CTC-246B18.10的用途及其相关产品和药物组合物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及ctc-246b18.10的用途及其相关产品和药物组合物。

背景技术：

肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是最常见的恶性肿瘤之一，具有侵袭性强、死亡率高的特点，位列癌症相关死亡原因的第二位(esther,cidon.systemictreatmentofhepatocellularcarcinoma:past,presentandfuture[j].worldjournalofhepatology,2017,9(18):797-807.)。肝癌的症状包括肋骨架右侧下方的肿块或疼痛、腹水、黄疽、容易瘀伤、体重减轻以及身体的虚弱。目前认为乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、酒精性及非酒精性肝硬化、黄曲霉毒素、肥胖等均与肝癌的发生相关。肝癌的发病机制尚未完全明确，研究认为与基因突变、肝癌干细胞、微环境、非编码rna、代谢异常等有关(farazipa,depinhora.hepatocellularenvironment.[j].naturereviewscancer,2006,carcinomapathogenesis:fromgenesto6(9):674-687.)。很多患者在初次确诊时就被分期为中晚期，有些已经发生了转移错过了诊疗的最佳时机，导致预后效果相当差。过去的几十年中，随着科学技术的进步，肿瘤的免疫治疗、基因治疗等取得了巨大的进展，因此，深入研究肝癌细胞的基因谱及寻找新的治疗靶点至关重要。

长链非编码rna是一类长度大于200个核苷酸且不具备蛋白翻译功能的rna，其在转录调控中广泛表达。目前，lncrna主要被分为五类:反义lncrna、内含子lncrna,lincrna、启动子相关lncrna和utr相关lncrna。lncrna具有时空特异性，在不同组织中，表达模式行为也不同。相对于microrna，lncrna的长度较长，具有mrna相似结构。lncrna可以与microrna,mrna和蛋白结合，在细胞中起到重要的调控作用。目前来看，lncrna与基因转录、表观遗传调控、蛋白编码基因、染色质组织等生物活动有关。随着研究的深入，lncrna被证实与许多肿瘤的发展与转移密切相关。由此发现更多与疾病相关的长链非编码rna对认识肿瘤的发生发展，并以此提供相应的防治措施有不可忽略的作用。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肝癌发生发展相关的生物标志物，以及该标志物在肝癌诊断和治疗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了用于检测ctc-246b18.10的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。

进一步，用于检测ctc-246b18.10的试剂包括能够和ctc-246b18.10核酸结合的物质。

进一步，所述物质为针对ctc-246b18.10的探针或引物。

进一步，所述引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，含有用于检测ctc-246b18.10的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、载体或试剂盒。

进一步，所述用于检测ctc-246b18.10的试剂包括能够和ctc-246b18.10核酸结合的物质。

进一步，所述物质为针对ctc-246b18.10的探针或引物。

进一步，所述引物序列如seqidno.1～2所示。

进一步，所述产品还含有说明书，所述说明书记载了该产品的用途以及使用方法，所述用途选自以下任一种：1)评估肝癌的患病风险；2)肝癌的诊断；所述使用方法包括利用核酸测序、扩增或者杂交技术检测ctc-246b18.10的核酸的步骤。

本发明提供了ctc-246b18.10在制备治疗肝癌或抑制肿瘤细胞增殖/侵袭的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括特异性抑制ctc-246b18.10转录的试剂。

进一步，所述试剂选自核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒。

进一步，所述核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸、双链rna(dsrna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。

进一步，所述核酸分子选自小干扰rna。

本发明提供了一种治疗肝癌或抑制肿瘤细胞增殖/侵袭的药物组合物，所述药物组合物包括特异性抑制ctc-246b18.10转录的试剂。

进一步，所述试剂包括针对ctc-246b18.10的核酸分子，含有核酸分子的核酸构建体/细胞/慢病毒。

本发明提供了ctc-246b18.10在筛选治疗肝癌的候选药物中的应用，若待筛选物质可以特异性降低ctc-246b18.10的水平，则待筛选物质为治疗肝癌的候选药物。

