可得到的小分子[15,34-36]。它们都是使得到的组织不适合将来的临床应用的未知因子的来源。因此，对用于同种异体细胞疗法的人肝细胞存在临床需要。多能干细胞已经作为可移植的hlc的可再生来源进行了集中探究。但是，仍然有待证实在移植的细胞相对于固有的啮齿动物肝细胞没有任何选择性生长优势的情况下hlc可以治疗遗传性代谢肝病。另外，使用使它们不适合用于临床应用的方案生产了以前产生的hlc。近年来，诸如层粘连蛋白-521(ln-521)和层粘连蛋白-111(ln-111)的层粘连蛋白已经被描述为用于细胞培养的有关基质，更具体地用于维持目标细胞(诸如多能细胞或hlc)的长期体外培养物的功能性质，但是从未公开也没有提示层粘连蛋白可用于诱导和/或改善肝分化。另外，没有研究提示单独采用的层粘连蛋白基质可以支持从多能干细胞系的起始和随后的肝细胞分化。因而，国际专利申请wo2012/080844涉及层粘连蛋白-521的新用途。实际上，层粘连蛋白-521可以维持干细胞体外多能性，实现自我更新，并实现人胚胎干细胞的单细胞存活。当在没有分化抑制剂或饲养细胞存在下在用重组层粘连蛋白-521包被的平板上培养多能人胚胎干细胞时，所述胚胎干细胞增殖并维持它们的多能性。此外，已经证实，人成肝细胞样细胞可以首先从matrigel包被的盘上的多能细胞产生(肝分化的诱导)，并然后在层粘连蛋白-111包被的盘上培养用于繁殖它们超过3个月，同时保持分化成肝细胞样细胞和胆管细胞(cholangiocyte)样细胞的潜能[36]。令人惊奇地，申请人发现了ln-111和ln-521在肝细胞样细胞分化中的新作用。ln-521的该新作用不同于在wo2012/080844中描述的多能性维持的作用。技术实现要素：在第一方面，本发明涉及层粘连蛋白(ln)作为肝分化基质的用途。在第二方面，本发明涉及ln用于诱导和/或改善多能细胞群体或多潜能细胞群体或确定内胚层(de)细胞群体向肝细胞谱系细胞群体的分化的用途。在第三方面，本发明涉及一种诱导人肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人de细胞群体，和(ii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人成肝细胞样细胞群体，和(iii)任选地在肝成熟培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人成肝细胞样细胞群体以产生人胚胎肝细胞样细胞群体。在第四方面，本发明涉及一种诱导肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人de细胞群体，(iii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人de细胞群体以产生人成肝细胞样细胞群体，和(iv)任选地在肝成熟培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人成肝细胞群体以产生人胚胎肝细胞样细胞群体。在第五方面，本发明涉及通过本发明的方法得到的人成肝细胞样细胞群体。在第六方面，本发明涉及本发明的人成肝细胞样细胞群体，其用于治疗人体的方法。在第七方面，本发明涉及通过本发明的方法得到的人胚胎肝细胞样细胞群体。在第八方面，本发明涉及一种用于诱导人肝分化的试剂盒，所述试剂盒包含用层粘连蛋白包被的支持物、bmp4和成纤维细胞生长因子(fgf)家族的成员诸如fgf2或fgf10。附图说明图1：在ln111包被的盘中的人多能干细胞的肝分化。(a)使多能人细胞分化成肝细胞样细胞的方案.(b-d)通过针对多能性标志物(图b,sox2)、内胚层标志物(图c,sox17,foxa2)和肝标志物(图d,hnf4a,aat,afp,alb,ck19,cyp3a4,cyp3a7,ugt1a1)的mrna表达的rt-qpcr分析随时间监测肝分化。(e)通过elisa测得的细胞上清液中的肝蛋白afp的分泌。数据代表平均值±sem。ln111：使用在ln111包被的盘上分化的hipsc的结果；matrigel:使用在matrigeltm包被的盘上分化的hipsc的结果。图2：hlcs向耿氏大鼠的肝中的移植.在耿氏大鼠中的血清胆红素水平。在他克莫司免疫抑制的耿氏大鼠中随时间监测胆红素血症，所述耿氏大鼠在2/3部分肝切除术以后24小时接受idhb。对照大鼠接受相同的外科手术，但是没有移植。图3：在ln521包被的盘中的人多能干细胞的肝分化。通过针对内胚层标志物(sox17)和肝标志物(hnf4a,aat,afp,alb和ck19)的mrna表达的rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图4:在ln111包被的盘中的ipsc细胞的肝分化。针对内胚层标志物(nanog,oct4,foxa2,sox17)的mrna表达，通过rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图5:在ln111包被的盘中的ipsc细胞的肝分化。针对肝标志物(hnf4a,cyp7a1,afp和ck19)的mrna表达，通过rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图6:在ln111包被的盘中的ipsc细胞的肝分化。针对肝标志物(alb,aat)的mrna表达，通过rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图7:在ln111或ln521包被的盘中的ipsc细胞的肝分化。针对肝标志物(hnf4a,aat,afp和alb)的mrna表达，通过rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图8:在含有或没有chir99021的ln111或ln521包被的盘中的hesc的肝分化。针对肝标志物(hnf4a,ck19,afp和cyp3a7)的mrna表达，通过rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图9:细胞接种对含有或没有chir99021的ln111或ln521包被的盘中的hesc的肝分化的影响。针对肝标志物(hnf4a,ck19,afp和alb)的mrna表达，通过rt-qpcr分析随时间监测肝分化。图10:新鲜或冷冻ips肝细胞向耿氏大鼠的肝中的移植。在他克莫司免疫抑制的耿氏大鼠中随时间监测胆红素血症，所述耿氏大鼠在2/3部分肝切除术以后24小时接受idhb。对照大鼠接受相同的外科手术，但是没有移植。图11:在耿氏大鼠的脾或肝中的肝细胞的检测。在他克莫司免疫抑制的耿氏大鼠的肝和脾中的ugt1a1的免疫组织化学分析，所述耿氏大鼠在2/3部分肝切除术以后24小时接受idhb。具体实施方式本发明解决了这些需要，因为它涉及可用于使多能细胞群体或确定内胚层(de)细胞群体分化成肝细胞谱系细胞群体的化学成分确定的培养基的鉴别。发明人令人惊讶地证实，单独的层粘连蛋白-111与基质胶一样有效地用于在我们的培养条件中起始和支持hipsc的肝分化，但是与重组基质一起。发明人然后证实，层粘连蛋白-521(ln-521)还可用作基质和允许hipsc更好地分化成确定内胚层和hlc。发明人实际上已经使用重组层粘连蛋白-111(ln-111)作为用于起始和支持肝分化过程的细胞外基质在无异源物种成分的、无饲喂细胞的且化学成分确定的方案中生产了从人多能干细胞(idhb)衍生出的成肝细胞。将这些具有特定标志物集合(表达的或未表达的标志物的组合)的idhb移植进耿氏大鼠的肝中，所述耿氏大鼠是克里格勒-纳贾尔综合征的动物模型，其特征在于高水平的未缀合的胆红素。在细胞移植以后，它们表现出高胆红素血症的显著校正，其在6个月的研究中保持稳定，没有不利事件。它们还表明移植的idhb经历进一步原位成熟，以修补有缺陷的代谢肝功能(ugt1a1的胆红素葡糖醛酸化)。综上所述，它们首次证实了使用符合gmp的方案基于hipsc的再生的效力，其用于在移植的细胞相对于固有肝细胞没有任何选择性生长优势的情况下治疗遗传性肝代谢疾病，所述情况是在人类的肝细胞移植中遇到的情形。肝分化方法和层粘连蛋白的应用因此，在第一方面，本发明涉及层粘连蛋白(ln)作为肝分化基质的用途。本发明也涉及ln用于诱导和/或改善多能细胞群体、多潜能细胞群体或确定内胚层(de)细胞群体向肝细胞谱系细胞群体的分化的用途。本文中使用的术语“层粘连蛋白”(ln)表示主要停留在基底层中的异源三聚体糖蛋白家族的蛋白。它们通过与一侧上的邻近细胞受体的结合相互作用并通过结合其它层粘连蛋白分子或其它基质蛋白(诸如胶原、巢蛋白或蛋白聚糖)而起作用。层粘连蛋白分子也是可以强烈地影响细胞的行为和功能的重要信号传递分子。在维持细胞/组织表型中，以及在促进细胞生长和分化(在组织修复和发育中)中，层粘连蛋白是重要的。层粘连蛋白是大的多结构域蛋白，具有共同的结构组构。层粘连蛋白分子将多种基质和细胞相互作用功能集成在一种分子中。层粘连蛋白蛋白分子包含一个α-链亚基、一个β-链亚基和一个γ-链亚基，都通过卷曲螺旋结构域在三聚体中连接在一起。12种已知的层粘连蛋白亚基链可以在天然组织中形成至少15种三聚体层粘连蛋白类型。在三聚体层粘连蛋白结构内，是对其它层粘连蛋白和基底层分子和膜结合的受体具有结合活性的可鉴别的结构域。还应当指出，术语“层粘连蛋白”包括完整的、作为单独链或作为其片段的层粘连蛋白。本文中使用的术语“完整的”表示所述蛋白由α-链、β-链和γ-链的所有结构域组成，所述三个链连接在一起以形成异源三聚体结构。所述蛋白没有分解成单独的链、片段或功能结构域。例如，层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-521(如下所述)是完整蛋白。本文中使用的术语“链”表示层粘连蛋白蛋白的α、β或γ链的整体。本文中使用的术语“片段”表示含有1、2或3个功能结构域的任何蛋白片段，其具有与另一种分子或受体的结合活性。但是，链不应当视作片段，因为每个链具有超过三个这样的结构域。类似地，完整的层粘连蛋白蛋白不应当视作片段。功能结构域的例子包括结构域i、ii、iii、iv、v、vi和g结构域。存在5种不同的α链、3种β链和3种γ链，它们在人组织中已经以至少18种不同组合发现。这些分子基于它们的历史发现被称作层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，但是一种替代命名法基于它们的链组成描述了异形体，例如含有α-1、β-1和γ-1链的层粘连蛋白-111(层粘连蛋白-1)。已经鉴别出层粘连蛋白的4个在结构上确定的家族集合。5种经鉴别的层粘连蛋白分子的第一个集合都具有β1和γ1链，且差异在于它们的α-链组成(α1至α5链)。5种经鉴别的层粘连蛋白分子(包括层粘连蛋白-521)的第二集合都具有β2和γ1链，且再次的，差异在于它们的α-链组成。经鉴别的层粘连蛋白分子的第三集合具有一个经鉴别的成员，层粘连蛋白-332，其具有α3β3γ2的链组成。经鉴别的层粘连蛋白分子的第四集合具有一个经鉴别的成员，层粘连蛋白-213，其具有新鉴别的γ3链(α2β1γ3)。基于它们的链组成，已经鉴别出层粘连蛋白(ln)的至少15个亚型(或“异形体”)，包括ln-111(α1β1γ1)、ln-121(α1β2γ1)、ln-211(α2β1γ1)、ln-213(α2β1γ3)、ln-221(α2β2γ1)、ln-311(α3β3γ1)、ln-321(α3β2γ1)、ln-332(α3β3γ2)、ln-411(α4β1γ1)、ln-421(α4β2γ1)、ln-423(α4β2γ3)、ln-511(α5β1γ1)、ln-521(α5β2γ1)、ln-522(α5β2γ2)和ln-523(α5β2γ3)。