一种蛋白及其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创口修复中的应用

本发明涉及一种蛋白，特别是其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创口修复中的应用。

背景技术：

伤口是正常皮肤结构和功能及软组织结构遭到破坏的结果，可由多种机制和病因造成。一般情况下，伤口会遵循有序的生理过程进行愈合。然而，部分伤口，尤其因溃疡和感染造成的慢性伤口，愈合难度很高。口腔溃疡则为口腔内及嘴唇周围黏膜或上皮破损肿痛的一类疾病，其病因主要包括物理性或者化学性损伤、微生物感染、化学药物治疗和放射性治疗引起的炎症反应。大部分口腔溃疡在发病过程中存在出血和微生物感染的现象。上述的这些疾病严重影响患者身体健康以及生活质量。

创面愈合是指由于致伤因子的作用造成组织缺失后，局部组织通过再生、修复、重建等进行皮肤修补的一系列病理生理过程。创面愈合包括凝血期、炎症期以及修复期，其中，止血、防止细菌的感染以及快速填补组织缺损是促进创面愈合最为关键的问题。

技术实现要素：

本发明之一提供了一种蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示，其中，自氮端起第2至7个氨基酸为组氨酸标签。

在一个具体实施方式中，所述组氨酸标签替换为flag标签和/或avi标签。

本发明之二提供了一种编码如本发明之一所述的蛋白的核酸。

在一个具体实施方式中，所述核酸的序列如seqidno.2所示。

本发明之三提供了一种携带有如本发明之二所述的核酸且能表达如本发明之一所述蛋白的重组微生物。

在一个具体实施方式中，所述重组微生物的出发菌株选自埃希氏菌属(escherichia)和酿酒酵母属(saccharomyce)中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述重组微生物选自大肠杆菌(escherichiacoli)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(pichiapastoris)中的至少一种。

本发明之四提供了一种组合物，其包括如本发明之一所述的蛋白和药学上可接受的载体。

在一个具体实施方式中，所述药学上可接受的载体选自水、磷酸缓冲液、生理盐水、生理上可匹配的缓冲液、生理上可匹配的溶液和生理上可匹配的悬浮液中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述蛋白在所述组合物中的浓度为100微克/毫升至1毫克/毫升。

本发明之五提供了本发明之一所述的蛋白、本发明之二所述的核酸、本发明之三中任意一项所述的重组微生物和本发明之四所述的组合物中的至少一种在成纤维细胞迁移、组织修复、创口修复及抑菌中的至少一种的应用。

在一个具体实施方式中，所述应用为在抑制丙酸杆菌属(propionibacterium)、葡萄糖菌属(staphylococcus)、芽孢杆菌属(bacillus)和念珠菌属(candida)中的至少一种微生物的应用。

在一个具体实施方式中，所述应用为在抑制痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)、金黄色葡萄糖菌(staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)以及白色念珠菌(candidaalbicans)中的至少一种的应用。

本发明的有益效果：

本发明人工合成了一种dna序列，并将其克隆到表达质粒中，利用大肠杆菌进行重组表达。然后，经离子交换层析和组氨酸亲和层析方法分离纯化，得到纯度高于95％的蛋白。体外细胞实验证明，本发明的蛋白能有效促进皮肤成纤维细胞迁移。将其用于动物皮肤创口模型，与对照组相比，该蛋白能显著促进皮肤创口或创面的修复与愈合。此外，该蛋白还能抑制有害微生物金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及痤疮丙酸杆菌的生长。因此，本发明获得的蛋白可以在伤口表面形成覆膜、减少有害细菌的数量同时促进皮肤细胞迁移，从而降低伤口感染及加快皮肤创口，尤其是难愈性皮肤创口或者大面积伤口的愈合，最终实现皮肤创口快速修复，从而有效提供病人的生存和生活质量。

本发明的蛋白(seqidno.1)分子量约为28.5千道尔顿，且不存在分子内/间二硫键，因而，可通过原核或者真核基因工程宿主进行大规模表达及分离纯化，并在使用过程中抑杀有害细菌/真菌，减少这些有害菌造成创口感染，便于临床治疗和日常皮肤护理。