本发明提供了ctc-246b18.10在构建预测肝癌的计算模型中的应用。

附图说明

图1是利用qpcr检测ctc-246b18.10基因在肝细胞癌组织中的表达情况图。

图2是ctc-246b18.10作为检测变量的roc曲线图。

具体的实施方式

本发明的发明人经过大量实验和反复研究，发现ctc-246b18.10在肝癌组织中表达上调，通过下调ctc-246b18.10基因表达可以抑制肿瘤细胞增殖，从而达到诊断和治疗肿瘤的目的。

ctc-246b18.10基因位于19号染色体上，其序列例如可参考enst00000599274.1。在本发明中，提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本同时包含在本发明中，其突变型或其片段也包含在本发明中。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达，包括但不限于核酸测序、扩增以及杂交技术。

芯片、试剂盒、载体

本发明提供了检测中ctc-246b18.10基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)制剂、芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ctc-246b18.10所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括pcr引物以及基因特异性dna寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

本发明的试剂盒包括检测ctc-246b18.10基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明的载体包括基底和固定于所述基底上的针对ctc-246b18.10的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

计算模型

本发明提供了ctc-246b18.10在制备预测肝细胞癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

药物组合物

基于本发明人的发现，本发明提供了ctc-246b18.10在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用，所述药物组合物包括ctc-246b18.10的抑制剂。

在制备本发明的药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

如本文所用，所述的“小干扰rna”是一种双链小rna分子，其由完全互补的第一链和第二链组成，由dicer(rnaaseⅲ家族中对双链rna具有特异性的酶)加工而成。所述第一链和所述第二链互补共同形成rna二聚体，并且所述第一链的序列与ctc-246b18.10基因中的靶序列相同，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。所述双链rna第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；优选地，长度均为19-23个核苷酸；更优选地，长度均为19、20或者21个核苷酸。sirna是sirisc的主要成员，激发与之互补的目标基因的沉默。rna干扰(rnainterference，rnai)是指内源性或外源性双链rna(dsrna)介导的细胞内mrna发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。

如本文所用，所述shrna，即小发卡或短发卡rna(asmallhairpinrnaorshorthairpinrna,shrna)是一段具有紧密发卡环(tighthairpinturn)的rna序列，其包含正义链片段、反义链片段以及连接正义链片段和反义链片段的茎环结构，常被用于rna干扰沉默靶基因的表达。其中正义链和反义链的序列互补，并且所述正义链片段的序列与ctc-246b18.10基因中15-27个连续的核苷酸序列相同，优选地，所述正义链片段与ctc-246b18.10基因中19-23个连续的核苷酸序列相同；更优选地，所述正义链片段与ctc-246b18.10基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列相同，或者为与上述各序列在高等严紧条件下杂交的序列。shrna的发卡结构可被细胞机制切割成sirna，然后sirna结合到rna诱导沉默复合物上(rna-inducedsilencingcomplex，risc)，该复合物能够结合到目的基因并将其降解。

本发明所述的小干扰rna可以是化学合成的双链rna；也可以是载体或表达框架表达的双链rna，所述载体或表达框架中可采用例如rna聚合酶iii启动子和rna聚合酶iii终止子调控小干扰rna在哺乳动物细胞中的表达，rna聚合酶iii启动子包括人源或鼠源的u6启动子和人h1启动子等。

本发明所述的小干扰rna可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰rna组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰rna组成；所述的靶序列可以是ctc-246b18.10基因的基因组序列，或ctc-246b18.10基因的cdna序列。。

本发明的sirna可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。

本发明的sirna中的第一链和shrna中的正义链的序列与靶序列相同，其与sirna靶序列相比具有至少连续10个(优选至少连续15个，更优选至少连续18个)相同的核苷酸序列，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。