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白选自由层粘连蛋白-111(ln-111)、层粘连蛋白-211(ln-211)、层粘连蛋白-332(ln-332)、层粘连蛋白-411(ln-411)、层粘连蛋白-421(ln-421)、层粘连蛋白-511(ln-511)和层粘连蛋白-521(ln-521)组成的组。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人重组层粘连蛋白。在本发明的优选实施方案中，所述层粘连蛋白是重组人层粘连蛋白-111(ln-111)和/或重组人层粘连蛋白-521(ln-521)。层粘连蛋白521(由α5、β2、γ1链组成)在早期胚胎发育过程中表达，由人多能干细胞分泌，且已知会刺激它们的稳健增殖[63]。层粘连蛋白α5存在于胆管和肝血管(肝动脉、门静脉)中，除了在窦状隙中以外，因而层粘连蛋白α5通常不与正常的肝细胞结合。另外，层粘连蛋白β2链，和因而层粘连蛋白-521，不在成年和正常动物肝中表达[64]。层粘连蛋白α1链，和因而层粘连蛋白-111(由α1、β1、γ1链组成)，不在成年动物肝中表达[65]。因而，从成年肝组织提取的层粘连蛋白不含有层粘连蛋白521或层粘连蛋白-111。本文中使用的术语“重组”多肽表示通过从编码核酸分子表达而产生的多肽。用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。当以重组形式表达时，所述多肽优选地通过在宿主细胞中从编码核酸表达而产生。可以使用任何宿主细胞，这取决于特定系统的个别需要。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒系统。重组人层粘连蛋白诸如重组人ln-111或ln-521可以购自biolamina,sundbyberg,瑞典。在本发明的一个实施方案中，以0.5-50微克/毫升(μg/ml)，优选地1-10μg/ml，更优选地在5μg/ml，将层粘连蛋白包被在支持物诸如平板上。本文中使用的术语“基质”表示形成高分子网络的组分/物质(天然的、合成的或它们的组合)，所述高分子网络给体外培养的细胞(例如在培养容器诸如扁平的塑料制品上)提供体内类似的形态学和生理学上有关的环境，实现细胞培养物的更逼真的细胞生物学和更好的细胞间相互作用，从而促进细胞附着、生长、分化。在一个实施方案中，所述基质包含层粘连蛋白，诸如重组人层粘连蛋白-111(ln-111)或重组人层粘连蛋白-521(ln-521)或其混合物。在另一个实施方案中，所述基质包含以下比率的ln-521和ln-111：约5％/95％；10％/90％；20％/80％；25％/75％；30％/70％；40％/60％；50％/50％，60％/40％；70％/30％；75％/25％，80％/20％；90％/10％；95％/5％。在另一个实施方案中，所述基质包含层粘连蛋白和另一种组分(诸如基质蛋白，包括胶原i和纤连蛋白)的混合物。本文中使用的术语“群体”表示细胞群体，其中细胞总数的大多数(例如，至少约50％，优选地至少约60％，更优选地至少约70％，且甚至更优选地至少约80％)具有目标细胞的关于至少一种目标标志物的指定特征(例如人肝细胞样细胞群体包含至少约60％、优选地至少约70％、更优选地至少约80％的具有肝功能并且表达标志物的细胞，所述标志物通常由下面列出的人肝细胞样细胞表达，诸如例如肝细胞核因子4α(hnf4α))。本文中使用的术语“标志物”表示在细胞表面上或在细胞内部表达且可以用于帮助鉴别细胞的蛋白、糖蛋白或其它分子。通常通过常规方法可以检测标志物。可以用于检测细胞表面标志物的方法的具体的非限制性例子是免疫细胞化学、荧光活化细胞分选(facs)和酶促分析，以及用于检测蛋白的mrna的rt-pcr和分子生物学方法。本文中使用的术语“多能”表示具有产生后代的能力的细胞，所述后代可以在适当的条件下分化成共同地表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层，和外胚层)的细胞谱系有关的特征的细胞类型。多能干细胞可以为出生前、出生后或成年生物体的组织做出贡献。一个标准的本领域接受的试验，诸如在8-12周龄scid小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用于确立细胞群体的多能性。但是，各种多能干细胞特征的鉴别也可以用于鉴别多能细胞。在本发明的一个实施方案中，所述多能干细胞是人多能干细胞。更具体地，人多能干细胞可以表达至少一些和任选地所有来自下述非限制性列表的标志物：ssea-3、ssea-4、tra-i-60、tra-i-81、tra-2-49/6e、alp、sox2、e-钙粘着蛋白、utf-i、oct4、lin28、rexl和nanog。在本发明的一个实施方案中，所述人多能干细胞是人胚胎干细胞(hesc)或人诱导的多能干细胞(hipsc)。本文中使用的术语“胚胎干细胞”表示这样的胚胎细胞：其能够分化成所有三个胚胎胚层(即，内胚层、外胚层和中胚层)的细胞，或保持在未分化状态。这样的细胞可以包含从以下对象得到的细胞：妊娠之后(例如，胚泡)、胚胎植入之前(即，植入前胚泡)形成的胚胎组织，得自植入后/原肠形成前期阶段胚泡的扩展的胚泡细胞(ebc)(参见wo2006/040763)，得自妊娠过程中的任何时间(优选地妊娠的前10周)的胚胎的生殖器组织的胚胎生殖(eg)细胞，和使用非受精卵的其它方法，诸如孤雌生殖方法或核移植。使用众所周知的细胞培养方法可以得到胚胎干细胞。例如，可以从人胚泡分离出人胚胎干细胞。人胚泡通常得自人体内植入前胚胎或体外受精的(ivf)胚胎。可替换地，可以将单个细胞人胚胎繁殖至胚泡期。为了分离人es细胞，将透明带从胚泡除去，并通过免疫外科手术分离内细胞团(icm)，其中将滋养外胚层细胞裂解并通过轻吸从完整icm除去。然后将icm接种到含有适当培养基的组织培养瓶中，所述培养基能够实现它的生长晕。9-15天之后，将icm衍生的生长晕通过机械解离或通过酶促降解解离成块，然后将所述细胞重新接种到新鲜组织培养基中。将表现出未分化形态的集落通过微量移液器单个地挑选，机械解离成块，并重新接种。然后每4-7天常规地分流得到的es细胞。关于制备人es细胞的方法的其它细节，参见thomson等人,[美国专利号5,843,780]。也可以使用商购可得的干细胞。人es细胞可以购自nih人胚胎干细胞登记处(http://escr.nih.gov)。商购可得的胚胎干细胞系的非限制性例子是bg01、bg02、bg03、bg04、cy12、cy30、cy92、cy10、te03、te32、h9、wa09、roslin细胞(rc6、rc7、rc8、rc9和rc10)和esi-017、esi-035、esi-049、esi-051、esi-053(biotime)。本文中使用的术语“诱导的多能干细胞”表示以人工方式从非多能细胞衍生出的多能干细胞。非多能细胞可以是具有比多能干细胞更低的自我更新和分化潜能的细胞。较低潜能的细胞可以是，但不限于，成体干细胞、组织特异性的祖细胞、初级或次级细胞。通过如下将不同细胞类型重新编程已经可再现地得到ipsc：oct4、sox2、c-myc和klf4转录因子混合物的被迫表达，或通过因子的替代组合，替换klf4和c-myc，或添加nanog和lin28，或技术人员已知的改善重新编程过程的任何方法(执行小分子诸如dna甲基转移酶(dnmt)抑制剂、mirna等…的使用)。本文中使用的术语“重新编程”表示由一小组因子(或重新编程因子)在靶细胞中的表达造成的将靶细胞的命运改变成不同细胞类型的命运的过程。在本领域中已经描述了基于编码重新编程因子的表达载体而产生诱导的多能干细胞的方法；参见例如wo2007/69666、ep2096169-a1或wo2010/042490。用于异位表达重新编程因子的表达载体可以是，例如，质粒载体、粘粒载体、细菌人工染色体(bac)载体、基于转座子的载体(诸如piggybac)或病毒载体。可替换地，将所述重新编程因子(例如，oct4、sox2、klf4和c-myc)或相应的编码dna或rna引入靶细胞中，所述靶细胞在宿主dna中未整合外源性遗传材料，即不将核苷酸序列引入细胞的基因组中。可以将表达载体(诸如质粒载体)以裸dna的形式递送进所述细胞中用于异位表达所述重新编程因子。可替换地，可以将经化学修饰的或未经修饰的编码所述重新编程因子的rna引入所述细胞中以将它们重新编程(参见例如warrenl,等人,2010年11月5日,cellstemcell.；7(5):618-30)。其它表达载体已经描述在例如wo2009115295中。在一个实施方案中，从得自健康受试者的细胞衍生出所述hipsc。在另一个实施方案中，从得自具有肝病(诸如遗传性代谢肝病)的受试者的细胞衍生出所述hipsc，且所述肝细胞样细胞表现出疾病表型。可替换地，目标肝细胞谱系细胞群体可以得自由本发明的层粘连蛋白构成的肝分化基质上的多潜能细胞(诸如间质干细胞)的分化。本文中使用的术语“多潜能”表示能够分化成至少两种最终分化的细胞类型的细胞。本文中使用的术语“间质干细胞”通常表示在分化的(专门)组织中发现的间质细胞，且其能够在生物体的寿命中产生它们自己的相同拷贝(自我更新)且具有多潜能分化潜力(诸如分化成成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞)。优选地，在本发明的上下文中可以使用的人间质干细胞因而包括使用任意适当的分离方法从任意合适的组织衍生出的任意合适的人多潜能干细胞(即，具有自我更新和多潜能性的能力的细胞)。例如，可以用在本发明的方法中的人间质干细胞包括、但不限于：成年多谱系可诱导的(miami)细胞(d'ippolito等人,j.cellsci.,2004,117:2971-2981)、mapc(也被称作mpc)(reyes等人,blood,2001,98:2615-2625)、脐带血衍生的干细胞(g等人,j.exp.med.,2004,200(2):123-135)、mesoangioblasts(sampaolesim等人,nature,2006,444(7119):574-579；dellavallea等人,nat.cellbiol.,2007,9:255-267)和羊膜干细胞(decoppip等人,natbiotechnol2007,25:100-106)。此外，脐带血库(例如，etablissementdusang,法国)提供用于移植的这类细胞的安全且可容易得到的来源。可替换地，肝细胞谱系细胞群体可以得自从成年人肝分离的细胞(例如肝细胞祖细胞)、在由层粘连蛋白构成的肝分化基质上的分化。可替换地，目标肝细胞谱系细胞群体可以得自体细胞(诸如成纤维细胞)、在由层粘连蛋白构成的肝分化基质上的转化。本文中使用的术语“肝细胞谱系细胞”或“肝细胞样细胞”(hlc)表示以所述的方式分化多能细胞、内胚层细胞或其它种类的细胞(诸如多潜能细胞)而得到的细胞。所述分化的细胞具有已知的肝细胞祖细胞、成肝细胞、胚胎的、新生儿的、成熟的、成体的和完全成熟肝细胞的多种区别表型特征(如在本公开内容中在后面提供)中的至少一种。通过使用该术语，没有暗示在细胞表型、细胞标志物、细胞功能或增殖能力方面的特定限制，除非在明确地需要的情况下。肝细胞谱系细胞表达肝标志物，包括、但不限于肝细胞核因子4α(hnf4α)、白蛋白(alb)、甲胎蛋白(afp)、细胞色素p450和细胞角蛋白19(ck19)。在一个特定实施方案中，人肝细胞样细胞的群体不过表达基因。优选地，这些细胞群体不过表达在肝分化中涉及的因子。在肝分化中涉及的因子的例子包括、但不限于，同源框转基因hex、hnf-4、hgf、fgf4、osm、激活素、tgf-β、foxa2、fgf2、hnf1α、hnf1-β、hnf6、hnf3β、sox17、foxa3、foxa1、gata4、atf5、prox1、cebpα或在肝发育中涉及的任意其它基因(即内胚层诱导、肝向特化(specification)肝成熟、肝维持、肝细胞增殖因子)。