本发明涉及多肽制备技术领域，具体涉及一种小分子牛骨髓肽及其提取方法。
背景技术：
牛骨髓肽，是由牛骨髓蛋白质酶解得到的蛋白质片段，该牛骨髓肽可以直接被人体吸收，直接参与生命活动；牛骨髓肽具有修复受损细胞、刺激免疫球蛋白产生抗体，激活细胞内溶酶体系的活力等有益效果。
目前，牛骨髓肽的提取方法主要经过破碎、蒸煮、多次酶解、灭酶、过滤、浓缩、干燥得到牛骨髓肽；然而，现有方法制备得到的牛骨髓肽存在提取率较低，小分子量牛骨髓肽的含量较低，以及由于多次酶解导致生产周期较长的问题。
有鉴于此，特提出本发明！
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法能够显著提高从牛骨中提取牛骨髓肽的提取率，而且仅需采用复合酶制剂进行一次酶解，生产周期较短。
本发明的第二目的在于提供一种小分子牛骨髓肽，该小分子牛骨髓肽中小分子肽含量较高，能够更好的被人体吸收。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明实施例第一方面提供一种小分子牛骨髓肽的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：
将鲜骨进行破碎、清洗；
对清洗后的鲜骨进行熬煮、过滤，收集熬煮液；
将熬煮液进行离心去除脂肪，得到骨胶原蛋白溶液；
调节骨胶原蛋白溶液浓度并添加复合酶解剂进行酶解，得到酶解液，其中，复合酶解剂由复配蛋白酶、骨蛋白水解酶和风味酶组成；
对酶解液进行杀菌灭酶、固液分离、超滤膜浓缩和干燥。
上述制备方法通过选用特定的复合酶解剂，通过一次水解，即可充分将骨胶原蛋白水解为小分子的多肽，提高了牛骨髓肽的提取率，同时还能够把多肽上含有的疏水氨基酸进行水解，能够改善苦味肽的口感，保障提取的牛骨髓肽具有优异的口感和风味。
研究表明，在牛骨髓肽中分子量在180以下主要为氨基酸而非多肽，因此，牛骨髓肽中分子量大于180且接近分子量180的多肽含量越高越好，本申请技术方案通过特定复合酶解剂的选择，能够显著提高提取的牛骨髓肽中分子量在180～500之间的多肽含量，具体可达到41％，使得本申请提取的牛骨髓肽更易被消化吸收，具有更好的利用率。
优选地，所述破碎为将鲜骨破碎至2～4cm3；所述清洗为将破碎的碎骨置于清洗机中清洗20～25min，随后置于清水中浸泡4～5h。
优选地，所述复合酶解剂中复配蛋白酶、骨蛋白水解酶和风味酶的质量比为(1～3)∶(1～3)∶1；更优选地，所述复合酶解剂中复配蛋白酶、骨蛋白水解酶和风味酶的质量比为2∶2∶1。
优选地，所述骨蛋白水解酶活性为(30～35)×104u/g，风味酶活性为(3～6)×104u/g。
优选地，每份所述复配蛋白酶由菠萝蛋白酶3份、中性蛋白酶2份和胰蛋白酶3份复配而成；更优选地，所述菠萝蛋白酶活性为(20～30)×104u/g，中性蛋白酶活性为(5～10)×104u/g，胰蛋白酶活性为2000～4000u/g。
优选地，所述酶解包括：
调节骨胶原蛋白溶液ph至6.0～6.2，并在54～56℃下加入复合酶解剂进行酶解3～4h。
通过酶解条件的具体限定，调节各酶的活性，保障不同酶共同作用下一次水解将骨胶原蛋白水解为多肽，并保障水解多肽的量以及大小。
优选地，所述调节骨胶原蛋白溶液浓度至5～8波美，复合酶解剂与骨胶原蛋白溶液的质量比为(1～2)∶100。
优选地，所述对清洗后的鲜骨进行熬煮、过滤，收集熬煮液包括：
将清洗后的鲜骨至于清水中进行第一次熬煮、过滤，得到第一次熬煮液和熬煮碎骨；
再将熬煮碎骨与清水中进行第二次熬煮、过滤，得到第二次熬煮液；
将第一次熬煮液和第二次熬煮液合并，得到熬煮液；
其中：第一次熬煮时，鲜骨与清水的质量比为1∶(5～6)，熬煮温度为110～120℃，熬煮时间为2～3h；
第二次熬煮时，熬煮碎骨与清水的质量比为1：(3～4)，熬煮温度为110～120℃，熬煮时间为1～2h。
通过上述特定的熬煮过程，能够更好的提取牛骨髓蛋白，进而能够更好的保障牛骨髓肽的提取率。