附图说明

图1.蛋白nc2k的凝胶电泳检测分析

该图为蛋白nc2k的凝胶电泳检测。重组大肠杆菌菌株在lb培养基中生长到对数生长期，然后利用终浓度为1毫摩尔的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)在37℃下进行诱导表达6小时。通过冷冻高速离心收集菌体，加入裂解缓冲液(250mmtris-hcl，ph6.8；10％(w/v)十二烷基硫酸钠；0.5％(w/v)溴酚蓝；50％(v/v)甘油；5％(w/v)β-巯基乙醇)重悬菌体，并至于95℃水中孵育10分钟。然后，15000转/分钟(rpm)离心10分钟。取上清液进行10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。结果显示，蛋白nc2k约为28.5千道尔顿(kda)。利用组氨酸亲和层析凝胶以及cm阴离子交换层析凝胶联用的方法，将蛋白nc2k进行分离纯化，最终获得纯度为90％以上的目的蛋白。泳道1：重组菌株诱导前样品，泳道2为诱导后表达6小时后的菌体样品，泳道3为表达菌裂解上清样品；泳道4为组氨酸亲和层析后获得的重组蛋白；泳道5为cm阴离子交换层析凝胶纯化的重组蛋白；泳道6为浓缩后的重组蛋白样品；m为低分子量蛋白标记。

图2.蛋白nc2k促进原代皮肤成纤维细胞迁移

用磷酸缓冲液将蛋白nc2k稀释，使其终浓度分别达到10微克/毫升和100微克/毫升(μg/ml)，以仅加入磷酸缓冲液的样品作为空白对照组，以100微克/毫升(μg/ml)神经细胞黏连蛋白(货号：ag265，sigma)为阳性对照组。然后将细胞置于37℃培养12小时，用原代细胞划痕实验进行检测。实验结果显示，a：空白对照组细胞间距为7.0毫米；b：10微克/毫升nc2k处理组的细胞间距为6.2毫米；c：100微克/毫升处理组的细胞间距为2.9毫米，d：100微克/毫升神经细胞黏连蛋白阳性对照组的细胞间距为6.5毫米，说明蛋白nc2k以剂量依赖的梯度方式促进原代皮肤成纤维细胞迁移，且在同等剂量下，nc2k的促进作用显著优于阳性对照。

图3.蛋白nc2k不促进皮肤成纤维细胞增殖

用磷酸缓冲液将蛋白nc2k稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使其终浓度依次至40微克/毫升(μg/ml，低浓度)，200微克/毫升(中浓度)及1000微克/毫升(高浓度)，以加入磷酸缓冲液作为空白对照组。然后将细胞置于37℃培养48小时，用mtt方法进行检测。实验结果显示，蛋白nc2k对皮肤成纤维细胞没有促进增殖的效果，与空白对照组之间没有显著差异。

图4.蛋白nc2k抑制细菌和真菌的增长

将革兰氏阴性菌金黄色葡萄糖菌(staphylococcusaureus)、革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)以及真菌白色念珠菌(candidaalbicans)培养至对数生长期，用培养基稀释至od600＝0.001后，接种到固体培养基中，摇匀后倒入平皿中制备成检测平板，并用打孔器打出直径为5毫米的孔。用磷酸缓冲液将蛋白nc2k按10倍梯度稀释后，分别在标记为1-4孔中加入100微升；将等体积的磷酸缓冲液作为阴性对照加入到标记为5的孔中，然后将培养板倒置并置于细菌培养箱中，37℃培养24小时(细菌)或30℃培养48小时(真菌)。结果显示，nc2k蛋白能以浓度梯度依赖的方式显著金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及白色念珠菌的增长，100微克/毫升浓度为检测阈值。c为阳性对照组，200微克/毫升的氨苄青霉素；1为1毫克/毫升；2为100微克/毫升；3为10微克/毫升；4为1微克/毫升；5为100微克/毫升。

图5.蛋白nc2k对兔子皮肤创口的修复

在成年兔背部形成开放式创口(0.8厘米*0.8厘米)，每天每孔分别加入200微升nc2k溶液(a：100微克/毫升，低浓度组；c：1毫克/毫升，高浓度组)，以生理盐水(b，阴性对照)作为对照，每组3个重复。实验结果显示，处理10天后，高浓度和低浓度的蛋白nc2k处理组均可快速促使皮肤创口愈合，显著优于生理盐水处理组。

图6.蛋白nc2k对痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)引起的皮肤痤疮的治疗

用磷酸缓冲液稀释蛋白nc2k至终浓度1毫克/毫升，然后在明确由痤疮丙酸杆菌引起的痤疮面上进行涂抹(约1毫升)，每天两次，连续治疗3天后，皮肤表面的痤疮红肿情况明显减少。

具体实施方式

以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂、酶类等均可通过商业途径购买。

大肠杆菌pet-21a表达载体(货号：69740)以及重组表达宿主菌bl21(de3)(货号：69450)购自sigma-aldrich公司。

纯化重组融合蛋白所用到的组氨酸亲和层析凝胶(ni-agarose，货号：17526802)和离子层析凝胶(cmsepharosefastflow，货号：17071901)购自美国ge公司。

金黄色葡萄球菌(货号：gdmccno.1.178)、白色念珠菌(货号：gdmcc2.194)以及枯草芽孢杆菌(货号：gdmcc1.136)购自广东省微生物菌种保藏中心。

实施例1.表达重组蛋白nc2k表达质粒的构建、表达以及分离纯化

本发明设计的目标蛋白的氨基酸序列如seqidno.1，其可以通过如seqidno.2所示的核酸编码。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成序列为seqidno.2所示的核酸，然后利用基因工程方法将该核酸片段克隆到大肠杆菌表达系统pet-21a中，得到重组质粒pet-nc2k。将重组质粒pet-nc2k转化到大肠杆菌宿主bl21(de3)中表达出靶标蛋白(命名为nc2k)。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)检测分析显示蛋白nc2k的分子量约为28.5千道尔顿(kda)(图1)。通过组氨酸标记凝胶亲和层析以及cm离子交换层析凝胶联用的方法获得纯度大于90％的蛋白nc2k。将纯化后的蛋白通过低温真空干燥的方法进行冻干，得到nc2k冻干粉并保存，上述所有实验的具体操作方法参考sambrooketal.，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny，1989。

实施例2.蛋白nc2k促皮肤成纤维细胞迁移功能的分析

将皮肤原代成纤维细胞(货号：pcs-201-012，atcc，美国)接种到改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)中，37℃培养至对数生长期，再接种到6孔细胞培养板中(200000个细胞/孔，1毫升培养基/孔)。将细胞培养至铺满培养孔表面(覆盖度为100％)后，用细胞刮刀进行轻轻划痕，划痕宽度约为8毫米。用磷酸缓冲液(137毫摩尔氯化钠，2.7毫摩尔氯化钾，10毫摩尔磷酸二氢钠，2毫摩尔磷酸二氢钾，10国际单位凝血酶，1毫摩尔氯化钙以及0.5毫摩尔氯化镁，ph＝7.2)稀释蛋白nc2k冻干粉至1毫克/毫升(mg/ml)，然后按比例加入到细胞铺满培养孔表面的细胞培养板，使蛋白nc2k的终浓度分别为10微克/毫升(μg/ml)及100微克/毫升(μg/ml)，以加入磷酸缓冲液的样品为空白对照组，以加入终浓度为100微克/毫升(μg/ml)商品化神经细胞黏连蛋白(neuralcelladhesionmolecule，ncam，货号：ag265，sigma)作为阳性对照。每组进行三个重复。37℃培养12小时后，利用倒置显微镜进行观察并记录细胞迁移的距离，结果见图2。结果显示，与空白对照组相比，蛋白nc2k以浓度依赖的方式促进皮肤成纤维细胞迁移，且在相同剂量下，其促皮肤成纤维细胞迁移的能力强于阳性对照神经细胞黏连蛋白。

实施例3.蛋白nc2k促皮肤成纤维细胞增殖功能的分析

将皮肤原代成纤维细胞(货号：pcs-201-012，atcc，美国)接种到改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)中，37℃培养至对数生长期，再接种到96孔细胞培养板中(5000个细胞/孔，100微升培养基/孔)。用磷酸缓冲液(137毫摩尔氯化钠，2.7毫摩尔氯化钾，10毫摩尔磷酸二氢钠，2毫摩尔磷酸二氢钾，10国际单位凝血酶，1毫摩尔氯化钙以及0.5毫摩尔氯化镁，ph＝7.2)稀释蛋白nc2k冻干粉至1毫克/毫升(mg/ml)，然后按比例加入到96孔细胞培养板，使蛋白nc2k的终浓度依次至40微克/毫升(μg/ml，低浓度)，200微克/毫升(中浓度)以及1000微克/毫升(高浓度)，以加入磷酸缓冲液的样品为空白对照组。每种浓度处理各3个重复孔。在37℃培养48小时后，加入终浓度为5毫克/毫升的噻唑兰溶液(mtt，10微升/孔)，37℃继续培养4小时。弃去培养基，每孔加入150微升的二甲基亚砜(dmso)，然后置于摇床上缓慢振荡10分钟。最后，利用酶标仪(multiskan，mk3酶标仪，上海)测定各孔的吸光度(测定波长为490纳米)，结果见图3。结果显示，与空白对照组相比，蛋白nc2k对皮肤成纤维细胞没有明显的促增殖作用。

实施例4.蛋白nc2k抑制细菌与真菌的生长

金黄色葡萄球菌按0.1％的比例(v/v，体积/体积)接种到lb液体培养基中(蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠10克/升，用1摩尔/升的氢氧化钠溶液调ph至7.0)；枯草芽孢杆菌按0.1％的比例(v/v，体积/体积)接种到枯草芽孢杆菌维持培养基中(胃蛋白胨6克/升，酪蛋白胨4克/升，酵母提取物3克/升，牛肉浸膏1.5克/升，葡萄糖1克/升，调ph至6.8)；白色念珠菌按2％的比例(v/v，体积/体积)接种到ypd培养基中(蛋白胨20克/升，酵母提取物10克/升，葡萄糖20克/升，调ph至6.0)。将上述接种了细菌和真菌的培养基分别置于37℃(细菌)和30℃(真菌)振荡培养24小时。然后，按1:1000(体积/体积)的比例分别加入到添加对应的0.5％琼脂培养基中，并制备成菌液平板。具体操作以白色念珠菌为例说明，配制ypd培养基，然后加入琼脂粉(5克/升)，混匀后，121℃高温灭菌15分钟。待培养基温度下降至45℃时，按1:1000(体积/体积)的比例加入白色念珠菌菌液，摇匀后迅速倒入到直径为9厘米的灭菌平皿中，放超净台内静置直至培养基凝固。用灭菌打孔器(直径5毫米)在同一固体培养基平板上打6个孔，标记为1、2、3、4、5和c，备用。

将蛋白nc2k冻干粉用磷酸缓冲液(137毫摩尔氯化钠，2.7毫摩尔氯化钾，10毫摩尔磷酸二氢钠，2毫摩尔磷酸二氢钾，10国际单位凝血酶，1毫摩尔氯化钙以及0.5毫摩尔氯化镁，ph＝7.2)溶解，配制成终浓度为2毫克/毫升的蛋白水溶液。然后，用磷酸缓冲液梯度按10倍梯度进行稀释，使得溶液终浓度分别为1毫克/毫升、100微克/毫升、10微克/毫升和1微克/毫升，分别加入到标记为1-4的孔中(100微升/孔)，将等体积的磷酸缓冲液作为阴性对照组加入到标记为5的孔中，等体积的氨苄青霉素溶液(200微克/毫升)作为阳性对照组加入到标记为c的孔中。将平板倒置放入培养箱中，37℃培养24小时(细菌)或30℃培养48小时(真菌)后观察。

结果显示，200微克/毫升浓度的氨苄青霉素的阳性对照组能显著抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长，但对白色念珠菌无效。而浓度为1毫克/毫升以及100微克/毫升的蛋白nc2k能显著抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及白色念珠菌的生长(图4)。

实施例5.蛋白nc2k治疗兔子背部皮肤创伤

配制终浓度为2.5％(质量/体积w/v)的硫喷妥钠水溶液，然后以30毫克/公斤体重的比例经静脉缓慢注射方式麻醉兔子。快速将其背部的毛去掉，用灭菌手术剪将背部皮肤剪出9个面积为8毫米*8毫米的创口(3行，每行3个孔，图5)后，将其置于实验笼中直至完全苏醒。每天早上，将蛋白nc2k溶于0.9％的生理盐水中，配制成终浓度分别为1毫克/毫升(a组)和100微克/毫升(c组)，以生理盐水作为阴性对照组(b组)，每个处理组3个孔(水平排列)。在兔子背部右边的创口上滴加200微升，均匀覆盖整个伤口，每天处理1次，连续处理10天。实验期间，动物自由饮食。

结果见图5，实验结果显示，治疗5天后，与阴性对照组相比，无论高浓度还是低浓度的蛋白nc2k处理，均能快速收敛伤口，并减少炎症的产生。而高浓度处理组收敛伤口的速度优于低浓度处理组。治疗10天后，高浓度蛋白处理组的伤口基本愈合，而低浓度处理组的伤口接近愈合，阴性处理组仍然存在明显的创面。

实施例6.蛋白nc2k对痤疮丙酸杆菌引起的皮肤痤疮的治疗

对20位确诊患有由痤疮丙酸杆菌引起痤疮的女性患者(年龄在18-45岁之间)面部进行治疗：用磷酸缓冲液溶解蛋白nc2k冻干粉至终浓度为1毫克/毫升，然后将该溶液涂抹患有痤疮的面部，每天两次，每次2-3毫升，连续处理3天后的结果显示，面部红肿、痤疮数量显著减少，并能显著改善因痤疮引起的表皮粗糙等皮肤问题(图6)。

序列表

<110>温州医科大学

苏志坚

<120>一种蛋白及其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创口修复中的应用

<130>lha2060774

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>251

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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