在一个实施方案中，所述人肝细胞样细胞群体不过表达hex转基因。本文中使用的术语“过表达”表示超过正常量的基因产物(rna或蛋白)的表达。过表达基因或蛋白的技术是在现有技术中众所周知的，且包括、但不限于，mrna的显微注射，注射、蛋白转染或表达载体的转染。用于确定本发明的生物标志物的表达水平的方法通过多种技术可以确定包括肝标志物(例如hnf4α、alb、afp、ck19基因)在内的标志物的表达水平。通常，确定的表达水平是相对表达水平。例如，所述确定包括使生物样品与选择性的试剂(诸如探针或配体)接触，和由此检测最初在所述生物样品中的目标核酸或多肽的存在或测量其量。接触可以在任意合适的装置(诸如平板、微量滴定盘、试管、孔、玻璃、柱，诸如此类)中进行。在具体实施方案中，所述接触在用试剂包被的衬底(诸如核酸阵列或特异性配体阵列)上进行。所述衬底可以是固体或半固体衬底，诸如任何合适支持物，其包括玻璃、塑料、尼龙、纸、金属、聚合物等。所述衬底可以具有不同的形式和大小，诸如载玻片、膜、珠子、柱、凝胶等。所述接触可以在适合于在所述试剂和生物样品的核酸或多肽之间形成可检测复合物(诸如核酸杂合物或抗体-抗原复合物)的任何条件下进行。在一个特定实施方案中，通过确定mrna的量，可以确定生物标志物基因的表达水平。用于确定mrna的量的方法是本领域众所周知的。例如首先根据标准方法(例如使用裂解酶或化学溶液)提取在目标细胞(诸如本发明的hlc)中所含的核酸，或者按照生产商的说明书用核酸结合树脂提取。然后通过杂交(例如，northern印迹分析)和/或扩增(例如，rt-pcr)检测提取的mrna。定量或半定量rt-pcr是优选的。实时定量或半定量rt-pcr是特别有利的。在另一个实施方案中，生物标志物基因的表达水平可以通过确定由所述基因编码的蛋白的量来确定。这样的方法包括，使生物样品与结合配偶体接触，所述结合配偶体能够与存在于所述样品中的蛋白选择性地相互作用。所述结合配偶体通常是抗体，所述抗体可以是多克隆或单克隆的，优选单克隆的。例如，通过使用标准的电泳和免疫诊断技术，包括免疫测定诸如竞争、直接反应或夹心型测定，可以测量生物标志物蛋白，诸如hnf4α、alb、afp和ck19，的水平。这样的测定包括、但不限于：western印迹；凝集试验；酶标记的和介导的免疫测定，诸如elisa；生物素/抗生物素蛋白型测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀。细胞培养条件可以包括一种或多种另外的组分，以在向靶分化细胞类型(例如，肝细胞谱系细胞)定向分化过程中提供支持环境。用于得到分化的靶细胞群体的方法另外包括诱导分化的步骤。诱导分化可以通过如下所述在分化的一个或多个阶段改变培养基中的生长因子的组成来实现。因此，在第二方面，本发明涉及一种诱导人肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人确定内胚层(de)细胞群体，和(ii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人肝细胞样细胞群体。本发明也涉及一种用于得到人肝细胞样细胞的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人de细胞群体，和(ii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人肝细胞样细胞群体。本文中使用的术语“确定内胚层细胞”表示表达特征性生化标志物(包括、但不限于sox17和foxa2)且不表达nanog的细胞。本文中使用的术语“成肝细胞样细胞”(hb)或“肝祖细胞”是可互换的且表示这样的细胞：其表达特征性生化标志物，包括、但不限于肝细胞核因子4α(hnf4α)、细胞角蛋白19(ck19)和细胞色素p4503a7(cyp3a7)，且不表达或基本上不表达甲胎蛋白(afp)且不表达白蛋白(alb)、α-1抗胰蛋白酶(aat)、细胞色素p4503a7(cyp3a7)和尿苷二磷酸(udp)-葡糖醛酸基转移酶1a1(ugt1a1)。本文中使用的术语“基本上不”表示表达低水平的目标蛋白(诸如afp)的肝细胞样细胞群体。因此，这样的细胞可能仅表达通过elisa不可检测的低数量或量的afp蛋白，诸如几皮克(pg)，其低于通过elisa对afp的检测限度(lod)。但是，还应当指出，通过rt-pcr可以检测低数量的afpmrna(但是这样的数量对于检测afp蛋白的最终表达而言是不够的)。本文中使用的表述“肝诱导培养基”或“诱导肝分化的培养基”表示能够诱导确定内胚层分化成肝细胞样细胞(且因而能够诱导肝标志物诸如hnf4α、ck19和cyp3a7的表达)的培养基。本文中使用的术语“培养基”表示能够支持确定内胚层细胞的生长和分化成肝祖细胞的任何培养基。支持确定内胚层细胞的生长和分化成肝祖细胞的优选培养基制剂包括化学成分确定的培养基(cdm)。本文中使用的术语“化学成分确定的培养基”(cdm)表示用于培养细胞的有营养的溶液，其仅含有指定的组分，优选已知化学结构的组分。化学成分确定的培养基是无血清的和无饲喂细胞的培养基。本文中使用的“无血清”表示不含有加入的血清的培养基。本文中使用的“无饲喂细胞的”表示不含有加入的饲养细胞的培养基。本发明使用的培养基可以是基于水的培养基，其包括物质诸如盐、营养物、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白诸如细胞因子、生长因子和激素的组合，它们都是细胞存活所必需的。例如，根据本发明的培养基可以是合成的组织培养基，诸如用于人类使用的rpmi(roswellparkmemorialinstitute培养基)或cmrl-1066(connaughtmedicalresearchlaboratory)，如在下面进一步所述的(实施例部分)，其在必要时补充需要的添加剂诸如b27。除了其它组分以外，b-27补充物(invitrogen)含有sod、过氧化氢酶和其它抗氧化剂(gsh)和独特的脂肪酸，诸如亚油酸、亚麻酸、硫辛酸。用肝诱导培养基培养de细胞的步骤应当进行肝细胞样细胞生产所需的必要时间。本领域技术人员可以容易地确定该培养步骤的持续时间。例如，在培养过程中，本领域技术人员可以针对至少一种仅由确定内胚层(de)细胞表达的标志物(例如sox17和foxa2)的表达的缺失和/或针对由肝细胞样细胞特异性地表达的标志物的表达(例如hnf4α、ck19、cyp3a7)来监测培养的细胞。当检测不到de细胞特有的一种或几种标志物的表达和/或检测到肝细胞样细胞特有的一种或几种标志物的表达时，可以停止使用肝诱导培养基的培养。可以如下执行这些标志物的监测：使用例如用特异性引物对从培养的细胞提取的rna的rt-pcr分析，使用标志物的特异性抗体的免疫荧光分析，和facs，或检测与所述蛋白对应的mrna的任何方法。通常，步骤ii)可以进行3-10天，优选6天。如果必要的话，可以有规律的间隔部分地或完全地更新本发明的培养基。通常，可以每两天用本发明的新鲜培养基替换本发明的培养基，持续6天。通过使用任意合适的方法，例如facs，可以分离和/或纯化通过以上方法生产的肝细胞样细胞。结合用于得到人肝细胞样细胞的方法使用的术语“fgf家族生长因子”表示，能够通过结合一种成纤维细胞生长因子受体(fgfr)而刺激细胞生长、增殖和细胞分化的任何天然存在的物质(例如蛋白)。通过结合一种fgfr，所述物质增加例如所述受体的酪氨酸磷酸化。在本发明的一个实施方案中，所述肝诱导培养基是包含骨形态发生蛋白(bmp)和成纤维细胞生长因子(fgf)的化学成分确定的培养基。在本发明的一个实施方案中，所述肝诱导培养基是包含骨形态发生蛋白4(bmp4)和fgf的化学成分确定的培养基。在另一个实施方案中，所述肝诱导培养基是包含bmp2和fgf的化学成分确定的培养基。在本发明的另一个实施方案中，所述肝诱导培养基是包含dmso(二甲基亚砜)、kosr(敲除的血清替换物)、hgf(肝细胞生长因子)、丁酸钠的化学成分确定的培养基。在一个特定实施方案中，所述肝诱导培养基是包含dmso和kosr的化学成分确定的培养基。在另一个特定实施方案中，所述肝诱导培养基是包含hgf和丁酸钠的化学成分确定的培养基。通常，以约0.5至约5％、优选约1％的浓度将dmso加入本发明的培养基中。dmso可以购自sigma。通常，以约5％至约30％、优选20％的浓度将kosr加入本发明的培养基中。kosr可以购自lifetechnologies或thermofisher。通常，以约1ng/ml至约25ng/ml、优选约10ng/ml的浓度将hgf加入本发明的培养基中。hgf可以购自r&dsystems。通常，以约1至约10mm、优选约2.5mm的浓度将丁酸钠加入本发明的培养基中。丁酸钠可以购自sigma。在本发明的优选实施方案中，所述肝诱导培养基是含有骨形态发生蛋白4(bmp4)和家族生长因子10(fgf10)的化学成分确定的培养基。天然存在的人fgf10蛋白具有如在uniprot登录号o15520中所示的氨基酸序列。通常，以1-50ng/ml范围内、优选约10ng/ml的浓度将fgf10加入本发明的培养基中。fgf10可以购自peprotech或miltenyibiotec。天然存在的人bmp4蛋白具有如在uniprot登录号p12644中所示的氨基酸序列。通常，以在1-50ng/ml范围内、优选约10ng/ml的浓度将bmp4加入本发明的培养基中。bmp4可以购自r&dsystems。天然存在的人bmp2蛋白具有如在uniprot登录号p12643中所示的氨基酸序列。通常，以在1-200ng/ml范围内、优选约10ng/ml的浓度将bmp2加入本发明的培养基中。bmp2可以购自r&dsystems或thermofisher。在本发明的另一个实施方案中，所述肝诱导培养基是包含骨形态发生蛋白4(bmp4)和fgf2(也被称作碱性成纤维细胞生长因子)的化学成分确定的培养基。天然存在的人fgf2蛋白具有如在uniprot登录号p09038中所示的氨基酸序列。通常，以在1-50ng/ml范围内、优选约10ng/ml的浓度将fgf2加入本发明的培养基中。fgf2可以购自peprotech或miltenyibiotec。在本发明的某些实施方案中，培养de细胞群体可以另外包括，在分化过程之前或过程中将de细胞群体传代。将所述细胞群体传代的过程可以重复一次或多次，且可以包括解离被附着基质支持的细胞，在培养基中稀释解离的细胞。因此，步骤ii)可以进一步包括传代至少一次和/或细胞计数的步骤。在本发明的某些实施方案中，为了增加集落生成，可以在解离之前4小时和接种后24小时用rock抑制剂处理细胞。本文中使用的术语“rho-相关的蛋白激酶(rock)抑制剂”表示抑制rock1和/或rock2活性(诸如激酶活性)的化合物(天然的或合成的)。在本发明的特定实施方案中，所述rock抑制剂是y27632(watanabe等人.naturebiotechnology25,681-686(2007))。通常，培养基中y27632的浓度可以是1-100ng/ml，优选约10ng/ml。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白选自由ln-111、ln-211、ln-332、ln-411、ln-421、ln-511和ln-521组成的组。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人重组层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，以0.5-50微克/毫升(μg/ml)、优选1-10μg/ml、更优选5μg/ml将层粘连蛋白包被在支持物诸如平板上。