优选地，所述过滤采用的过滤介质孔径粒度为150目。
优选地，所述固液分离采用的过滤介质孔径为0.2～0.5μm。
本发明第二方面提供一种上述提取方法制备得到的小分子牛骨髓肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明制备方法通过选用特定的复合酶解剂，通过一次水解，即可充分将骨胶原蛋白水解为小分子的多肽，提高了牛骨髓肽的提取率，同时还能够把多肽上含有的疏水氨基酸进行水解，能够改善苦味肽的口感，保障提取的牛骨髓肽具有优异的口感和风味。
本发明制备得到的牛骨髓肽中分子量大于180且接近分子量180的多肽含量较高，本申请牛骨髓肽中分子量在180～500之间的多肽含量具体可达到41％，使得本申请提取的牛骨髓肽更易被消化吸收，具有更好的利用率。
具体实施方式
下面对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
以下各实施例采用的原料如下：
骨蛋白水解酶：活性为(30～35)×104u/g，购买于东恒华道生物科技有限公司；
风味酶：活性为(3～6)×104u/g；购买于东恒华道生物科技有限公司；
复配蛋白酶，每份复配蛋白酶由菠萝蛋白酶3份、中性蛋白酶2份和胰蛋白酶3份复配而成，其中：
菠萝蛋白酶：活性为(20～30)×104u/g，购买于上海源叶生物科技有限公司；
中性蛋白酶：活性为(5～10)×104u/g，购买于东恒华道生物科技有限公司；
胰蛋白酶：活性为2000～4000u/g，购买于东恒华道生物科技有限公司。
实施例1
本实施例为一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法包括如下步骤：
将鲜骨进行破碎至2～4cm3，并将破碎的碎骨置于清洗机中清洗20min，随后置于清水中浸泡5h；
将清洗后的鲜骨至于清水中进行第一次熬煮并采用150目的滤袋进行过滤，得到第一次熬煮液和熬煮碎骨；
再将熬煮碎骨与清水中进行第二次熬煮并采用150目的滤袋进行过滤，得到第二次熬煮液；
将第一次熬煮液和第二次熬煮液合并，得到熬煮液，其中：第一次熬煮时，鲜骨与清水的质量比为1∶5，熬煮温度为110℃，熬煮时间为3h；
第二次熬煮时，熬煮碎骨与清水的质量比为1：4，熬煮温度为110℃，熬煮时间为1h；
将熬煮液以15000r/min转速进行离心去除脂肪，得到骨胶原蛋白溶液；
调节骨胶原蛋白溶液浓度至5波美，并调节骨胶原蛋白溶液ph至6.0～6.2，并在54℃下按照复合酶解剂与骨胶原蛋白溶液的质量比为1.5∶100加入复合酶解剂进行酶解4h，其中，复合酶解剂由复配蛋白酶、骨蛋白水解酶和风味酶按照质量比3∶1∶1组成；
采用巴氏消毒法对酶解液进行杀菌灭酶，然后采用孔径为0.5μm的过滤介质进行固液分离、浓缩和干燥，既得小分子牛骨髓肽。称取上述实施例1得到的小分子牛骨髓肽的重量，并根据提取率＝小分子牛骨髓肽重量/鲜骨重量*100％计算提取率，计算结果为12.3％。
实施例2
本实施例为一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法包括如下步骤：
将鲜骨进行破碎至2～4cm3，并将破碎的碎骨置于清洗机中清洗25min，随后置于清水中浸泡4h；
将清洗后的鲜骨至于清水中进行第一次熬煮并采用150目的滤袋进行过滤，得到第一次熬煮液和熬煮碎骨；
再将熬煮碎骨与清水中进行第二次熬煮并采用150目的滤袋进行过滤，得到第二次熬煮液；
将第一次熬煮液和第二次熬煮液合并，得到熬煮液，其中：第一次熬煮时，鲜骨与清水的质量比为1∶6，熬煮温度为120℃，熬煮时间为2h；
第二次熬煮时，熬煮碎骨与清水的质量比为1：3，熬煮温度为120℃，熬煮时间为2h；
将熬煮液以15000r/min转速进行离心去除脂肪，得到骨胶原蛋白溶液；
