一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法与流程

本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法。

背景技术：

核酸体外扩增技术是分子生物学研究的基础，也是生物学分析的重要方法，通过核酸扩增可以扩增和分离目的基因，使其在临床医疗诊断、基因突变监测、分子诊断、食品安全检测及环境安全监测等领域具有重要用途。

随着分子生物学的发展与生物物理学在该领域的广泛应用,核酸扩增技术受到越来越多的关注。常见的核酸扩增技术有聚合酶链式反应(pcr)、环介导等温扩增(lamp)以及滚环等温扩增(rca)方法，这些方法都在微生物检测领域有广泛的应用，有成功的实践经验，是现今为止较为成熟的检测方法。但是每一种技术都有自身缺陷。

pcr方法作为最原始的体外核酸扩增技术，发展时间最长，也最为稳定。该方法首先需要一对引物引发扩增反应，然后经过“变性—退火(复性)—延伸”三个步骤不断的重复实现产物积累。pcr反应的基本原理为：①模板dna的变性：模板dna经加热至90～95℃一定时间后，使dna双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至50～60℃，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在dna聚合酶的作用下，于70～75℃，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由此可见，在pcr实施过程中需要不断进行变温循环，这使得pcr的实施需要依赖于温度循环仪。该仪器现今为止价格依然昂贵，对于一些中小型企业，或是基层的检测机构而言，无疑增加了负担，对该方法的推广也增加了难度。

lamp方法是由日本人notomi在2000年发明的，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(上游内引物fip、下游内引物bip、上游外引物f3及下游外引物b3)，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、灵敏度高等特点。在lamp的操作过程中，假阳性问题十分凸显。根据报道，引起lamp假阳性的主要有两个原因，一是由于多条引物之间的相互作用，二是由于受到气溶胶的影响。但这些问题在lamp操作中难以真正得到解决。首先，引物之间的相互作用，由于lamp本身需要4条引物，有时为了加快反应速率，可能会使用多达6条引物，所以引物之间的发生相互作用的几率也就更大。这也为lamp的引物设计过程也增加的更大的难度。为找到合适的引物，需要对很多套引物分别进行试验，从中挑选适宜的引物，该过程费时费力且增加成本。另外，实验室的客观条件决定了lamp操作过程中受到气溶胶影响的可能性，想要免除气溶胶的影响，实验室需要有良好的条件，且操作人员需要有较高的素质。这些都在一定程度上限制了lamp的推广。

rca方法起始于1998年，该技术模拟自然界微生物环状dna的滚环复制过程，同样在具有链置换活性的dna聚合酶(bstdnapolymerase)作用下由一条引物即可引发沿环形dna模板的链置换合成，实现环状dna模板的体外等温扩增。针对于环状dna，rca方法展现了较好的优越性，但是对于更常见的线性dna而言，rca则需要首先进行一个独立步骤，获得环化的dna。该过程依赖于锁式探针，获得含有一定长度的目的序列的环状dna。包括探针设计以及使用探针生成环状dna的过程，使得rca反应需要消耗更长的时间，进行更复杂的步骤，花费更高的成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，可以解决rca方法对于环化dna的依赖及lamp中极易出现的假阳性现象。这使得spia对于rca而言具有更高的检测效率，对于lamp而言具有更好的稳定性。spia方法作为一种新的核酸等温扩增技术，将更加完善、更加突出等温扩增技术的优势，可以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，在bcadna聚合酶和rnaseh酶的作用下，在60～65℃的温度下，spia的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成，具体包括如下步骤：

步骤1：反应开始时，混合引物和链终止多聚核苷酸(blocker)分别与单链模板dna相应位置结合，然后在bcadna聚合酶的作用下从引物3'端开始靶序列互补链的合成；

步骤2：当链延伸到blocker序列，链延伸终止；

步骤3：在引物结合模板并开始延伸的同时，延伸产物5'端的rna部分，与模板形成了dna/rna杂合双链，被rnaseh酶切割降解，暴露出引物的rna部分结合位点；