所述支持物通常是培养容器中的表面。在本发明的一个实施方案中，所述支持物选自由平板、载玻片、烧瓶等组成的组。在本发明的优选实施方案中，所述支持物具有用本发明的基质(诸如人重组ln-111或人重组ln-521)包被的表面的至少一部分。本发明也涉及一种诱导人肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，和(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人de细胞群体。本发明也涉及一种用于得到人de细胞的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，和(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人de细胞群体。本发明也涉及一种诱导人肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人de细胞群体，和(iii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人de细胞群体以产生人成肝细胞样细胞群体。本发明还涉及一种用于得到人成肝细胞样细胞的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人de细胞群体，和(iii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人de细胞群体以产生人成肝细胞样细胞群体。本文中使用的表述“内胚层诱导培养基”或“诱导内胚层分化的培养基”表示能够诱导多能干细胞分化成确定内胚层细胞(且因而能够诱导内胚层标志物诸如sox17和foxa2的表达)的培养基。在本发明的优选实施方案中，所述内胚层诱导培养基是至少包含激活素a且任选地包含wnt3a的化学成分确定的培养基。在本发明的另一个实施方案中，所述内胚层诱导培养基是进一步包含chir99021的化学成分确定的培养基。激活素a是本领域众所周知的，且是通过激活素/nodal途径的刺激发挥一系列细胞效应的二聚体多肽(vallier等人,cellscience118:4495-4509(2005))。天然存在的人激活素a蛋白具有如在genebank登录号np_002183中所示的氨基酸序列。激活素可从商业来源(例如stemgentinc.mausa或miltenyibiotec)容易地得到。通常，所述培养基中激活素a的浓度可以是约10至约1000ng/ml，优选约100ng/ml。天然存在的人wnt3a蛋白具有如在uniprot登录号p56704中所示的氨基酸序列。通常，所述培养基中wnt3a的浓度可以是10-100ng/mlwnt3a，优选约50ng/ml。wnt3a可以购自miltenyibiotec。chir99021是活化wnt/β-连环蛋白途径的gsk3的抑制剂。chir99021可以购自tocrisbioscience,stemgent。通常，所述培养基中chir99021的浓度是约1μm至约10μm，优选约3μm。用内胚层诱导培养基培养多能干细胞的步骤应当进行确定内胚层(de)的生产所需的必要时间。本领域技术人员可以容易地确定该培养步骤的持续时间。例如，在培养过程中，本领域技术人员可以针对由确定内胚层(de)特异性地表达的标志物(例如sox17和foxa2)的表达来监测培养的细胞。当检测到de细胞特有的一种或几种标志物的表达时，可以停止使用肝诱导培养基的培养。可以如下执行这些标志物的监测：使用例如用特异性引物对从培养的细胞提取的rna的rt-pcr分析，使用标志物的特异性抗体的免疫荧光分析，elisa和facs，或检测与特定标志物对应的rna/蛋白/活性的任何方法。通常，所述步骤ii)可以进行1-10天，优选5天。如果必要的话，可以规范的间隔部分地或完全地更新本发明的培养基。通常，可以每两天用本发明的新鲜培养基替换本发明的培养基，持续5天。通过使用任意合适的方法，例如facs，可以分离和/或纯化通过以上方法生产的肝细胞样细胞。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白选自由ln-111、ln-211、ln-332、ln-411、ln-421、ln-511和ln-521组成的组。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人重组层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，以0.5-50微克/毫升(μg/ml)、优选1-10μg/ml、更优选5μg/ml将层粘连蛋白包被在支持物诸如平板上。所述支持物通常是培养容器中的表面。在本发明的一个实施方案中，所述支持物选自由平板、载玻片、烧瓶等组成的组。在本发明的优选实施方案中，所述支持物具有用本发明的基质(诸如人重组ln-111和/或人重组ln-521)包被的表面的至少一部分。在其它方面，本发明涉及一种用于得到人胚胎肝细胞的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人de细胞群体，(iii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人de细胞群体以产生人成肝细胞样细胞群体，和(iv)在肝成熟培养基中培养所述人成肝细胞样细胞群体以产生胚胎肝细胞样细胞的群体。本文中使用的术语“胚胎肝细胞样细胞”或“分化的成肝细胞”在本文中可互换地使用且表示这样的细胞：其表达特征性生化标志物，包括、但不限于hnf4α、cyp3a7、afp和ck19，且可以表达一些成熟的肝蛋白，包括、但不限于alb、aat、ugt1a1和细胞色素p4503a4(cyp3a4)。本文中使用的表述“肝成熟培养基”或“刺激肝成熟的培养基”表示能够诱导成肝细胞样细胞成熟为胚胎肝细胞样细胞的培养基。在本发明的优选实施方案中，所述肝诱导培养基是包含hgf和osm的化学成分确定的培养基。本文中使用的术语“肝生长因子”(hgf)表示在结合原致癌c-met受体以后通过活化酪氨酸激酶信号传递级联而调节细胞生长、细胞运动性和形态发生的生长因子。天然存在的人hgf蛋白具有如在uniprot登录号p14210中所示的氨基酸序列。通常，以1-100ng/ml、优选5-50ng/ml范围内、且甚至更优选约20ng/ml的浓度将hgf加入肝成熟培养基中。hgf可以购自peprotech。本文中使用的术语“制癌蛋白m”(osm)表示抑制许多肿瘤细胞系的增殖的细胞因子。天然存在的人osm蛋白具有如在uniprot登录号p13725中所示的氨基酸序列。通常，以1-100ng/ml、优选5-50ng/ml范围内、且甚至更优选约20ng/ml的浓度将制癌蛋白m加入肝成熟培养基中。osm可以购自miltenyibiotec。用肝成熟培养基培养肝细胞样细胞的步骤应当进行胚胎肝细胞样细胞的生产所需的必要时间。本领域技术人员可以容易地确定该培养步骤的持续时间。例如，在培养过程中，本领域技术人员可以针对多能干细胞的特定标志物(例如sox2和nanog)的表达的缺失、确定内胚层(de)的特定标志物(例如sox17和foxa2)的表达的缺失、成肝细胞的特定标志物的表达和/或由胚胎肝细胞样细胞特异性地表达的标志物(例如afp和alb)的表达来监测培养的细胞。当检测到胚胎肝细胞样细胞特有的一种或几种标志物的表达时，可以停止使用肝成熟培养基的培养。可以如下执行这些标志物的监测：使用例如用特异性引物对从培养的细胞提取的rna的rt-pcr分析，使用标志物的特异性抗体的免疫荧光分析，elisa和facs，或检测与特定标志物对应的rna/蛋白/活性的任何方法。通常，所述步骤ii)可以进行3-60天，优选30天。如果必要的话，可以规范的间隔部分地或完全地更新本发明的培养基。通常，可以每两天用本发明的新鲜培养基替换本发明的培养基，持续30天。通过使用任意合适的方法，例如facs，可以分离和/或纯化通过以上方法生产的胚胎肝细胞样细胞。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白选自由ln-111、ln-211、ln-332、ln-411、ln-421、ln-511和ln-521组成的组。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述层粘连蛋白是人重组层粘连蛋白。在本发明的一个实施方案中，以0.5-50微克/毫升(μg/ml)、优选1-10μg/ml、更优选5μg/ml将层粘连蛋白包被在支持物诸如平板上。所述支持物通常是培养容器中的表面。在本发明的一个实施方案中，所述支持物选自由平板、载玻片、烧瓶等组成的组。在本发明的优选实施方案中，所述支持物具有用本发明的基质(诸如人重组ln-111和/或人重组ln-521)包被的表面的至少一部分。根据本发明的人肝细胞样细胞群体和包含它们的药物组合物在另一个方面，本发明涉及通过如上定义的方法得到的人肝细胞样细胞群体。本发明也涉及通过如上定义的方法得到的人成肝细胞样细胞群体，其中所述细胞表达肝细胞核因子4α(hnf4α)且不表达或基本上不表达甲胎蛋白(afp)。本发明涉及通过如上定义的方法得到的人成肝细胞样细胞群体，其中所述细胞表达hnf4α、细胞角蛋白19(ck19)和细胞色素p4503a7(cyp3a7)且不表达或基本上不表达afp、白蛋白(alb)、α-1抗胰蛋白酶(aat)、细胞色素p4503a4(cyp3a4)、尿苷二磷酸(udp)-葡糖醛酸基转移酶1a1(ugt1a1)。在另一个方面，本发明涉及通过如上定义的方法得到的人胚胎肝细胞群体。本发明也涉及通过如上定义的方法得到的人胚胎肝细胞样细胞群体，其中所述细胞表达hnf4α、ck19、cyp3a7、afp、alb、aat和ugt1a1，和细胞色素p4503a4(cyp3a4)。在一个实施方案中，所述人肝细胞样细胞表现出正常表型。在另一个实施方案中，所述人肝细胞样细胞表现出基因突变，尤其是影响人肝细胞样细胞内的关键蛋白且与肝病有关的基因突变。应当指出，可以在体外或离体地校正引起疾病表型的基因突变或缺陷。可得到多种用于校正分离的哺乳动物细胞中的基因突变或缺陷的技术。本发明的人肝细胞样细胞的遗传修饰术语“遗传修饰的”指示，人肝细胞样细胞包含在未修饰的人肝祖细胞中不天然存在的核酸分子，或以非天然状态(例如，经过扩增的)存在于所述人肝祖细胞中的核酸分子。核酸分子可能已经被引入所述细胞或其祖先(诸如含有肝病有关的基因突变的ips)中。许多方案可以用于遗传修饰人肝细胞样细胞，诸如病毒介导的基因递送、非病毒介导的基因递送、裸dna、物理处理等。为此目的，经常将所述核酸引入载体(诸如重组病毒、质粒、噬菌体、附加体、人工染色体等)中。在本发明的特定实施方案中，使用病毒载体(或重组病毒)或非病毒方法遗传修饰肝细胞样细胞(hlc)或多能干细胞。在该实施方案中，将所述异源核酸例如引入重组病毒中，然后将所述重组病毒用于感染人肝细胞样细胞(hlc)。可以使用不同类型的重组病毒，尤其是慢病毒。在优选的实施方案中，所述慢病毒编码永生化蛋白，诸如sv40t、htert、cdk4等。在另外的优选的实施方案中，所述慢病毒编码野生型蛋白(这样的蛋白经常在遭受肝病的患者中表现出疾病有关的基因突变)，诸如野生型α1-抗胰蛋白酶(aat)蛋白或udp葡糖醛酸基转移酶1家族多肽a1(ugt1a1)。以前已经描述了在肝疾病中涉及的其它基因突变。在一个实施方案中，所述编码目标蛋白(例如用于校正疾病表型的永生化蛋白或野生型蛋白)的核酸序列有效连接到启动子。可替换地，所述慢病毒编码报道蛋白或标志蛋白。所述标志蛋白(其可以是荧光蛋白或细胞表面表达的蛋白)允许快速地鉴别和分离目标人肝细胞样细胞(hlc)。