一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法与流程

本发明属于微生物单孢分离
技术领域：
，尤其涉及一种无法在人工培养基培养的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单休眠孢子的分离技术。
背景技术：
：十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicaeworonin)侵染引起的一种世界性土传病害，是十字花科植物的重要根部病害。芸薹根肿菌(p.brassicae)是一种专性活体寄生菌，1995年ainsworth正式将根肿菌归入原生生物界根肿菌属。研究表明，根肿菌由于生理小种差异存在致病性分化，自然存在的群体常高度混杂。mananares等发现现有的寄主鉴别法确定的生理小种内还能够细分出致病型，提出只有采用单孢菌系进行的检测结果才更接近小种的真实致病能力(manzanares-dauleuxetal.,2001)。因此，在进行抗病性遗传分析的过程中，采用单孢分离、寄主扩繁、建立根肿菌单孢系鉴定根肿菌生理小种(singlesporeisolates,ssi)的方法所获得的鉴定结果更具有参考价值。病原微生物的单孢分离和接种办法，归纳起来主要有以下四种：一是自动体系，其运用于根肿菌的单孢分离在一定条件下的成功率可以达到40％～50％；但其运用受实验室的条件制约；二是直接的毛细管法，但比较适合能在人工培养基生长并且长出菌丝的微生物；三是玻璃针法，制作要求的环境条件高，且应用受制于孢子大小的要求(要在解剖镜下可见)，操作也较为繁琐；四是方便快捷的涂布平板法，却不适用于强寄生性的根肿菌的分离。另外，针对根肿菌的单孢分离也有报道，主要有毛细管打孔法，印痕法以及稀释液滴法，这些方法单独来看都具有一定的理论支持，但大都费时费力，可操作性不佳，分离难度大。如毛细管打孔法，需要稳定的显微操作，且带单孢的水琼脂一面难以取出沾染根毛，印痕法一个单孢的获取需要多次转移及检查，稀释液滴法在镜检时液滴分层多需要不断调整焦距细致查找，且放大倍数大的情况下需要调整玻片位置反复检查多个视野。技术实现要素：鉴于此，本发明的目的在于建立一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，在无特殊设备要求的情况下，能实现简单，方便，稳定，高效的分离微小的无法在人工培养基生长的单休眠孢子。本发明的技术方案的实现如下述：(a)根瘤洗净，腐熟后，表面消毒，榨成匀浆，经过过滤和密度梯度离心，得到浓缩的纯净孢悬液。(b)配制2％g/ml水琼脂溶液，并于灭菌的罐头瓶中煮沸至完全透明无气泡。移液枪吸取1ml至载玻片(提前置于烘箱中烘30min以上)上，快速盖上尺寸盖玻片，制备若干水琼脂平面(可置于铺有湿润滤纸的10cm*10cm塑料培养皿中封口保存约d)。(c)血球计数板计算浓缩孢悬液浓度，无菌水稀释，制备浓度为105～106/ml的印迹液。(d)干净锋利的手术刀灼烧灭菌，将琼脂平面切除厚度不均的边缘，随后分块为1～3mm的小块，进而用内径0.3mm的毛细管吸取一定量涡旋均匀的上述步骤(c)的印迹液，在水琼脂废料上印迹几次，保证随后印迹的稳定性，保持毛细管水平或者略向上倾斜15°角，琼脂平面与毛细管成垂直的状态下，对每个小块印迹。(e)将印迹好的琼脂平面块于显微镜下寻找带有单孢的琼脂块，定位到疑似单孢，在低倍数下检查印迹周围是否干净，只带有单个孢子。部分存在干扰质的目标在高倍数下检查确认有且只有一个单孢无误。(f)上述(e)得到的单孢用尖头镊子在10×/5×物镜下抓取，暂时转移到置于铺有湿润滤纸的塑料培养皿中的盖玻片上，待到检查完一整张琼脂平面，将所得所有单孢接种到健壮的2～3日龄ecd-05幼苗根毛上。进一步地，所述步骤(a)中，根瘤必须达到含有丰富休眠孢子的发病时期，在此基础上，根瘤越多，提取得到的孢子沉淀越多，易于与上清的分离。进一步地，所述密度梯度离心为：加清水离心2次，取沉淀溶于5ml50wt％的蔗糖溶液离心，取上清及最外层趋于溶解的米白色沉淀，加无菌水离心重复2～3次，直至上清达澄澈。最后得到的沉淀溶于10-15ml无菌水中。进一步地，步骤(b)中制备水琼脂平面尽量操作快速，平面尽量无气泡且厚度均匀。