步骤4：rna结合位点暴露后，新的自由引物会通过其rna部分与模板上相应的位置结合；

步骤5：直到blocker结合处，置换出一条完整的与靶序列互补的dna单链；同时新引物与模板dna形成的dna/rna杂合双链中的rna部分再次被rnaseh酶切割降解，然后重复进行引物结合和链置换合成，进入循环过程；

步骤6：最后反应扩增出大量的与靶序列互补的dna单链产物。

进一步地，spia反应引物为一条3'端是dna片段5'端是rna片段的组合引物。

进一步地，spia反应在进行核酸扩增过程中需要4种脱氧核苷三磷酸(dntps)包括：脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧核糖胸腺嘧啶三磷酸(dttp)。

进一步地，在spia反应中，缓冲液选用bcadna聚合酶和rnaseh酶产品套装中携带的2×bcadnapolymerasebuffer和5×rnasehbuffer反应缓冲液。

进一步地，spia反应的第一个阶段为预变性过程，在200μl离心管中加入混合引物、blocker、dntps、mgso4、bovineserumalbumin、recombinantrnaseinhibitor、recombinantrnaseinhibitor、5×rnasehbuffer、2×bcadnabuffer、基因组dna和rnase-freewater混合液通过95℃预变性80s，然后冷却至常温，迅速添加bcadna聚合酶和rnaseh酶，利用实时荧光监测仪，设置反应温度为60℃，时间120min，在试验过程中可以依据扩增的荧光信号强度随时终止反应。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明(单引物等温扩增技术检测酸土脂环酸芽胞杆菌(spia))作为一种新的核酸等温扩增技术，与目前常见的聚合酶链式反应(pcr)、环介导等温扩增(lamp)以及滚环等温扩增(rca)相比，具有以下优点：

(1)单个引物：该种检测方法只需要一条引物就可以完成整个反应，可以很好的避免因为使用多个引物而带来的非特异性扩增。

(2)避免rna的干扰：基于spia具有独特对rnaseh酶的依赖性，使得他对于rna序列并会有直接扩增的作用。所以，在有大量的mrna存在的情况下进行基因组dna序列的特异性扩增，用于准确定量基因量；

(3)产物为单链：该反应的扩增产物为单链的rna或dna，很容易通过最常规的检测方法检测产物，例如探针杂交、电泳等。

(4)实时监测，有效防污染：此种检测方法可以直接依据荧光信号的变化来判读是否发生了扩增。整个反应过程均是在pcr管中封闭进行，因此可以有效的避免因为开盖而导致的污染，即能够在源头上控制发生气溶胶可能性。

附图说明

图1为本发明spia反应的基本原理和过程示意图；

图2为本发明spia扩增产物分析荧光曲线图；

图3为本发明spia扩增产物分析的紫外灯照射(a)和沉淀观察(b)示意图；

图4为本发明spia扩增结果图一；

图5为本发明spia扩增结果图二；

图6为本发明spia扩增结果图三；

图7为本发明spia扩增结果图四；

图8为本发明spia扩增结果图五；

图9为本发明spia扩增结果图六；

图10为本发明spia扩增结果图七。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法，在bcadna聚合酶和rnaseh酶的作用下，在60～65℃的温度下，spia的扩增反应仅需要一条混合引物即可完成，具体包括如下步骤：

如图1，反应开始时，混合引物和链终止多聚核苷酸(blocker)分别与单链模板dna相应位置结合，然后在bcadna聚合酶的作用下从引物3'端开始靶序列互补链的合成；当链延伸到blocker序列，链延伸终止；在引物结合模板并开始延伸的同时，延伸产物5'端的rna部分，与模板形成了dna/rna杂合双链，被rnaseh酶切割降解，暴露出引物的rna部分结合位点；rna结合位点暴露后，新的自由引物会通过其rna部分与模板上相应的位置结合；因为新引物dna部分带有3'-oh，与其链置换活性的dna聚合酶结合后比原先引物延伸产物5'端的dna引物部分对模板更具亲和力，因此新引物dna部分代替原来引物的dna部分与模板结合并开始链置换合成；直到blocker结合处，置换出一条完整的与靶序列互补的dna单链；同时新引物与模板dna形成的dna/rna杂合双链中的rna部分再次被rnaseh酶切割降解，然后重复进行引物结合和链置换合成，进入循环过程；最后反应扩增出大量的与靶序列互补的dna单链产物。