所述标志蛋白可以例如选自由下述组成的组：-荧光蛋白，尤其是绿色荧光蛋白(gfp)或它的衍生物，例如增强的绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白(ebfp、ebfp2、azurite、mkalamal)、蓝绿色荧光蛋白(ecfp、cerulean、cypet)和黄色荧光蛋白(yfp、eyfp、citrine、venus、ypet)；和-任何细胞表面表达的蛋白，其不由hlc天然地表达。本文中使用的术语“有效连接的”是指，所述的组分处于允许它们以它们的预期方式起作用的关联中。因而，核酸序列当置于与另一个序列核酸序列的功能关联中时是“有效连接的”。例如，如果启动子造成编码序列的转录，那么所述启动子与所述编码序列“有效连接”。通常，有效连接是指连接的核酸序列是邻近的。本文中使用的术语“启动子”表示决定rna聚合酶的转录起始位点的dna序列。启动子可以包含rna聚合酶iii启动子，其可以提供跨多种细胞类型的高水平的组成型表达，且足以指导位于远侧的序列的转录，所述序列是在细胞中与启动子序列的3'末端连接的序列。合适的启动子包括，例如，组成性的、受调节的、组织特异性的或普遍存在的启动子，其可以是细胞的、病毒的或合成的起源。在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子诸如人延伸因子-1α(ef-1α)等。在另一个实施方案中，所述启动子是肝特异性的启动子，例如，人1-抗胰蛋白酶、白蛋白等。在另一个实施方案中，所述启动子是内源性序列(组成性的或特异性的)。在该情况下，通过基于人工核酸酶(例子：crispr/cas、zfns、talens)的使用的基因组编辑技术，将目标蛋白与内源性启动子连接。在另一个实施方案中，通过基因组编辑技术进行人肝细胞样细胞的基因修饰以修饰内源基因序列。重要的是，肝细胞谱系细胞(hlc)是经常被称作“肝疾病”(也称作“与肝损伤有关的病状”)的多种病症中的疾病靶标。这些术语表示以肝损伤、损害、功能障碍、缺陷或异常为特征的任何疾病或临床状况。因而，该术语包括，例如，损害、变性疾病和遗传性疾病。肝疾病正在变成发展中国家的最常见死亡原因之一。该组靶向肝细胞谱系细胞(诸如代表主要肝脏细胞的肝细胞)的疾病包括遗传性代谢障碍(诸如克里格勒-纳贾尔综合征i型、糖原贮积病、尿素循环缺陷、家族性高胆固醇血症、酪氨酸血症和威尔森氏病)、慢性肝衰竭以及急性肝衰竭，其可能由病毒感染(尤其是hbv或hcv感染)、毒素(酒精)和药物或自身免疫障碍(自身免疫性慢性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎)造成。在另一个方面，本发明还提供了包含根据本发明的人肝细胞样细胞群体的药物组合物。所述药物组合物通常可以包括一种或多种药学上可接受的和/或经批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂、溶剂和/或稳定剂。这样的辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。合适的载体通常是大的、缓慢地代谢的分子，诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。该药物组合物可以含有另外的添加剂，诸如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或其它添加剂，诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)或适合于体内施用的维生素。本文中使用的术语“药学上可接受的”表示当施用给哺乳动物、特别是人(在适当的情况下)时不会产生不利的、变应性的或其它不良的反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂表示任何类型的无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。本发明的筛选方法在另一个方面，从健康的或患病的患者得到的本发明的人肝细胞样细胞也可以有利地用于制药工业中的筛选应用。这样的筛选试验可以用于寻找具有临床用途的新药物或化合物(诸如药物候选化合物)的肝毒性的毒理学试验评价。根据本发明的人肝细胞样细胞可以例如用于产生如上所述的肝疾病的细胞模型。因此，本发明提供了一种筛选可用于治疗肝病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)使通过本发明的方法产生的人成肝细胞样细胞群体或胚胎肝细胞样细胞与试验化合物接触，和(b)确定所述试验化合物对所述人成肝细胞样细胞或胚胎肝细胞样细胞的影响。本发明的另一个方面涉及一种用于筛选具有肝保护性的或肝毒性的或肝增殖性的作用的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)使通过本发明的方法产生的人成肝细胞样细胞群体或胚胎肝细胞样细胞与试验化合物接触，和(b)将步骤a)的细胞的存活与在没有所述试验化合物存在下培养的如上定义的所述细胞群体的存活进行对比。术语“肝毒性的”表示引起肝祖细胞存活的下降的化合物。如果在有所述化合物存在下培养的活细胞的数目低于在没有所述化合物存在下培养的活细胞的数目，认为所述化合物具有肝毒性作用。术语“肝保护性的”表示导致肝祖细胞存活的增加的化合物。如果在有所述化合物存在下培养的活细胞的数目高于在没有所述化合物存在下培养的活细胞的数目，认为所述化合物具有肝保护作用。通常，可以在没有肝营养因子存在下测定肝保护作用。可替换地，可以在有已知的肝毒性药物存在下测定肝保护作用。已知的肝毒性药物包括、但不限于胺碘酮、甲氨蝶呤、呋喃妥因。术语“肝增殖性的”表示导致肝祖细胞增殖增加的化合物。如果在有所述化合物存在下培养的增殖细胞的数目高于在没有所述化合物存在下培养的活细胞的数目，认为所述化合物具有肝增殖作用。通常，可以在没有生长因子存在下测定肝增殖作用。本发明的试验化合物在一个实施方案中，所述试验化合物可以选自由肽、蛋白、肽模拟物、小有机分子、适体或核酸组成的组。例如，根据本发明的试验化合物可以选自以前合成的化合物的文库，或在数据库中确定其结构的化合物的文库，或已经从头合成的化合物的文库。在特定实施方案中，所述试验化合物可以选自小有机分子。本文中使用的术语“小有机分子”表示与在药物中通常使用的那些有机分子大小相当的分子。该术语不包括生物大分子(例如；蛋白、核酸等)；优选的小有机分子的大小范围高达2000da，且最优选地高达约1000da。在另一个实施方案中，所述试验化合物可以选自核酸文库，包括、但不限于shrna、mirna、mrna。动物模型可能从人es或ips衍生出的肝细胞样细胞的可用性进一步使得设计人肝疾病和亲肝病毒(尤其是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒)的体外和体内模型成为可能。更具体地，通过将人肝祖细胞移居至非人哺乳动物的肝脏，可以提供人肝疾病和亲肝病毒的体内模型。因此，本发明还涉及通过根据本发明的方法得到的人肝细胞样细胞用于生产包含功能性人肝细胞的非人哺乳动物宿主的用途。产生包含功能性人肝细胞的嵌合非人哺乳动物的合适方法可包括以下步骤：将根据本发明的人肝细胞样细胞注射进所述非人哺乳动物的肝中。为了有利于hlc的移植物植入，所述非人哺乳动物可以接受抗巨噬细胞处理以控制非顺应性防御。这可以例如如下实现：施用二膦酸二氯亚甲酯，例如通过腹膜内注射脂质体包封的二膦酸二氯亚甲酯。有利于hlc的移植物植入的其它策略可以依赖于在细胞注射之前刺激肝再生。这可以如下进行：例如，通过执行肝损害(例如部分肝切除术、化学栓塞、肝辐照、肝毒素、转基因)，或通过施用刺激肝细胞增殖的任何化合物(肝细胞生长因子、t3激素)。在另一个策略中，通过抑制再生肝(年轻动物或受损伤的肝)中内源性肝细胞的增殖潜力，也可以有利于hlc的移植物植入。这可以如下实现：例如通过施用惹卓碱(腹膜内注射)、丝裂霉素c(腹膜内注射)或盐酸萘氧丙醇安(饮用水)。最后，通过施用血管舒张化合物，可以有利于hlc的移植物植入。这可以例如通过施用硝酸甘油来实现。本发明还涉及一种嵌合非人哺乳动物，其包含通过本发明的方法或可通过本发明的方法得到的功能性人肝细胞。本发明的非人哺乳动物可以是可向其中引入并维持人肝细胞的任何非灵长类哺乳动物。这包括、但不限于马、绵羊、牛、猫、狗、大鼠、仓鼠、兔、沙鼠、豚鼠和小鼠。优选地，所述宿主动物是啮齿动物，更优选小鼠。它还可以是非人灵长类动物(恒河猴)。所述非人哺乳动物可以具体地是免疫受损的哺乳动物，其通常不能产生针对异种细胞(人肝细胞)的完全免疫应答。适合于植入的免疫受损的哺乳动物宿主存在，或者可以例如通过施用一种或多种化合物(例如环孢菌素、他克莫司)或由于遗传缺陷而建立，所述遗传缺陷导致例如不能在编码免疫球蛋白和t-细胞抗原受体的位置处发生种系dna重排。可以如下监测人肝细胞的功能性：关注肝细胞活性的替代标志物，包括通过免疫学或定量标准可与它们的非人哺乳动物(尤其是啮齿类动物)类似物辨别的人肝细胞的生理学产物，例如，人血清白蛋白的表达，或ugt1a1活性缺陷的动物中的血清胆红素水平(也被称作胆红素血症)等。这些标志物可以用于在不处死接受者的情况下确定细胞的存在。包含功能性人肝细胞的嵌合非人哺乳动物可以具体地用作人乙型肝炎感染的体内模型。治疗方法和用途一个主要应用领域是细胞疗法或再生医学。再生医学可以用于如下潜在地治愈由机能障碍、受损伤的或失效的组织引起的任何疾病：通过直接在体内植入包含本发明的肝细胞样细胞的药物组合物，在体内再生受损伤的组织。本发明也涉及一种治疗肝病或用于治疗肝病的药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的肝细胞样细胞群体和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成或基本上由其组成。本发明的另一个目的是治疗肝病或用于治疗肝病的药物，所述药物包含肝细胞样细胞群体，或由其组成或基本上由其组成。如本文中使用的，参考药物组合物或药物的术语“基本上由……组成”是指，本发明的至少一种化合物是在所述药物组合物或药物内的具有生物学活性的唯一治疗剂或试剂。药学上可接受的赋形剂表示任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，所述赋形剂包含添加剂蛋白、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化的糖诸如多羟糖醇、醛糖酸、酯化的糖等；和多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，包括单独地或以1-99.99％(重量或体积)组合。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白诸如人血清白蛋白(hsa)、重组人白蛋白(rha)、明胶、酪蛋白等。还可以在缓冲能力方面起作用的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦等。碳水化合物赋形剂也意图在本发明范围内，其例子包括、但不限于：单糖类，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二糖类，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖类，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；和多羟糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨醇(葡糖醇)和肌醇。对于人施用，制品应当满足管理部门(例如，fda部门或ema)要求的无菌度、致热原性、一般安全性和纯度标准。