载玻片和10cm*10cm塑料培养皿可以放在55℃的烘箱中预热30min。进一步地，步骤(c)中印迹液浓度必须控制在105～106/ml范围内，与一张玻片上含有单孢的琼脂块的数量密切关联，孢子悬浮液的浓度可以由血球计数板计算，并稀释至该浓度范围。进一步地，所述步骤(d)中，在印迹前，先在水琼脂废料上印迹几次，保证随后印迹的稳定性。进一步地，步骤(d)所用毛细管内径0.3mm，在20×物镜下基本涵盖了印迹圈，不需要过多移动载物台即可完成一个小块的检查。步骤(e)单孢的琼脂块在不同放大倍数下的确认方式，需依据根肿菌休眠孢子大小，形状，及调焦过程呈现的微泛蓝光等特征，优选为：在20×物镜下寻找带有单孢的琼脂块，在10×物镜下检查印迹周围是否干净，在40×物镜下检查确认有且只有一个单孢无误。而多孢子的琼脂块一经确认无需多看直接舍弃。进一步地，单孢小块转移到铺有湿润滤纸的塑料培养皿中的盖玻片上暂存，暂存时要保证湿度。步骤(f)中单孢小块的暂存要保证湿度防止干燥后无法夹取以及琼脂平面肉眼不可见，接种时注意含有单孢的平面接触根毛。步骤(f)中接种后的幼苗仍保留在铺有湿润滤纸的3.5cm小培养皿中，25℃黑暗条件下共培养48h。所述所有步骤中器具需灭菌及一定温度烘干以保证无根肿菌污染，且互相之间一一隔离防止相互污染。本发明提出了一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，先用改进的蔗糖梯度离心法制备较纯的孢子悬浮液，借助血球计数板计算孢悬液浓度，基于一定浓度的孢悬液的基础上，利用琼脂分块平面毛细管印迹法(capillaryprintonagarpiecesplane)获取单休眠孢子(singlerestingspore)，继而接种到ecd系统中易感品种ecd-05催芽2～3d的健壮根毛上。与前人相关研究方法相比，主要克服了显微镜下单孢微小不易定位，液滴法视野分层过多且易干燥而无法吸取及显微操作无法精确挑取单孢等问题。平面毛细管印迹法结合可大大缩小显微镜镜检时需检查的视野范围，且分块的琼脂易于抓取，此外不需要先进的自动化仪器设备，可操作性强，可以显著提高单孢分离的效率。附图说明图1为需要的物品及重要步骤的图解(a-j)，a为所需物品，b为2％水琼脂，c为琼脂平面的制备冷却过程示意图，d为合格的琼脂平面，e为分块后的琼脂，f为毛细管印记过程示意图，g为印迹后正在沉降的琼脂小块，h为显微镜观察后确认有且只有一个休眠孢子的琼脂小块，i为单孢接种到健壮的2～3日龄ecd-05幼苗根毛示意图；j为接种单孢后正在水培的ecd05植株。图2为显微镜下单孢(b、c)与多孢子(a、d)的印迹琼脂小块(白色箭头标示孢子所在位置)。图3为不同浓度印迹液印迹的平均每单孢镜检耗时(a)及琼脂小块单孢占比(b)。图4为单孢接种ecd05引起的微小肿根，ecd05-ck为模拟接种1ml无菌营养液的对照组，jjb2-4t3、jj-b1-2t3、jj-b1t3为由来自江西九江的病原单孢接种得到的第三代ecd05继代植株病根，zjlsjye5-5t3、zjlsjye5-5t3为由来自浙江丽水缙云的病原单孢接种得到的第三代ecd05继代植株病根(白色箭头标示肿根所在部位)。图5为单孢接种后代的pcr检测结果(a、d)，白色标记标示检测为阳性的植株，b为3号引物扩增的序列与数据库参考序列比对结果，c为3号引物扩增的序列，虚线框标示出引物序列。e为6号引物扩增的序列与数据库参考序列比对结果(开头及结尾的虚线框标示出引物序列)。具体实施方式为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，发明人结合实施例进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例：(a)制备纯净的孢子悬浮液：收集来的病根洗净充分腐熟后，装满50ml离心管，70vol％酒精处理1min，然后10％naclo处理20min，无菌水冲洗3次；用榨汁机将根瘤榨成匀浆状，罐头瓶上固定八层纱布，进行第一次过滤；漏斗铺八层纱布，对滤液二次过滤；滤液收集于50ml的离心管中，配平至45ml后离心15min，去上清，加水至45ml，4000rpm离心10min，去上清；重复一次；沉淀溶于5ml50wt％的蔗糖溶液，3100rpm离心10min，取上清及最外层趋于溶解的米白色沉淀，加无菌水至45ml；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀溶于30ml无菌水中，3100rpm离心10min；重复2～3次，直至上清达澄澈；最后得到的沉淀溶于10-15ml无菌水中，保存于4℃。(b)寄主幼苗的准备：取一定量种子放入50ml离心管中，加入1％升汞30ml，28℃摇床中6-8min，超净工作台中无菌水冲洗8-10遍，2min/遍；种子播于铺有湿润滤纸的3.5公分小培养皿中，每皿一粒；锡纸包裹培养皿，置28℃培养箱催芽2-3d。(c)琼脂平面的制备：1g(0.5g)琼脂粉溶于50ml(25ml)无菌水(图1b)，煮沸至透明无气泡；1ml移液枪，吸取1ml水琼脂到玻片(烘箱中放置30min)上，迅速水平平稳的放上盖玻片；如此重复制备水琼脂平面若干(图1c)(可置于铺有湿润滤纸的10cm*10cm塑料培养皿中封口保存约2～3d)(d)印迹液的准备：实施例1中的纯净孢悬液，3100rpm离心7min，弃上清，加入1ml2％新鲜氯胺t，室温处理20min；3100rpm离心7min，弃上清，沉淀用无菌水洗2次，3100rpm离心7min，弃上清，沉淀溶于30ml抗生素(100mlddh2o水中加入2μl盐酸万古霉素母液(50mg/ml)，5μl硫酸粘杆菌素母液(20mg/ml)，2.4μl头孢噻亏钠母液(250mg/ml)。)，震荡，锡纸包裹置于25℃黑暗温育24h；无菌水洗3次，沉淀溶于无菌水中；取1μl稀释100倍，点于血球计数板计数，根据血球计数板原理计算得悬浮液孢子浓度，取部分稀释至105～106/ml制备得印迹液(注：印迹液太稀不利于长期保存)。(e)琼脂平面的分块及毛细管印迹：干净锋利的手术刀灼烧灭菌，将琼脂平面切除厚度不均的边缘，随后分块为1～3mm的小块，平均一张玻片50～120个小块(图1e)；进而用内径0.3mm的毛细管吸取一定量涡旋均匀的上述印迹液，在水琼脂废料上印迹几次，保证随后印迹的稳定性，保持毛细管水平，琼脂平面垂直的状态下，对每个小块印迹(若水琼脂表面张力大，印迹液流出明显，应食指堵住毛细管的另一端开口处，以保证印迹的稳定，印迹液尽量只在毛细管外径以内的部位)(图1f)；印迹后放回10cm塑料培养皿中沉降稳定，且防止琼脂失水过快(图1g)。(f)镜检印迹后的琼脂小块：将印迹好的琼脂平面块于显微镜下20×物镜下迅速寻找带有单孢的琼脂块，定位到疑似单孢，在10×物镜下检查印迹周围是否干净，只带有单个孢子。部分存在干扰质的目标在40×物镜下可检查确认有且只有一个单孢无误；镜检需依据根肿菌休眠孢子大小，形状，及调焦过程呈现的微泛蓝光等特征，而多孢子的琼脂块一经确认无需多看直接舍弃。(图2)表1列出了部分单孢分离的镜检耗时，并统计了载玻片上含有单孢的琼脂小块占总小块数的比例，血球计数板计数后的孢子悬浮液整数倍稀释作为印迹液，浓度从1.25*105/ml～1.35*106/ml不等，从柱形图(图3)可以看出，当印迹液浓度在6*105/ml时，平均每单孢镜检耗时最短，且玻片上含有单孢的概率越大。琼脂平面分块印迹法印迹液浓度在105～106/ml均有效，其中浓度在6*105/ml左右时分离效率最好。表1不同浓度印迹液单孢分离的效率表中：jx-jj、zj-ls-ecd05、zj-ls、wl分别表示病根来源于江西九江、浙江丽水病原单孢接种得到的第三代ecd05继代植株、温岭。(g)单休眠孢子隔离接种与共培养：上述得到的单孢用尖头镊子在10×/5×物镜下抓取，暂时转移到置于铺有湿润滤纸的塑料培养皿中的盖玻片上(图1h)，待到检查完一整张琼脂平面，将所得所有单孢接种到健壮的2～3日龄ecd-05幼苗根毛上(图1i)，接种后的幼苗仍保留在铺有湿润滤纸的3.5cm小培养皿中，培养皿用锡箔纸包裹，25℃黑暗条件下共培养48h。(h)水培与继代扩繁：移入霍格兰营养液中水培21d(图1j)；转入基质培养42d(第一代)(16h光照23℃，光强8000lx；8h黑暗20℃；空气湿度75％)；挖出病根，流动水清洗，检查发病情况记录疑似发病株编号；切碎病根，倒回原钵；覆盖一层薄薄的基质铺匀，浇水保湿，黑暗腐烂2～5d；ecd-05温汤浸种催芽2～3d；袋装分装灭菌的中号枪头在病根腐烂处挖洞，栽入催芽状况良好、根茁壮的苗；基质培养42d(第二代，以后依次类推)；若有疑似发病，做好标记，于病处取极少量装于灭菌的2ml离心管，pcr检测用。(i)单孢接种ecd05的病原检测表型观察：准备好121℃，20min高压蒸汽灭菌烘干的报纸；一次性pe手套；托盘若干(60-70℃烘箱烘1h以上)，贴好标签编号；滤纸有分隔的摆放于干净的托盘中，2-3张为一叠。戴橡胶手套多层一次性pe手套，整盆土脱出，左手抓地上部，右手清理露出主根系，洒出的基质倒回原钵，舍弃该层报纸及接触基质的一次性手套，进行下一株。做到每一株隔离，避免单孢系间相互污染(挖出的根按编号顺序摆好置于托盘，注意编号与盆、根一一对应)。流动水冲洗根部，洗净根部基质，置于铺好滤纸的托盘中，顺序一一对应，检查发病情况，记录疑似发病株编号。取样及pcr检测：单孢接种的ecd05病根观察到轻微根肿的在该部位取少量根组织于2ml离心管：dna快速提取法提取dna：装有组织的离心管中加入200μldna提取缓冲液及磁珠，破碎仪破碎组织(65hz，120sec)；研磨后组织液全部转入1.5ml离心管，13000rpm离心8min；准备新的1.5ml离心管，每管加入100μl异丙醇，取100μl上清转入含等体积异丙醇的离心管中，温和的晃动约50次，室温静置5min；13000rpm离心6min，去上清；1ml70vol％乙醇洗涤沉淀两次(上下摇动20次，13000rpm离心3min，弃上清，重复一次；空离1min)，吸出液体，沉淀晾干5min，加入25-50μlddh2o，-20℃备用。pcr检测：1.1xt3supermixpcr(购自擎科生物公司)反应体系如下：44μl1.1xt3supermix，2μltemplate，2μlprimerf，2μlprimerr；程序设定为98℃预变性2min30sec，进入35圈循环扩增(98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸10sec)，最后72℃充分延伸2min保证片段完整的扩增；pcr产物用0.8wt％的琼脂糖凝胶电泳分离，有目的条带的产物测序比对。观察的结果显示：单孢接种的479棵材料中明显发现肿根的材料和部分怀疑有极轻微症状的材料pcr检测，7对引物(引物序列及来源见表2)对单孢接种扩繁的材料扩增后，1号引物和3号引物的pcr扩增出750bp左右的寄主dna，小条带为根肿菌特异条带(图5a-c)，单孢接种材料检测，3号和6号引物的扩增效果较好，其中6号引物扩增产物片段小，在所有含芸薹根肿菌的材料中都能较好的扩增出特异性片段(图5a、d、e)，后期大量检测均采用6号引物对。分批次共计分离单孢并接种ecd05根毛，达479棵，能明显观察确认的微小肿根发生单孢接种的ecd05总计16棵，某些并没有发现明显的轻微肿根的材料也能通过pcr检测到病原菌的存在(图5e)，数量达124棵，占存活总数的25.25％(统计数据见表3)，说明本发明建立的单孢分离技术体系是稳定且高效的。表2检测芸薹根肿菌的七对引物及其来源引物对编号引物名称*引物序列(5'to3')引物来源1its1tccgtaggtgaacctgcgg(杨佩文，2003)its4tcctccgcttattgatatgc2ypwprimer1gaagatgcccacgccgtcgt(杨佩文etal.,2002)ypwprimer2atctgttcagcaaagcgtcga3ypwprimer3aggtgaacctgcggaaggat(杨佩文，2003)ypwprimer4ttcagcgggtaatcctacct4pbits1acttgcatcgattacgtccc(faggianetal.,1999)pbits2ggcattctcgagggtatcaa5pbits6caacgagtcagcttgaatgc(faggianetal.,1999)pbits7tgtttcggctaggatggttc6plasmo-3attttcgaaccatcctagcc(kageyamaetal.,2003)plasmo-4ggtcgcttcgttcaagctat7wfz-ugtaccactcactagccagaa(王芳展，2012)wfz-dagtacatcaacgacagcacc表3单孢接种ecd05检测有病原及发病的情况以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12