spia反应体系包括以下成分，见下表1：

表1spia反应体系组成

1、引物，选择高效而且特异性强的引物是本发明扩增核酸成败的一个关键因素。spia的扩增反应需要一条混合引物即可完成。首先，混合引物与靶序列互补结合，并在bcadna聚合酶的作用下进行延伸。随着bcadna聚合酶的延伸扩增，形成的dna单链不断被置换下来，扩增反应持续循环进行，不断形成扩增产物。spia扩增对靶序列的选择没有特殊的要求，引物为一条3'端是dna片段5'端是rna片段的组合引物。引物设计需要充分考虑其长度及组成，一般引物的总长度处在10～40nt，最佳长度为20～25nt，其中dna部分最佳长度为7～12nt，rna部分最佳长度为5～10nt。引物的组成只需符合引物设计的一般原则即可，如gc含量和tm值适中。

一般采用primerpremier5.0、dnaman等软件进行引物的设计，建议设计多对引物进行优化筛选，以获得最佳扩增效果。

2、bcadna聚合酶，bcadna聚合酶是一种具有链置换活性的dna聚合酶。bcadna聚合酶不具有5’→3’外切核酸酶的活性。伸长性能优越，可以抑制dna二级结构形成。bcadna聚合酶反应的最适温度是60～65℃，而当温度超过70℃的时候bcadna聚合酶将失去活性。反应过程中添加的bcadna聚合酶量需要进行优化。

3、dntps、本发明在进行核酸扩增过程中需要4种脱氧核苷三磷酸(dntps)包括：脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧核糖胸腺嘧啶三磷酸(dttp)。提供靶dna序列扩增的原料。高浓度的dntps会对扩增反应起抑制作用，浓度过低又会降低产物的产量。

4、缓冲液，在spia反应体系中，缓冲液可以为反应体系和bcadna聚合酶和rnaseh酶反应提供一个稳定的ph环境。spia反应体系中缓冲液一般常用bcadna聚合酶和rnaseh酶产品套装中携带的2×bcadnapolymerasebuffer和5×rnasehbuffer反应缓冲液。

5、镁离子，本发明的反应体系中，镁离子(mg²⁺)的浓度对核酸扩增反应的影响也十分显著，是一个重要的参数，镁离子从不同方面影响spia反应的进行，例如，它会影响bcadna聚合酶的活性，从而影响spia扩增产物的产量。不同的引物对和模板所需要镁离子(mg²⁺)的浓度是不同的，通常要对镁离子(mg²⁺)浓度进行优化从而确定最适镁离子(mg²⁺)浓度。在核酸大量合成时，从脱氧核苷三磷酸基质(dntps)中析出的焦磷酸根离子和反应溶液中的镁离子(mg²⁺)结合，生成副产物焦磷酸镁白色沉淀物，所以可以直接根据离心后是否出现白色沉淀来定性判断反应结果。

6、模板，模板的制备是spia反应的起始步骤，也是spia反应中最为棘手的一个步骤，模板制备的质量如何直接影响着接下来的spia反应是否能顺利进行。可以作为模板的样品有很多种，来源广泛，成分复杂，含有各种抑制因子，因此提高模板质量的关键是避免和去除这些抑制因子以及提高模板的产量。spia反应中所使用的bcadna聚合酶与pcr反应中所使用的dna聚合酶相比，对抑制物具有更强的抵抗能力。因此，模板dna的纯度只要达到pcr反应的模板dna纯度，那么该模板dna也可以进行spia反应。

spia反应的第一个阶段为预变性过程，在200μl离心管中加入混合引物、blocker、dntps、mgso4、bovineserumalbumin、recombinantrnaseinhibitor、recombinantrnaseinhibitor、5×rnasehbuffer、2×bcadnabuffer、基因组dna和rnase-freewater混合液通过95℃预变性80s，然后冷却至常温，迅速添加bcadna聚合酶和rnaseh酶，利用实时荧光监测仪，设置反应温度为60℃，时间120min，在试验过程中可以依据扩增的荧光信号强度随时终止反应。

在spia反应结束后，可以通过3种方式对反应结果进行判定。

方法一：荧光曲线。利用实时荧光监测仪，随时通过观看荧光曲线是否起峰确定反应的扩增(如图2)。阴性对照由于模板不进行扩增，因此荧光曲线不会有起峰现象。

方法二：荧光染料显色法。反应中获得的单链dna，可以与体系中添加的sybrgreenii(1000×)进行显色。该染料与单链dna结合后在紫外线的照射下会有浅绿色荧光产生，而阴性结果由于没有扩增现象，无浅绿色荧光产生(如图3a)，注：1-阴性对照；2-spia扩增产物。

方法三：沉淀观察法。在反应的过程中，dntps键合到核酸链上时，形成焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结合后形成不溶性产物焦磷酸镁，该产物可以在反应结束后通过离心(12000r/min，2min)沉淀，从而通过观察沉淀形成判断反应结果(如图3b)，注：1-阴性对照；2-spia扩增产物。

spia方法用于酸土脂环酸芽胞杆菌核酸序列的扩增，引物的设计如下：

根据genebank中酸土脂环酸芽胞杆菌16srrna基因组已知序列(基因号：kc193183.1)，使用blast对该序列进行同源性分析，确定其保守序列。通过使用primerpremier5.0和dnaman软件设计混合引物和blocker(如表2所示)。

901catgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccagggcttgacatccctctgacc

961ggtgcagagatgtaccttcccttcggggcagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtca

1021gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctgtgtta

1081ccagcacgtagaggtggggactcacaggtgactgcccggcgtaagtcggaggaaggcggg。

表2引物一览表

spia反应的主要试剂有：bcabest酶、rnaseh酶、rnaseinhibitor、mgso4、dntps、bovineserumalbumin、rnase-freewater、基因组dna提取试剂盒(minibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0)，sybrgreenii，培养基、混合引物、链终止多聚核苷酸、pcr引物。

仪器设备为：实时荧光监测仪(esequanttubescanner)：esegmbh，stockach，germany；pcr扩增仪(whatmantgradient基因扩增仪)：biometra，germany。jy04s-3e凝胶成像系统，dyy-10c型电脑三恒多用电泳仪电源，spx-150b-z生化培养箱，qyc-200恒温培养摇床，超净工作台，漩涡震荡器，drgonmedpipette手动移液器(0.5～10μl；10～200μl；100～1000μl)，bl-300-x电子天平，dsx-280a不锈钢手提式高压灭菌锅，核酸蛋白分析仪以及其他的辅助设备。

spia反应体系和反应条件如下：

(1)模板的提取

取保藏的酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)在k氏琼脂培养基上进行划线，44℃培养48h，传代培养2次。挑取传代培养的单菌落接种至新鲜无菌的k氏液体培养基中，44℃培养24h。采用细菌dna提取试剂盒(购于大连宝生物公司)提取模板dna。

(2)体系的添加

在200μl离心管中按下表依次添加反应体系，各试剂浓度如下所示：

mgso4(0.8mmol/l),dntps(0.88mmol/l),bovineserumalbumin(0.72mg/ml),recombinantrnaseinhibitor(24u),dna/rna混合引物(8μmol/l),blocker(0.6μmol/l),2×bcadnapolymerasebuffer(2.0μl),5×rnasehbuffer(1.5μl),1:350sybrgreenii(1.0μl),模板(1.0μl),rnase-freewater补足体系；模板dna和rnase-freewater分别作为阳性反应和阴性对照。(本步骤中所加体系不包含bcadna聚合酶，该酶需要在预变性过程之后进行添加，防止温度过高导致酶失活。)

(3)混匀

将步骤(2)中的体系在涡旋混匀器上涡旋10s，然后以3000r/min速度离心10s(其目的是将体系混匀，同时将管壁上的液体集中到离心管底部)。

(4)预变性

将离心管放入孵育器中，在95℃下加热80s，然后迅速将离心管放置到冰上，进行冰浴2min。冰浴结束后加入bcadna聚合酶(酶活性20u)和rnaseh酶(酶活性36u)。