本发明也涉及用于人体治疗方法中的人细胞群体，其属于肝细胞谱系，但是没有完全分化。本发明也涉及用于肝病治疗中的人细胞群体，其属于肝细胞谱系，但是没有完全分化。肝疾病的例子包括、但不限于，肝硬化、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝炎、脂肪肝病、妊娠脂肪肝、病毒诱导的甲、乙、丙、丁和戊型肝炎、铁过载障碍、肝纤维化、先天性肝病(诸如1型crigler-najjar(cn1)、威尔森氏病、尿素循环障碍、酪氨酸血症、家族性高胆固醇血症、血友病、瓜氨酸血症、进行性家族性肝内胆汁淤积、糖原贮积病)、急性肝衰竭暴发性肝炎、亚暴发性肝炎、肝癌、高胆固醇血症。这样的疾病可以由环境因素诱导，所述环境因素包括、但不限于，药物、毒蘑菇、手术后感染、病毒、细菌和酒精。本发明的另一个方面因而涉及本发明的肝细胞样细胞(例如成肝细胞样细胞)群体，其用于人体治疗方法。在一个实施方案中，所述人成肝细胞样细胞群体是如上所述的表达肝细胞核因子4α(hnf4α)且不表达或基本上不表达甲胎蛋白(afp)的细胞群体。更具体地，本发明的一个方面涉及本发明的肝细胞样细胞群体，其用于肝病治疗。在一个实施方案中，所述人成肝细胞样细胞群体是如上所述的表达肝细胞核因子4α(hnf4α)且不表达或基本上不表达甲胎蛋白(afp)的细胞群体。本发明也涉及一种治疗肝病的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的受试者或患者施用药学有效量的本发明的肝细胞样细胞群体。在本发明的上下文中，本文中使用的术语“治疗”或“处理”表示这样的方法：其目的在于延迟或预防病状的发作，逆转、减轻、抑制、减慢或停止病状的征状的进展、加重或恶化，实现病状的征状的改善，和/或治愈病状。本文中使用的术语“药学有效量”表示足以实现预期目的的根据本发明的人肝细胞样细胞群体(或其药物组合物)的任何量。有效剂量和施用方案可以基于受试者的征状的性质通过良好医学实践容易地确定，且取决于许多因素，包括、但不限于，施用途径、病状的征状的程度、目标组织或器官的损伤或变性的具体征状和程度、以及受试者的特征(例如、年龄、体重、性别、一般健康等)。对于治疗，可以通过不同途径施用根据本发明的人肝细胞样细胞群体和药物组合物。本领域技术人员可以以已知的方式优化剂量和施用次数。在一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物、药物局部地或全身性地施用。在一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物、药物局部地施用，且包括、但不限于，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物、药物向肝内部、周围或附近、肝实质中、肝glisson氏囊下、肾被膜下、脾中、胰腺中、腹膜和网膜袋中的注射或输注或植入。优选地，所述局部施用是经由灌入肝(门静脉、动脉、静脉、肠系膜静脉)的血管的注射或输注或植入。在另一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物或药物要本发明的人肝细胞样细胞群体的分化环境中施用。这样的施用途径可以通过外科手术程序、腹腔镜检查外科手术、经由导管系统或腹腔植入来实现。在一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物、药物全身性地施用，且包括、但不限于肠内或胃肠外施用。适合注射或输注或植入的制剂的例子包括、但不限于：液体溶液或混悬液，适合于在注射之前溶解或混悬在液体中的固体形式。注射的例子包括、但不限于静脉内、主动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、真皮内和腹膜内注射或灌注。在另一个实施方案中，当注射时，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物或药物是无菌的。用于得到无菌药物组合物的方法包括、但不限于gmp合成(gmp代表“良好生产规范”)。在一个实施方案中，将本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物或药物包封。胶囊剂的例子包括、但不限于基质胶、水凝胶。在一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物或药物以持续释放形式施用。在另一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物或药物包含控制药剂的释放的递送系统。在一个实施方案中，将治疗有效量的本发明的人肝细胞样细胞群体、药物组合物或药物在受试者的寿命中施用至少一次或几次，以在所述受试者中得到和/或维持治疗益处。在另一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞群体或药物组合物或药物的治疗有效量范围是约1百万至约2亿个细胞/千克体重，优选约2500万细胞/千克体重。本文中在数字前面使用的术语“约”是指所述数字的值±10％。在一个实施方案中，所述受试者受肝病影响，优选地被诊断出肝病。在一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞可以用于遭受肝病的患者的自体再生治疗，所述患者由于特定障碍或与这样的障碍有关的治疗而需要再生治疗，所述障碍包括、但不限于，由可以在体外替换的一个经鉴别的基因中的缺陷引起的1型crigler-najjar(cn1)。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的人肝细胞样细胞，其用作植入人患者中的细胞疗法产品，用作同种异体移植物，或在遗传校正以后用作自体移植物(即所述细胞具有与受试者/患者的细胞相同的基因型)。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的人肝细胞样细胞，其用作辅助肝。在一个实施方案中，当施用时，本发明的肝细胞样细胞定位在脾中。在一个实施方案中，含有本发明的肝细胞样细胞的脾作为第二个肝起作用。在一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞可以如下用于生物工程改造的肝：通过将它们与其它肝-谱系细胞一起输入去细胞化的肝中，通过从人ipsc制备血管化的和功能性的人肝，其通过在体外建立的肝芽的移植(takebe等人nature2013499)，通过3d打印或用于制备肝组织的每种其它方法而实现。在另一个实施方案中，本发明的人肝细胞样细胞可以如下用于生物人工肝：通过将它们输入体外装置中或在输注进身体之前将它们包埋在生物基质或水凝胶(诸如海藻酸盐、硅烷化的羟丙基甲基纤维素)中。下述附图和实施例将进一步例证本发明。但是，这些实施例和附图不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。实施例1：ln-111作为使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的基质的用途和如此得到的成肝细胞样细胞样细胞在治疗中的用途。材料和方法与法国和欧洲规则一致地进行该研究。hipsc的维持：在5％co2培养箱中，在mtesr1(stemcelltechnologies,vancouver,bc,加拿大)中于37℃将bbhx8hipsc[46]系维持在matrigel(bdbiosciences,sanjose,ca,美国)包被的培养孔中，每天更换培养基。每5-7天用gentlecelldissociationreagent(stemcelltechnologies,vancouver,bc,加拿大)将细胞传代。体外肝分化：按照基于以前研究[16,20,40]的3步骤方案，经过一些修改，进行人多能干细胞的肝分化。首先，对于确定内胚层分化，使用tryple(lifetechnologies,carlsbad,ca,美国)收获细胞，使用adam自动细胞计数器(labtech,palaiseau,法国)计数，然后以75x103个细胞/cm2的细胞密度铺在用5μg/ml层粘连蛋白111(biolamina,sundbyberg,瑞典)或2mg/mlmatrigel(bdbiosciences,sanjose,ca,美国)预包被的平板(costar；corninglifesciences,acton,ma)中。将它们在补充了b27无血清补充物(lifetechnologies,carlsbad,ca,美国)(rpmi/b27)、100ng/ml激活素a(miltenyibiotec,paris,法国)、50ng/mlwnt3a(r&dsystems,minneapolis,mn,美国)、10μmrock抑制剂(stemcelltechnologies,vancouver,bc,加拿大)和任选的chir99021的rpmi1640中培养1天。分别在接下来的2天和3天从培养基省略rock抑制剂和wnt3a。在接下来的4天，在含有100ng/ml激活素a的rpmi1640/b27中培养细胞，并每天更换细胞。其次，对于肝向特化(hepaticspecification)，然后在2天中在补充了10ng/ml成纤维细胞生长因子(fgf)10(miltenyibiotec,paris,法国)和10ng/ml骨形态发生蛋白(bmp)4(r&dsystems,minneapolis,mn,mg)的rpmi/b27中培养细胞，每天更换培养基。然后在3个用5μg/ml层粘连蛋白111或2mg/ml基质胶预包被的平板中使用tryple以70x103个细胞/cm2的细胞密度将细胞分流。将它们在补充了10ng/mlfgf10、10ng/mlbmp-4和10μmrock抑制剂的rpmi/b27中培养1天，并在次日从培养基中省略rock抑制剂。最后，对于肝成熟，在补充了20ng/ml肝细胞生长因子(hgf)(miltenyibiotec,paris,法国)和20ng/ml制癌蛋白m(osm)(miltenyibiotec,paris,法国)的肝细胞培养基(lonza,瑞士)(成熟培养基)中培养细胞4天。在之后的日子，从培养基省略hgf，且每2天更换培养基。免疫荧光测定：将培养的细胞用4％低聚甲醛在室温固定20min，用在pbs中的0.5％的tritonx-100溶液渗透化处理15min，并用在pbs中的3％的bsa溶液封闭15min。将细胞与第一抗体在室温温育1小时。抗人aat(1:100)、ck19(1:50)和afp(1:300)的第一抗体购自dako(dakocytomation,trappes,法国)；抗人oct4(1:100)、hnf4α(1:100)的抗体购自tebubio(leperray-en-yvelines,法国)。用pbs0.1％triton洗涤几次以后，用在pbs1％bsa0.1％triton中1/1000稀释的抗-小鼠、抗-山羊(二者得自lifetechnologies)或抗-兔(abcam)igg第二抗体(与alexa488、555或647缀合)在室温反应30分钟。然后将细胞用在pbs中1/10,000稀释的dapi在室温复染色1分钟，并在倒置荧光显微镜(来自amg的evosfl)上读出。为了评价分化的细胞的比例，获取来自10个独立分化的随机照片，然后与全部细胞一起针对分化标志物计数阳性细胞。流式细胞术：对于流式细胞术，将分化的细胞与accutase一起在37℃温育2min。将解离的细胞用0.25％低聚甲醛在4℃固定30min，然后用在pbs中的0.2％吐温-20溶液在37℃渗透化处理15min。在有或没有在pbs中的0.5％的bsa溶液中稀释的第一抗体存在下，将细胞用3％bsa/pbs封闭30min/4℃。