调节骨胶原蛋白溶液浓度至8波美，并调节骨胶原蛋白溶液ph至6.0～6.2，并在56℃下按照复合酶解剂与骨胶原蛋白溶液的质量比为1.5∶100加入复合酶解剂进行酶解3h，其中，复合酶解剂由复配蛋白酶、骨蛋白水解酶和风味酶按照质量比1∶3∶1组成；
采用巴氏消毒法对酶解液进行杀菌灭酶，然后采用孔径为0.5μm的过滤介质进行固液分离、浓缩和干燥，既得小分子牛骨髓肽。
按照实施例1中的提取率的计算方法计算本实施例中小分子牛骨髓肽的提取率，计算结果为12.8％。
实施例3
本实施例为一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法包括如下步骤：
将鲜骨进行破碎至2～4cm3，并将破碎的碎骨置于清洗机中清洗25min，随后置于清水中浸泡5h；
将清洗后的鲜骨至于清水中进行第一次熬煮并采用150目的滤袋进行过滤，得到第一次熬煮液和熬煮碎骨；
再将熬煮碎骨与清水中进行第二次熬煮并采用150目的滤袋进行过滤，得到第二次熬煮液；
将第一次熬煮液和第二次熬煮液合并，得到熬煮液，其中：第一次熬煮时，鲜骨与清水的质量比为1∶5，熬煮温度为115℃，熬煮时间为3h；
第二次熬煮时，熬煮碎骨与清水的质量比为1：3.5，熬煮温度为115℃，熬煮时间为1.5h；
将熬煮液以15000r/min转速进行离心去除脂肪，得到骨胶原蛋白溶液；
调节骨胶原蛋白溶液浓度至6波美，并调节骨胶原蛋白溶液ph至6.0～6.2，并在55℃下按照复合酶解剂与骨胶原蛋白溶液的质量比为1.5∶100加入复合酶解剂进行酶解3h，其中，复合酶解剂由复配蛋白酶、骨蛋白水解酶和风味酶按照质量比2∶2∶1组成；
采用巴氏消毒法对酶解液进行杀菌灭酶，然后采用孔径为0.5μm的过滤介质进行固液分离、浓缩和干燥，既得小分子牛骨髓肽。
按照实施例1中的提取率的计算方法计算本实施例中小分子牛骨髓肽的提取率，计算结果为13.6％。
对照例1
本对照例为一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法与实施例3中的提取方法基本相同，区别仅在于每份复配蛋白酶由胰蛋白酶3份、木瓜蛋白酶2份和胃蛋白酶3份复配而成。
按照实施例1中的提取率的计算方法计算本实施例中小分子牛骨髓肽的提取率，计算结果为10.4％。
对照例2
本对照例为一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法与实施例3中的提取方法基本相同，区别仅在于将骨蛋白水解酶替换为同等分数的复配蛋白酶。
按照本申请实施例1的计算方法，计算本对照例中牛骨髓肽的提取含量，计算结果为11.1％。
对照例3
本对照例为一种小分子牛骨髓肽的提取方法，该提取方法与实施例3中的提取方法基本相同，区别仅在于将“调节骨胶原蛋白溶液ph至6.0～6.2，并在50℃下加入复合酶解剂进行酶解3h”修改为“调节骨胶原蛋白溶液ph至6.4～6.6，并在50℃下加入复合酶解剂进行酶解3h，”。
按照本申请实施例1的计算方法，计算本对照例中牛骨髓肽的提取含量，计算结果为9.2％。
实验例
选取同批次，外观质量接近的牛脊骨，随后将牛脊骨粉碎至2～4cm3；随后随机分为6份，分别按照实施例1～3和对照例1～3中的牛骨髓肽的提取方法进行提取，然后将提取的牛骨髓肽中不同分子量范围的含量进行检测；检测单位为江南大学分析测试中心，检测结果如表1所示：
表1不同提取方法提取的牛骨髓肽含量分布
由表1可知：
本发明实施例通过选择特定的复合酶制剂，通过一步水解，能够充分将骨胶原蛋白水解，使得制备得到的牛骨髓肽中分子量在180～500中的多肽含量最高，而且分子量在1000以下的多肽含量可达80％以上。
可见，本发明制备得到的牛骨髓肽中分子量大于180且接近分子量180的多肽含量较高，本申请牛骨髓肽中分子量在180～500之间的多肽含量具体可达到41％，使得本申请提取的牛骨髓肽更易被消化吸收，具有更好的利用率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。