在本发明中，所述核酸构建体是指包括复制系统以及能够在给定的靶细胞内转录的序列。其可以通过将编码本文中所述的shrna的片段克隆入已知载体获得。进一步地，所述核酸构建体为慢病毒载体。所述慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染细胞，进而转录出本发明所述shrna，通过酶切加工等步骤，最终获得所述sirna，用于特异性沉默ctc-246b18.10基因的表达。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1检测ctc-246b18.10在肝细胞癌中的表达情况

1、样品收集

分别收集27例原发性肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本(距离肿瘤边缘≥5cm的肝组织)，配对的癌组织经病理证实为肝细胞癌。标本于手术后内用大量生理盐水清洗干净后立即分装，经液氮冷冻后放入-80℃冰箱冻存。

2、rna样品的制备及质量分析

使用trizol法提取组织总rna

1)用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测rna浓度，鉴定rna的产量和纯度。

3、qpcr检测

1)引物设计

根据ctc-246b18.10和gadph的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

ctc-246b18.10基因：

正向引物为5’-cctttagggtgggaagagaa-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-cagcaacaactcccgttta-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

2)逆转录反应

采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。

4)cdna模板浓度的筛选

将各样本cdna混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cdna的进行10倍稀释时，pcr的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

qpcr结果如图1所示，与癌旁组织相比，ctc-246b18.10在肝细胞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。

具体的，呈现ctc-246b18.10显著上调的样本有25例，其中癌组织样本有23例，癌旁组织样本有2例。说明ctc-246b18.10应用于肝细胞癌的诊断具有较高的特异性和敏感性。

实施例2验证ctc-246b18.10的诊断效能

1、数据收集

从tcga数据库中下载lncrna的表达谱数据，其中包括371例肝癌组织和50例癌旁组织。

2、roc曲线分析

使用r语言中的proc包分析lncrnactc-246b18.10的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制roc曲线。

3、结果

roc分析结果如图2所示，从图中可以看出，ctc-246b18.10作为检测变量具有较高的曲线下面积(auc＝0.894)，说明使用ctc-246b18.10进行肝细胞癌的诊断具有较高的敏感性和特异性。

实施例3ctc-246b18.10的功能验证

1、细胞培养

人肝癌细胞系hepg2购于上海细胞库，细胞系均以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2的培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液。

2、转染

2.1sirna的合成

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对ctc-246b18.10的干扰sirna-ctc-246b18.10，对照为通用的sirna-nc。

2.2转染

将实验分为3组，分别为对照组(hepg2)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(sirna-ctc-246b18.10)。按照invitrogen公司的lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染。具体步骤如下：

1)将肝癌细胞系hepg2加入含10％胎牛血清的dmem培养基并置于37℃、5％co2的培养箱中培养。当细胞生长融合至80-90％的时，用pbs清洗3遍以去除细胞瓶中的血清成分，然后加入1-2ml的含0.25％的胰酶0.02％edta的消化液，当细胞变为单个细胞时加入1ml的完全培养基终止消化。

2)将细胞转移至离心管内，放入常温离心机，1000g/min离心5min收集细胞沉淀，用完全培养基将细胞重悬为1×10⁵/ml，吸取500μl接种于24孔板内，放入37℃、5％co2的培养箱中培养过夜。

3)在opti-mem培养液中加入lipofectamine2000，室温孵育5min。

4)在opti-mem培养液中加入sirna混合均匀。

5)将稀释好的3)和4)混合均匀，室温放置20min。

6)将混合液加入到无血清培养基培养细胞的24孔板中，轻轻晃动混匀，放入37℃、5％co2的培养箱中培养6h后将细胞培养液更换为新鲜的完全培养基继续培养。

3、qpcr检测细胞中ctc-246b18.10的表达水平

各组细胞转染培养48h后，使用trizol法提取细胞总rna，按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量pcr检测。