洗涤(用pbs)以后，将细胞与3％bsa/pbs一起温育，随后与驴抗-小鼠alexafluor488缀合的抗体一起在4℃温育20min。使用bdlsrii流式细胞计(bdbiosciences)进行流式细胞术分析。动物研究：将动物圈养在nantesuniversitymedicalschool(nantes,法国)的动物设施中，并维持在12-小时光照周期下，随意进食，接受根据frenchministèredel'agriculture的指南的人护理。将120±30g体重(年龄：8-9周龄)的纯合(j/j)耿氏大鼠用于研究。肝功能试验：从眶后窦抽取血液。在nantesuniversity医院的常规生物化学系测量血清总胆红素和丙氨酸和天冬氨酸氨基转移酶。组织学和免疫组织化学：免疫组织化学分析涉及免疫过氧化物酶技术在固定的石蜡包埋切片上的应用。将兔多克隆抗-ugt1a1(1:50；abgentinc.,sandiego,美国)、抗甲胎蛋白(1:250；dako,glostrup,丹麦)和小鼠单克隆抗-血清白蛋白(1:200；r&dsystemseurope；abingdon,英国)抗体用于人细胞检测。简而言之，将4μm厚肝切片脱蜡并在柠檬酸盐缓冲液(ph＝6,10％,dako)中在98℃预处理40min。在h2o2(dako)中处理5min和在tbs吐温(scyteklaboratories,westlogan,美国)中处理另外5min以后，将切片与第一抗体、bsa2％和tbs吐温一起在37℃温育30min。使用envision第二试剂(dako)和用于免疫过氧化物酶的dabliquidsubstrate(dako)检测结合的抗体。rt-qpcr：根据生产商的说明书使用rneasy微型试剂盒(qiagen)，或按照生产商的说明书使用(lifetechnology,carlsbad,ca)，从培养的细胞分离总mrna。使用nanodrop定量分离的mrna，每个反应使用10ng的总量。使用powerexpressone-stepgreenertmkit(lifetechnology,carlsbad,ca,美国)，用viia7序列检测系统(lifetechnologies,carlsbad,ca,美国)进行转录物的分析。引物序列如下：名称序列seqidno:afp-fgcttggtggtggatgaaaca1afp-rtcctctgttatttgtggcttttg2alb-fgcacagaatccttggtgaacag3alb-ratggaaggtgaatgttttcagca4ck19-fctcccgcgactacagccact5ck19-rtcagctcatccagcaccctg6cyp3a4-fagatgcctttaggtccaatggg7cyp3a4-rgctggagatagcaatgttcgt8cyp3a7-faaggtcgcctcaaagagaca9cyp3a7-rtgcactttctgctggacatc10foxa2-fgcactcggcttccagtatg11foxa2-rcacgtacgacgacatgttca12gapdh-faatcccatcaccatcttcca13gapdh-rtggactccacgacgtactca14hnf4-ftggacaaagacaagaggaacc15hnf4-ratagcttgaccttcgagtgc16sox2-fcctactcgcagcagggcacc17sox2-rctcggcgccggggagataca18sox17-ftttcatggtgtgggctaagg19sox17-rcggccggtacttgtagttg20如前面所述进行pcr方法和使用2-δδct定量方法对归一化至gapdh值以后的相对基因表达数据的分析。将mrna表达水平定义为给定样品中的mrna水平相对于未分化的细胞中的水平的倍数变化。如下计算mrna表达水平：mrna表达水平＝2-δδct，其中δδct＝(ct靶-ctgapdh)样品-(ct靶-ctgapdh)。通过扩增子解链曲线检查特异性扩增。使用agpath-idtmone-steprt-pcrreagents(lifetechnology,carlsbad,ca,美国)和适当的引物对(appliedbiosystems)，用viia7序列检测系统(lifetechnologies,carlsbad,ca,美国)进行转录物的其它分析。基因供应商参考oct4(pou5f1)lifetechnologieshs00999632_g1nanoglifetechnologieshs04260366_g1foxa2lifetechnologieshs00232764_m1sox17lifetechnologieshs00751752_s1hnf4alifetechnologieshs00230853_m1ck19(krt19)lifetechnologieshs00761767_s1afplifetechnologieshs00173490_m1cyp3a7lifetechnologieshs00426361_m1alblifetechnologieshs00910225_m1aat(serpina1)lifetechnologieshs01097800_m1gapdhlifetechnologieshs99999905_m1elisa：根据生产商的说明书通过elisa评估培养物上清液中的人甲胎蛋白(afp)(calbiotech)和白蛋白(bethyllaboratories)的分泌。肝细胞移植：使用tryple使细胞(1x107个细胞)从平板脱离，洗涤，再悬浮于200μl生理血清中，并用26-号蝴蝶针注射进耿氏大鼠的下脾极中，所述耿氏大鼠已经在24小时以前进行2/3部分肝切除术以建立对于细胞移植而言最佳的环境[48]。将大鼠在细胞移植以前1天每天用0.2mg/kg的他克莫司免疫抑制，持续3天，且此后用0.1mg/kg。统计分析：将数据表达为平均值±sem。使用用于windows的graphpad5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca)进行统计分析。使用用于组之间的对比的mann-whitney检验评估统计显著性。认为<0.05的p-值是统计上显著的。结果我们修改和组合了以前报道的方案[16,20,36,40]，来开发符合gmp的方法，其中使用化学上确定的条件(无异源物种成分的、无饲喂细胞的)和重组因子从hipsc生产hlc。将层粘连蛋白-111(ln111)在胚胎肝中表达[41]，且层粘连蛋白异形体主要存在于matrigeltm中。我们假定ln111可以构成用于起始和支持hipsc的肝分化的有效细胞外基质。我们的用于体外产生hlc的3-步骤分化方案概述在图1a中。我们使用人ipsc细胞系bbhx8作为已知会分化成hlc的代表性细胞系[40,42]。当hipsc是70-90％汇合时，将细胞收获并铺在用重组ln111包被的盘上。为了得到更可再现的肝分化过程，将细胞酶促地收获，并将单细胞混悬液计数和铺在新ln111包被的盘中，而不是使用基于经验细胞密度显影的标准方法来评价时间和细胞比率分裂来起始hlc生产。在第0天，hipsc是多能标志物(nanog,sox2)阳性的(图1b)，并且是确定内胚层(sox17,foxa2)(图1c)和肝标志物(hnf4a,alb,afp,细胞色素p450)(图1d)阴性的。用agpath-idtmone-step用更准确的rt-qpcr分析证实了这些实验(图4)。将细胞用激活素a和碱性成纤维细胞生长因子处理以产生确定内胚层。分别使用向wnt3a和rock抑制剂的短暴露改善酶促细胞收获以后确定内胚层的表达和细胞存活[16,36]。在第5天，超过80-90％的细胞强烈地表达确定内胚层标志物sox17和foxa2并丧失多能基因的表达(图1b)。然后如前面所述，将得到的确定内胚层细胞在有fgf10和bmp4(在早期胚胎肝发育的最初信号传递途径中涉及的2种关键因子)存在下培养[43]。在细胞处理3天以后(分化的第8天)，将细胞在新的ln111包被的盘上酶促地传代，以繁殖它们并继续肝向特化阶段3天。在第11天，对于在肝发育的早期阶段中在肝祖细胞中表达的标志物(hnf4a,ck19和cyp3a7)而言，几乎所有的细胞是阳性的(图1d)。它们是甲胎蛋白(afp)(成肝细胞的一种标志物)、白蛋白(alb)、aat(α-1抗胰蛋白酶)和细胞色素p4503a4(cyp3a4)(它们是成熟肝细胞的标志物)阴性的。它们不表达sox17且具有降低的foxa2水平。为了直接分化成肝细胞样细胞(afp的表达)，将细胞在有osm和hgf存在下培养4天。在相同阶段，用agpath-idtmone-step试验细胞，并得到了类似的结果(参见图5和6)。总之，结果表明，它们具有成肝细胞的表型[44,45]。在第20天以后，hipsc衍生的成肝细胞表达hnf4a、ck19、afp和cyp3a7(在胚胎肝细胞中表达的一种cyp450酶)，并获得成熟肝细胞的一些标志物(alb,aat,ugt1a1,cyp3a4)的表达且已经丧失foxa2表达，如通过rt-qpcr分析所评估的(图1d)。根据这些结果，通过elisa测定证实了细胞上清液中的afp的分泌。但是，我们没有检测到白蛋白的分泌，可能是因为白蛋白mrna的低表达水平(图1e)。当在基质胶包被的盘上分化hipsc时，得到类似的结果。总之，结果表明，在我们的培养条件中，但是具有重组基质，ln111与基质胶一样有效地起始和支持hipsc的肝分化。我们的研究扩展了一项最近研究，后者表明ln111包被的盘允许将hipsc维持在成肝细胞样细胞阶段，其在基质胶包被的盘上在hipsc-内胚层和肝向特化以后[36]。它是与表明hlc在体外较差地成熟的以前研究一致的。在第20-30天，我们的hlc没有分泌白蛋白，可能因为我们不是在有增加hlc成熟度的地塞米松或dmso存在下进行培养。可以如下生产类似于人原代肝细胞的高度成熟的hlc：将它们在3d培养或微图案化的共培养条件下培养[34,46]。为了探究治疗效果，在免疫抑制的耿氏大鼠中，在移植idhb(在ln111包被的盘上肝分化的第11天)以后随时间监测血清胆红素水平。如在图2中所示，细胞移植以后在治疗组中存在基线胆红素水平在60天历程中的进行性下降。此后，血清胆红素血症的下降在研究中维持在28±5％的水平，并且与移植前值相比是统计上显著的(p<0.05)。治疗组中的血清胆红素在处死时为57±5μm，与此相比，移植前值为84±11μm(p＝0.005)。移植冷冻的idhb以后，观察到胆红素血症的类似下降(图10)。相对于经治疗的大鼠，对照组中的血清胆红素没有下降且保持升高，具有高达150μm的值。在新鲜的和冷冻的肝细胞中证实了这些结果(图10)。免疫化学分析揭示了表达udp-葡糖醛酸基转移酶1-a(ugt1a1)的细胞的存在，从而证实移植的idhb具有移入肝实质中的能力，尽管在非常低的水平(<0.1％)(参见图11中的箭头)。它们遍布于肝实质中，且主要作为单个细胞。这与正常肝细胞在动物肝中的低移植物植入效力一致，其中不存在移植的细胞的选择性生长优势[37,47-50]。大多数ugt1a1-阳性的人细胞也在脾中检测到，并且占脾的约1-2％(图11)。没有检测到表达人afp的细胞。这些数据表明，脾促进idhb进一步成熟为成年肝细胞。所有动物的肝以及其它器官(未显示)的组织学是正常的。在经治疗的大鼠中的天冬氨酸氨基转移酶(ast)和丙氨酸氨基转移酶(alt)(肝细胞损害的确定标志物)的血清水平在移植后第10天分别为1.59±0.21μkat/l和1.07±0.16μkat/l，且在处死时分别为2.07±0.85μkat/l和0.95±0.19μkat/l。这些值没有不同于外科手术前值(ast:2.44±1μkat/l和alt:1.46±0.75μkat/l)或移植后第10天(ast:1.59±0.12μkat/l和alt:1.03±0.12μkat/l)和处死时(ast:1.61±0.53μkat/l和alt:1.13±0.33μkat/l)的对照大鼠值。γ-谷氨酰基转移酶值在这些时间点也是正常的(<0.05μkat/l)。这些结果表明，动物从外科手术程序恢复良好。为了跟踪移植的人细胞的体内功能性，我们随时间测量了动物血清中的人afp和人白蛋白。在一只动物中，我们在细胞移植后第11天可以检测到显著水平的血清人afp(高于对照大鼠血清的背景)(16ng/ml)，并且此后逐渐变得不可检测。在两只其它动物中，我们可以在移植后5个月检测到血清人白蛋白的出现，尽管在非常低的水平(6和23pg/ml)。在其它移入的耿氏大鼠的血清中没有检测到可检测水平的人白蛋白和人afp，可能是由于肝中非常低数目的人细胞。总之，我们首次证实了基于hipsc的再生在移植的细胞相对于固有的啮齿动物肝细胞没有任何选择性生长优势的情况下用于治疗遗传性肝代谢疾病的功效，所述情况是在人类的肝细胞移植中遇到的情形[9]。在出黄疸的成年耿氏大鼠中细胞移植以后，我们用新鲜制备的和冷冻的治疗性人细胞证实了高胆红素血症的持久显著下降。治疗功效等价于使用慢病毒校正的原代肝细胞通过离体基因治疗在耿氏大鼠中得到的效果[51]。值得注意的是，它像从新生儿人肝分离的肝细胞的移植一样有效，且高于从成年人肝分离的肝细胞(其为用于治疗耿氏大鼠的人细胞疗法的黄金标准细胞[61])的效果。在本研究中，使hipsc分化成不表达udp-葡糖醛酸基转移酶1-a(ugt1a1)的成肝细胞样细胞，用于细胞移植。我们的结果表明了原位成熟已经发生以获得ugt1a1活性的确凿证据，所述ugt1a1活性在移植后8周达到最大。我们还在某些动物中检测到血清afp的瞬时表达和血清白蛋白生产的出现。我们的结果与表明肝会提供未成熟肝细胞(即从胚胎肝分离的肝细胞)的终末分化的以前研究一致[52,53]。近年来，已经报道，指向分化的成肝细胞(表达afp)的hipsc能够在鼠肝中进一步分化，在此处它们丧失afp表达[14,23,54,62]。我们的研究现在指示，指向成肝细胞的hipsc能够移入另一个物种的肝中并获得足够水平的原位成熟度，以确保在正常肝再生背景下的代谢肝功能。此外，我们证实了脾也构成用于促进进一步分化为成年肝细胞的适当部位，这在使用hlc的以前研究中没有报道过。重要的是，通过idhb实现的肝移植物植入的体内功能性持续了长时间段(6个月)，没有肿瘤形成(癌或畸胎瘤)和肝损伤的征象，如通过组织学和血液参数分析所评估的。像移植进成年肝中的正常原代肝细胞一样[51]，idhb作为单个细胞重新定居于肝，从而提示，当肝再生已经终止且肝已经恢复至有丝分裂静止时，它们确实对抗增殖刺激做出应答。另外，在睾丸中直接注射idhb以后2个月没有观察到畸胎瘤，从而证实了残余的未分化的hipsc在hlc细胞制品中的缺失。最后，我们的研究也提供了通向hipsc用于治疗遗传性肝疾病的临床应用的重要步骤，因为我们已经在无血清的、无异源物种成分的且化学上确定的确定肝分化方案中生产了hlc，所述方案满足gmp生产标准。我们选择在肝祖细胞阶段(hnf4-α的表达和afp的一些表达)收获hlc，因为从人胚胎肝分离的肝祖细胞具有比成年肝细胞更有效地移入并在移植的受体肝内迁移的能力[55-57]。还已经证实，hipsc衍生的内胚层细胞具有比表达afp的肝祖细胞样细胞和成熟肝细胞(表达白蛋白)更高的移植物植入能力[31]。相反，我们没有移植内胚层样细胞(分化的第5天)以降低在最终的细胞制品中残余未分化的hipsc或没有完全分化的细胞的风险。loh等人观察到，hipsc衍生的肝祖细胞不会移入鼠新生儿肝中。该与上述研究以及我们的结果的不一致可能与导致生产的hlc的不同移植物植入能力的不同肝分化方案有关(例如，loh等人使用几种小分子抑制剂)，或与肝受体中的差异(新生儿肝相对于成年肝)有关。另外，在我们的研究中，在肝中几乎没有检测到idhb，但是这可能归因于脾在脾内细胞注射时保留所有idhb的事实；这样的脾内细胞保留在其它研究中没有描述[60-62]。在肝分化的第11天(肝向特化步骤的结尾)收获也会简化和减少培养时间，并且促进标准化、再现性和降低大量细胞生产的成本。综上所述，存在对用于治疗遗传性肝疾病(包括cn-1)的人肝细胞的临床需要。在层粘连蛋白包被的平板上培养的从hipsc或从hesc衍生出的肝祖细胞可以是肝移植物和从尸体肝分离的人肝细胞的安全临床替代物。尽管研究集中于cn-1的疗法，但是它也提供了其它遗传性肝疾病(诸如尿素循环疾病)的治疗的重要进步。实际上，这些疾病可以通过同种异体肝细胞移植来治疗[9]，且因而直接适用于使用正常人多能干细胞的再生医学方案。由于对hlc的接近没有限制，可以重复肝细胞移植以维持或实现令人满意的治疗益处。实施例2:ln-521作为使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的基质的用途。令人感兴趣的是，重组人层粘连蛋白-521(ln-521)可以替代ln-111作为细胞外基质，并允许hipsc更好地分化成确定内胚层和从hipsc衍生出的hlc，如通过hnf4α、afp、白蛋白、aat表达基因表达的rt-qpcr分析所评估的。例如，我们观察到在分化的第5天更高的sox17(内胚层)表达，从第11天至第30天hnf4α、afp和白蛋白的更高表达，如通过基于sybregreen的rt-qpcr所评估的(图3)。针对从hipsc衍生出的hlc(图7)和从hesc衍生出的hlc(esi-017细胞系)(图8)，使用基于taqman的rt-qpcr证实了这些结果。当在肝分化过程的第0天加入chir99021保持24h时，ln-521和ln-111之间的差异是更显著的(图8)。令人感兴趣的是，当我们使用ln-521和ln-111(25％/75％)的混合物时，多能干细胞(hesc)的肝分化与单独的ln-521或ln-111相比更有效(图9)。在不同的细胞接种(50x103、75x103和100x103细胞)观察到该改善。我们再次观察到加入chir99021会改善肝分化的功效。参考文献在本申请中，各参考文献描述了本发明所属领域的技术。这些参考文献的公开内容特此通过引用并入本公开内容中。[1]k.takahashi,k.tanabe,m.ohnuki,m.narita,t.ichisaka,k.tomoda,s.yamanaka,inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors,cell,131(2007)861-872.[2]j.yu,m.a.vodyanik,k.smuga-otto,j.antosiewicz-bourget,j.l.frane,s.tian,j.nie,g.a.jonsdottir,v.ruotti,r.stewart,slukvin,ii,j.a.thomson,inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells,science,318(2007)1917-1920.[3]p.menasche,v.vanneaux,j.r.fabreguettes,a.bel,l.tosca,s.garcia,v.bellamy,y.farouz,j.pouly,o.damour,m.c.perier,m.desnos,a.hagege,o.agbulut,p.bruneval,g.tachdjian,j.h.trouvin,j.larghero,towardsaclinicaluseofhumanembryonicstemcell-derivedcardiacprogenitors:atranslationalexperience,europeanheartjournal,(2014).[4]s.nedelec,b.onteniente,m.peschanski,c.martinat,genetically-modifiedhumanpluripotentstemcells:newhopesfortheunderstandingandthetreatmentofneurologicaldiseases？,currgenether,13(2013)111-119.[5]n.dianat,c.steichen,l.vallier,a.weber,a.dubart-kupperschmitt,humanpluripotentstemcellsformodellinghumanliverdiseasesandcelltherapy,currgenether,13(2013)120-132.[6]s.d.schwartz,c.d.regillo,b.l.lam,d.eliott,p.j.rosenfeld,n.z.gregori,j.p.hubschman,j.l.davis,g.heilwell,m.spirn,j.maguire,r.gay,j.bateman,r.m.ostrick,d.morris,m.vincent,e.anglade,l.v.delpriore,r.lanza,humanembryonicstemcell-derivedretinalpigmentepitheliuminpatientswithage-relatedmaculardegenerationandstargardt'smaculardystrophy:follow-upoftwoopen-labelphase1/2studies,lancet,(2014).[7]f.w.pagliuca,j.r.millman,m.gurtler,m.segel,a.vandervort,j.h.ryu,q.p.peterson,d.greiner,d.a.melton,generationoffunctionalhumanpancreaticbetacellsinvitro,cell,159(2014)428-439.[8]a.rezania,j.e.bruin,p.arora,a.rubin,i.batushansky,a.asadi,s.o'dwyer,n.quiskamp,m.mojibian,t.albrecht,y.h.yang,j.d.johnson,t.j.kieffer,reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells,natbiotechnol,32(2014)1121-1133.[9]a.dhawan,j.puppi,r.d.hughes,r.r.mitry,humanhepatocytetransplantation:currentexperienceandfuturechallenges,natrevgastroenterolhepatol,7(2010)288-298.[10]j.h.waelzlein,j.puppi,a.dhawan,hepatocytetransplantationforcorrectionofinbornerrorsofmetabolism,currentopinioninnephrologyandhypertension,18(2009)481-488.[11]i.j.fox,j.r.chowdhury,s.s.kaufman,t.c.goertzen,n.r.chowdhury,p.i.warkentin,k.dorko,b.v.sauter,s.c.strom,treatmentofthecrigler-najjarsyndrometypeiwithhepatocytetransplantation,nengljmed,338(1998)1422-1426.[12]c.ribes-kon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