(5)混匀

重复步骤(3)。

(6)扩增

将实时荧光监测仪设置温度为60.0℃，反应时间90min。

(7)反应结果观察

通过观看荧光曲线是否有起峰现象，确定体系的扩增。阳性扩增会有明显的荧光曲线。

spia扩增结果，spia扩增结果如图4所示，本发明只针对沙门氏菌含有的特异性目标序列进行了扩增，而针对其它非沙门氏菌，由于不含有目标序列，并不发生扩增反应。因此spia反应可以特性扩增目标核酸序列。

图4:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-酸土脂环酸芽胞杆菌(no.1)；tube4-酸土脂环酸芽胞杆菌(no.2)；tube5-酸土脂环酸芽胞杆菌(no.3)；tube6-酸土脂环酸芽胞杆菌(no.4)；tube7-酸土脂环酸芽胞杆菌(no.5)；tube8-酸土脂环酸芽胞杆菌(no.6)。

图5:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-alicyclobacillusacidocaldarius(nbrc111244)；tube4-alicyclobacillusfastidiosus(dsm17978)；tube5-alicyclobacillusacidiphilus(dsm14558)；tube6-alicyclobacilluscycloheptanicus(dsm4006)；tube7-alicyclobacillusherbarius(dsm13609)；tube8-alicyclobacillussacchari(dsm17974)。

图6:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-巴氏醋杆菌(atcc33445)；tube4-巴氏醋杆菌(r1)；tube5-巴氏醋杆菌(r2)；tube6-巴氏醋杆菌(r3)；tube7-巴氏醋杆菌(r4)；tube8-植物乳杆菌(cicc21784)。

图7:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-植物乳杆菌(l1)；tube4-植物乳杆菌(l2)；tube5-植物乳杆菌(l3)；tube6-植物乳杆菌(l4)；tube7-蜡样芽胞杆菌(cmcc63302)；tube8-蜡样芽胞杆菌(atcc11778)。

图8:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-苏云金芽胞杆菌(cicc22945)；tube4-枯草芽胞杆菌(cicc10012)；tube5-嗜热脂环酸芽胞杆菌(cicc20139)；tube6-克罗诺杆菌(atcc51024)；tube7-克罗诺杆菌(atcc51329)；tube8-变形杆菌(cmcc49027)。

图9:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-丁酸梭菌(atcc19398)；tube4-丁酸梭菌(c1)；tube5-丁酸梭菌(c2)。tube6-丁酸梭菌(c3)；tube7-丁酸梭菌(c4)；tube8-乳酸片球菌(cicc20719)

图10:tube1-阴性对照；tube2-酸土脂环酸芽胞杆菌(atcc49025)；tube3-乳酸片球菌(p1)；tube4乳酸片球菌(p2)；tube5-乳酸片球菌(p3)；tube6-乳酸片球菌(p4)；tube7-金黄色葡萄球菌(cicc21600)；tube8-金黄色葡萄球菌(cmcc26073)。

本发明在以spia为基础，在反应体系中添加了可与单链dna结合的sybrgreenii。传统的eb染色想比较，不但毒性低，没有致癌性，而且灵敏度更高。单引物等温扩增作为一种新的核酸扩增技术，实现了核酸在等温条件下的体外扩增，操作简单，特异性高，灵敏性高且稳定性好。相对于pcr方法而言，spia作为等温扩增过程，反应不需要专门的温度循环仪就可以进行，在孵育器中即可完成扩增。相对于lamp及rca，spia方法要比这两种方法的反应体系更加简单，操作也更加简便，且成本低。且该方法可以解决rca方法对于环化dna的依赖及lamp中极易出现的假阳性现象。这使得spia对于rca而言具有更高的检测效率，对于lamp而言具有更好的稳定性。spia方法作为一种新的核酸等温扩增技术，将更加完善、更加突出等温扩增技术的优势。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。