4、cck-8法检测细胞增殖能力

1)各组细胞转染后24h，用pbs清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶将细胞充分消化，1000rpm离心5min收集细胞，弃去上清液并用1ml含10％胎牛血清的dmem培养基重悬，细胞计数板对细胞进行计数。

2)用含有10％胎牛血清的dmem培养基将细胞稀释至1×10⁴/ml，然后向96孔板的每孔加入200μl细胞(每种细胞接种5个复孔)。

3)在96孔板四周未铺细胞的其他孔中加入200μl的pbs。

4)将接种好肿瘤细胞的96孔板放至37℃、5％co2的细胞培养箱内培养72h后加入10μlcck-8，放入培养箱内孵育1h。

5)将培养板取出，用酶标仪测量450nm波长的吸光度。

5、细胞迁移实验

1)各组细胞转染后24h，用pbs清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管内，然后放入室温离心机内，1000rpm离心5min收集细胞。弃去上清然后用1ml不含胎牛血清的dmem培养基重悬细胞，用细胞计数板对细胞进行计数。用不含胎牛血清的dmem培养基将细胞稀释至1×10⁶/ml，吸取1×10⁵个细胞滴加入transwell小室的上室。

2)向transwell小室的下室加入600μl含10％血清的完全培养基，然后将上室放入孔板内，置于37℃、5％co2的细胞培养箱内培养24h。

3)取出小室，轻轻弃去小室内的培养基，用pbs清洗2遍后放入75％的乙醇固定液中中固定15min。

4)用棉签将transwell上室内细胞轻轻擦去，然后将小室置于结晶紫中染色15min。

5)取出小室，用pbs清洗3-5次去除多余细胞染液，然后在显微镜下进行观察。

6、细胞侵袭实验

将基质胶用无血清培养基1:20稀释，取100μl铺于小室内，4℃孵育过夜。剩余步骤同细胞迁移实验。

7、统计学分析

所有数据均为三次独立实验获得，按照mean士sd显示。组间差异使用配对样本t检验分析，所有结果均采用graphpadsoftware软件进行分析，p<0.05时表示差异具有统计学差异。

8、结果

1)以ctc-246b18.10在对照组中(hepg2)的表达量作为基准定为1，转染结果显示，相比对照组，实验组在转染sirna-ctc-246b18.10后，ctc-246b18.10的表达水平(0.240±0.06557)显著下调(对照组vs实验组，p值＝0.0025，**)，而转染sirna-nc的阴性对照中的ctc-246b18.10的表达水平(0.93±0.05686)则无显著变化(对照组vs阴性对照组，p值＝0.1794，ns)

2)细胞增殖实验结果显示，相比阴性对照组的细胞增殖活性(od值：1.176±0.0757)，实验组的细胞增殖活性(od值：0.628±0.06181)显著降低(阴性对照组vs实验组，p＜0.0001，***)，说明ctc-246b18.10影响肝癌细胞的增殖，提示ctc-246b18.10可作为分子靶标应用于肝癌的治疗。

3)细胞迁移实验结果显示，相比阴性对照组的细胞穿膜数(167.3±11.5)，实验组的细胞穿膜数显著降低(78±8.185)，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，p＝0.0156，*)，说明改变ctc-246b18.10的表达水平可以改变细胞的迁移能力，提示ctc-246b18.10可应用于肝癌转移的治疗。

4)细胞侵袭实验结果显示，相比相比阴性对照组的细胞穿膜数(125.3±9.609)，实验组的细胞穿膜数显著降低(68.33±10.02)，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，p＝0.0369，*)，说明改变ctc-246b18.10的表达水平可以改变细胞的侵袭能力，提示ctc-246b18.10可应用于肝癌浸润的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>山东第一医科大学（山东省医学科学院）

山东第一医科大学第二附属医院

<120>ctc-246b18.10的用途及其相关产品和药物组合物

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cctttagggtgggaagagaa20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cagcaacaactcccgttta19

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aatcccatcaccatcttccag21

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagccccagccttctccat19