本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种真菌，以及该真菌的培养条件和该真菌的应用方法技术领域。
背景技术：
铁皮石斛(dendrobiumofficinale)作为我国传统名贵中药材，有着极高的药用价值，已有2000多年的使用历史，被誉为“中华九大仙草之首”。过去以采集野生石斛为主，由于野生资源枯竭，从上世纪90年代开始石斛产业以大棚集约化栽培为主，通过近30年的发展，这样的产业模式由于基础设施投入巨大、种植技术要求高、产品安全性和道地性受到质疑等问题。
由于兰科植物种子非常细小仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质，不仅如此，真菌与兰科植物整个生活史阶段都有密切关系。而铁皮石斛幼苗阶段及其重要，容易受环境因子影响，传统方法是从成年兰科植株根中分离获得，用来验证其对兰科植物种子萌发和幼苗生长等作用。但有研究表明，兰科植物不同阶段与不同真菌互作。铁皮石斛幼苗阶段及其重要，利用有效的真菌能促进幼苗的生长，缩短铁皮石斛的生长周期，提高野外回归和辅助移植的成功率，获得有效真菌是珍稀濒危兰科植物保护的关键步骤，共生幼苗在回归到自然生境后具有较好的环境适应性，因此获得促进幼苗生长的有效共生真菌及其重要，也是开展生态栽培的关键环节。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离，但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，因此利用兰科植物无菌幼苗诱导真菌，再从其分离得到的真菌能保证其实幼苗阶段的真菌，这是获得有效菌株最直接最高效的方法。然后将铁皮石斛无菌苗与分离得到的真菌在混合基质共生培养，筛选出对铁皮石斛幼苗最有效的共生真菌，可为高效生产菌根化幼苗提供必要条件，为开展铁皮石斛回归和生态栽培奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株能够有效促进铁皮石斛幼苗生长的菌株。
本发明的目的还在于提供所述的菌株在铁皮石斛繁育中的具体应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种真菌，本发明的真菌为tulasnellasp.typd-2；保藏地点：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020165，保藏日期为2020年6月1日。
进一步为，本发明的真菌菌株的nrdnaits序列特征为：
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进一步为，本发明的真菌菌株的培养条件为：在pda平板上培养7天，其菌丝为白色，气生，菌落形态规则，呈圆形，每两天生长速度为1.700±0.385cm，培养时间较长，可见次级代谢产物颜色为淡黄色。
进一步为，本发明的真菌菌株的分子生物学鉴定方法步骤为：
1)采用ctab法提取真菌dna；
2)pcr扩增所用引物为its1和its4；
3)25μlpcr反应体系包括：2.5μl10×pcr缓冲液，0.4μldntp，1.5μlmg2+，1.5μlits1，1.5μlits4，0.2μltaq酶，15.4μlddh2o，2μldna模板；
4)扩增反应在pcr仪perkinelmer上进行，如下pcr循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸10min；
5)pcr扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序；对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类下地位：经blast比对分析，其与kp050605.1真菌tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到97.42％。
进一步为，本发明的真菌的应用为：用于促进药用铁皮石斛幼苗生长。
进一步为，本发明的真菌菌株与铁皮石斛共生培养的基质为：所用基质为树皮、泥炭、椰糠等体积比混合而成。
进一步为，本发明的真菌用于促进药用铁皮石斛幼苗生长的测定方法，其步骤包括：
1)把铁皮石斛无菌苗移栽原生境中，当发现有真菌侵染到铁皮石斛幼苗根中时，进行分离，对获得的真菌进行形态和分子鉴定，同时将药用铁皮石斛无菌苗与所得真菌进行共生培养实验，筛选出促生长效果最好的菌株，于4℃冰箱试管斜面保存菌株待用；
2)将保存于4℃试管斜面内的供试菌株取出，重新接种在pda平板培养基上，置于人工气候箱内25℃下活化培养；待真菌菌丝快长满培养皿时；取出作为共生培养材料；
3)配制共生培养基质：所用基质为树皮、泥炭、椰糠等体积比混合而成；混合基质121℃，30min条件下高温灭菌备用；共计3个实验组处理和1个空白对照处理，共计4个处理，每个处理24盆，每盆种5棵铁皮石斛幼苗，共计600棵铁皮石斛幼苗；
4)铁皮石斛无菌苗准备：通过铁皮石斛种子在培养上无菌萌发获得铁皮石斛无菌苗，太阳照射炼苗；选同一批播种并长势一致的铁皮石斛无菌苗作为实验材料；移栽之前需要把铁皮石斛幼苗上的培养基清洗干净，再用多菌灵浸泡30min，然后晾干，备用；
5)铁皮石斛无菌苗与真菌共生培养：将备用的无菌苗移栽在盛有灭菌混合基质半径为5cm，高为10cm的花盆中，在实验组处理的花盆中的混合培养基质上接种含有单一真菌纯培养物的琼脂块，空白对照处理组接同样大小无菌pda培养基琼脂块；铁皮石斛幼苗与真菌培养的4个处理分别放置在4个人工培养箱内，在温度为25℃，光周期12h/12h--光照(2000lx)/黑暗；
6)真菌定殖检测：共生培养以后，每隔30天取铁皮石斛幼苗的根进行徒手切片，在显微镜下观察真菌在铁皮石斛幼苗根中定殖成功否，在空白对照处理均没发现菌丝团定殖，实验组处理在第30天和60天均没发现菌丝团，在90天3个实验组处理都发现真菌；判定定殖成功；
7)判断真菌对铁皮石斛幼苗的促进作用：分别对4个处理的铁皮石斛幼苗的最长根长、最长叶长、株高、鲜重、干重在120天，150天，180天进行测量，每个阶段每个处理随机抽取8盆，40株苗进行测量，实验组与对照组进行比较分析，看实验组与对照是否存在差异。
进一步为，本发明的真菌用于促进药用铁皮石斛幼苗生长的有效共生真菌为胶膜菌属(tulasnella)真菌。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明以从铁皮石斛幼苗阶段分离获取的一株胶膜菌属真菌为材料，研究了其对药用铁皮石斛幼苗阶段促生长作用，结果证实此菌株极显著地促进铁皮石斛幼苗的生长，能明显的促进根、茎、叶的生长，即促进生物量的增长，缩短其生长周期，在各方面的促进作用都明显优于其它两株真菌。(2)本发明保证了获得的真菌是铁皮幼苗阶段的真菌，且促进效果十分显著。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
一株促进药用铁皮石斛幼苗生长的真菌。
1、所述的菌株是2018年9月在贵州兴义冷洞村铁皮石斛仿生态栽培基地铁皮石斛幼苗根中分离得到，对所得真菌进行形态和分子鉴定，于4℃冰箱试管斜面保存菌株待用；本发明涉及的菌株的nrdnaits序列已提交美国国立生物技术信息中心数据库(ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其genbank号为：mn545849；
2、一株编号为tpyd-2的胶膜菌菌株在pda平板上培养7天，其菌丝为白色，气生，菌落形态规则，呈圆形，每两天生长速度为1.700±0.385cm，培养时间较长，可见次级代谢产物颜色为淡黄色；
3、所获得的对铁皮石斛幼苗生长有效共生真菌its片段序列在美国国立生物技术信息中心数据库(ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行blast比对分析，其与kp050605.1真菌tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到97.42％。根据菌落、形态特征及分子生物学手段将本发明所涉及真菌鉴定为胶膜菌属真菌。
4、铁皮石斛无菌幼苗与3株真菌(皆属于胶膜菌属)进行共生培养试验：
利用铁皮石斛无菌幼苗与真菌在灭菌基质上共生培养，筛选出最有效果的真菌以及对比不同真菌对铁皮石斛幼苗的生长促进效果的差异；
4.1将保存于4℃试管斜面内的供试菌株取出，重新接种在pda平板培养基上，置于人工气候箱内25℃培养，进行活化。待真菌菌丝快长满培养皿时(约7天)取出作为共生培养材料；
4.2配制共生培养混合基质：所用共生培养基质由树皮、泥炭、椰糠等体积比混合而成。混合基质高温灭菌备用；共计3个实验组处理和一个空白对照处理，共计4个处理，每个处理24盆，每盆种5棵铁皮石斛幼苗，共计600棵铁皮石斛幼苗；
4.3铁皮石斛无菌苗准备：通过铁皮石斛种子在培养基上无菌萌发获得铁皮石斛无菌苗，太阳照射炼苗。选同一批播种并长势一致的铁皮石斛无菌苗作为实验材料。移栽之前需要把铁皮石斛幼苗上的培养基清洗干净，再用多菌灵浸泡30分钟，然后晾干，备用；
4.4铁皮石斛无菌苗与真菌共生培养：将备用的无菌苗移栽在盛有灭菌混合基质半径为5cm，高为10cm的花盆中，在实验组处理的花盆中的混合培养基质上接种约0.5cm3(1×1×0.5cm)含有单一真菌纯培养物的琼脂块，空白对照处理组接同样大小无菌pda培养基琼脂块。铁皮石斛幼苗与真菌培养的每一个处理分别放置在4个人工培养箱内，在温度为25℃，光周期12h/12h光照(2000lx)/黑暗培养；所述的铁皮石斛幼苗与真菌培养的每一个处理分别放置在4个人工培养箱内，避免真菌相互污染，在温度为25℃，光周期12h/12h--光照(2000lx)/黑暗，并定时浇水；
4.5真菌定殖检测：共生培养以后，每隔30天取铁皮石斛幼苗的根进行徒手切片，在显微镜下观察真菌在铁皮石斛幼苗根中定殖成功否，空白对照处理均没发现菌丝团定殖，实验组处理在第30天和60天均没发现菌丝团，在90天3个实验组处理都发现真菌定殖成功；所述的真菌定殖，空白对照处理均没发现菌丝团定殖，实验组处理在第30天和60天均没发现菌丝团，在90天3个实验组处理都发现真菌定殖成功，判断定殖成功的标准是在显微镜下观察得到菌丝团的存在；
4.6真菌对铁皮石斛幼苗的促进作用：分别对4个处理的铁皮石斛幼苗的最长根长、最长叶长、株高、鲜重、干重在120天，150天，180天进行测量，与对照组进行比较分析，实验组与对照是否存在差异；证明真菌对铁皮石斛幼苗的促进作用。
上述步骤中，步骤1按照菌种保藏单位的要求提供三支试管斜面培养的菌种材料入库获取入册登记编号；同时将测序所得的its序列上传至genbank提供的软件并提交获取genbank号；
步骤3所述的分子鉴定中，采用ctab法提取真菌dna，pcr扩增所用引物为its1和its4；pcr反应体系(25μl)包括：2.5μl10×pcr缓冲液，0.4μldntp，1.5μlmg2+，1.5μlits1，1.5μlits4，0.2μltaq酶，15.4μlddh2o，2μldna模板。扩增反应在pcr仪perkinelmer上进行，如下pcr循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序。对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类下地位；
步骤(4.2)所述的共生培养的混合基质，模拟了铁皮石斛生长特性；
步骤(4.3)所述的选同一批播种并长势一致的铁皮石斛无菌苗作为实验材料是减少误差，用多菌灵浸泡30分钟目的是减少杂菌干扰和防止铁皮石斛幼苗根腐烂；
步骤(4.4)所述的在实验组处理的花盆中的混合培养基质上接种约0.5cm3(1×1×0.5cm)含有单一真菌纯培养物的琼脂块，空白对照处理组接同样大小无菌pda培养基琼脂块，目的是排出pda培养基的干扰；
步骤(4.5)所述的在前期取根做徒手切片观察真菌定殖情况，在180天时取4个处理的根进行石蜡切片，在接菌处理中，发现了菌丝团，未接菌处理中没有发现菌丝团；
步骤(4.6)所述的分别对4个处理的铁皮石斛幼苗的最长根长、最长叶长、株高、鲜重、干重在120天，150天，180天进行测量，采用单因素方差分析，筛选出促进作用最好的真菌。
实例
一、胶膜菌(tulasnellasp.)tpyd-2菌株的分离与鉴定
1、把铁皮石斛无菌苗移栽原生境中，定期进行镜检，发现有真菌侵染到铁皮石斛幼苗根中时，采根带回实验室；
2、进行分离，对获得的真菌进行形态和分子鉴定，同时将药用铁皮石斛无菌苗与所得真菌进行共生培养实验筛选出促萌生长效果最好的菌株，于4℃冰箱试管斜面保存菌株待用；
3、把采回来的铁皮石斛幼苗的根用自来水洗净并去除附属物，在无菌操作台上，将其浸入盛有1％次氯酸钠(naclo)溶液的灭菌烧杯中，5min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌水冲洗3～4次，再将其放入75％的酒精中浸泡3min，用无菌水冲洗3～4次。采用单菌丝团的方法进行分离，用解剖针将其刮成极小碎屑，在解剖镜下观察并找到菌丝团，用移液枪将其转移到pda培养基中，在黑暗25℃条件下倒置培养。待菌丝长到一定长度时进行纯化，纯化过程是不断地切取菌丝尖端到新的pda培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落。
3、真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量pda培养基倒入规格为18×20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌(121℃，30min)。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于pda斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25±2℃培养。待菌丝要长满pda斜面时，将试管取出存入4℃冰箱内保存。
分离得到的菌株于保藏在中国典型培养物保藏中心；该菌株分类命名为胶膜菌属(tulasnellasp.)保藏号为cctccno：m2020165。
二、胶膜菌tpyd-2菌株的鉴定
为确认保藏号为cctccno：m2020165菌株的生物遗传学信息，已将其nrdnaits序列提交美国国立生物技术信息中心数据库(ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其genbank号为：mn545849，对其进行blast比对，鉴定结果表明该菌株与其与kp050605.1真菌tulasnellasp.最为相似，最大相似度达到97.42％。根据菌落、形态特征及分子生物学手段将本发明所涉及真菌鉴定为胶膜菌属(tulasnella)真菌。编号为tpyd-2的胶膜菌菌株在pda平板上培养7天，其菌丝为白色，气生，菌落形态规则，呈圆形，每两天生长速度为1.700±0.385cm，培养时间较长，可见次级代谢产物颜色为淡黄色；
所述的分子生物学鉴定涉及的真菌总dna提取采用ctab法；pcr扩增所用引物为真菌通用引物its1和its4；pcr反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。在美国国立生物技术信息中心数据库对所测序列进行比对分析，结合形态学特征确认其分类学地位。
三、真菌回接实验
利用铁皮石斛无菌苗与真菌在混合基质上共生培养，来检测分离到的真菌是否对铁皮石斛幼苗促进作用，并对比不同真菌对铁皮石斛幼苗促进效果的差异：
1、配制共生培养基质：所用基质为树皮、泥炭、椰糠等体积比混合而成；混合基质高温灭菌备用；共计3个实验组处理和一个空白对照处理，共计4个处理，每个处理24盆，每盆种5棵铁皮石斛幼苗，共计600棵铁皮石斛幼苗。
2、供试菌株重培养：将存于4℃试管斜面内的供试菌株取出，重新接种在pda培养基上，置于人工气候箱内25±2℃培养，进行活化。待真菌菌丝快长满培养皿时取出作为共生培养材料。
3、铁皮石斛无菌苗准备：通过铁皮石斛种子在培养上无菌萌发获得铁皮石斛无菌苗，太阳照射炼苗。选同一批播种并长势一致的铁皮石斛无菌苗作为实验材料。移栽之前需要把铁皮石斛幼苗上的培养基清洗干净，再用多菌灵浸泡30分钟，然后晾干，备用；
4、真菌回接：将备用的无菌苗移栽在盛有灭菌混合基质半径为5厘米，高为10厘米的花盆中，在实验组处理的花盆中的混合培养基质上接种约0.5cm3(1×1×0.5cm)含有单一真菌纯培养物的琼脂块，空白对照处理组接同样大小无菌pda培养基琼脂块。铁皮石斛幼苗与真菌培养的每一个处理分别放置在4个人工培养箱内，在温度为25±2℃，光周期12h/12h--光照(2000lx)/黑暗培养；
6、铁皮石斛幼苗生长情况统计：
6.1真菌定殖检测：共生培养以后，每隔30天取铁皮石斛幼苗的根进行徒手切片，在显微镜下观察真菌在铁皮石斛幼苗根中定殖成功否，空白对照处理均没发现菌丝团定殖，实验组处理在第30天和60天均没发现菌丝团，在90天3个实验组处理都发现真菌定殖成功；
6.2真菌对铁皮石斛幼苗的促进作用：分别对4个处理的铁皮石斛幼苗的最长根长、最长叶长、株高、鲜重、干重在120天，150天，180天进行测量，与对照组进行比较分析，实验组与对照是否存在差异。统计各处理下个阶段下的铁皮石斛幼苗的最长根长(r)、最长叶长(s)、株高(h)、鲜重(f)和干重(d)。
6.2在spss软件(版本25.0)中进行单因素方差分析，见表1。
表1：
注：mean±se，平均值±标准误，r＝[(不同接菌处理最长根长-对照最长根长)/对照最长根长]×100％，s＝[(不同接菌处理最长叶长-对照最长叶长)/对照最长叶长]×100％，h＝[(不同接菌处理株高-对照株高)/对照株高]×100％，f＝[(不同接菌处理鲜重-对照鲜重)/对照鲜重]×100％，d＝[(不同接菌处理干重-对照干重)/对照干重]×100％。
6.3结果表明
tpyd-2属于胶膜菌(tulasnellasp.)，来自铁皮石斛幼苗阶段，对铁皮石斛幼苗阶段有明显的促进作用。tpyd-2对幼苗的生物量、最长根长均具有较好的促生长作用；在接菌培养后的150d和180d，对最长叶长和株高也有明显的促进作用。tpyd-1在接菌培养后的120d和150d对最长根长和干重也有一定促进作用；然而，在接菌培养后的180d以及对最长叶长、株高和鲜重均无显著作用。tpyd-3能显著提高幼苗的干重，且在一定条件下能促进最长根长、最长叶长和鲜重的增加，但对株高均无明显作用。
以上所述的仅是本发明的具体实施例(本发明所记载的保护范围以本发明的数值内容和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南大学
<120>一株促进药用铁皮石斛幼苗生长的真菌
<160>1
<210>1
<211>1035
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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