一种克雷伯氏菌、采用该克雷伯氏菌制得的复合菌剂及该复合菌剂的应用的制作方法

本发明涉及一种克雷伯氏菌，还涉及采用上述克雷伯氏菌制得的复合菌剂，最后涉及上述复合菌剂在染料废水脱色中的应用，属于污水处理领域。

背景技术：

印染行业是我国工业用水大户和废水排放大户，在纺织印染过程中，约有10％～20％的染料会成为废染料随废水排出，据不完全统计，我国印染废水的排放量约为300～400万m³/d，约占整个工业废水排放量的35％，印染废水排入水体后，会导致水体透明度下降，严重影响水体的观感，此外还会消耗水中的溶解氧，严重破坏水体生态平衡，威胁水生生物及人类安全。

印染废水具有水质水量变化大、cod含量高、色度深、碱度大(一般ph为8～10)、生物毒性大、氨氮浓度高以及水温偏高等特点，印染废水经冷却处理后进入生化处理阶段的水温一般为35～55℃(温度波动范围大)。目前对于印染废水的脱色主要包含物理法、化学法及生物法。物理法主要包含萃取法、吸附法、膜分离法等；化学法主要包含化学氧化法、电化学法、化学混凝法等；生物法是利用微生物降解染料实现脱色。因物理与化学处理方法大多存在着成本高、能耗大、效率低、难实施，且极易产生二次污染等问题，因此不适合大规模应用。相比之下，生物法成本低、效率高、操作简单、降解彻底，且不会产生二次污染，因而受到广泛关注。由于微生物对于其生存条件以及营养物质有着不同的要求，ph、盐度、温度等环境因素，对微生物脱色能力影响很大，极大限制了染料降解菌的工业化应用。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供一种克雷伯氏菌，本发明还提供含有上述克雷伯氏菌的复合菌剂，该复合菌剂能够在高碱度和高盐度下对高浓度染料废水进行高效脱色。

技术方案：本发明所述的克雷伯氏菌，命名为克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3，分类命名为克雷伯氏菌(klebsiellasp.)，菌株号为hr-3，现已保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2020605，保藏日期为2020年10月19日。

菌株hr-3的生物学性质如下：本发明克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3来源于垃圾渗滤液生化处理系统中的活性污泥，经分离纯化后，在lb培养基中，于35℃好氧条件生长良好，菌体边缘不规则，直径大小3～5mm，乳白色菌落，不透明，表面湿润有黏液，革兰氏阴性菌。

本发明克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3，经16srrna测序，采用blast分析，将克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3基因序列于ncbi中检索，其基因序列与klebsiellasp.ccfm8376，登录号为kj803933.1的亲缘关系最近，因此鉴定菌株hr-3为克雷伯氏菌。

采用上述克雷伯氏菌制得的复合菌剂，所述复合菌剂由保藏编号为cctccm2020604的解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2的扩培菌液和保藏编号为cctccm2020605的克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3的扩培菌液按体积比1:1混合而成。

复合菌剂中的解硫胺素芽孢杆菌，命名为解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2，分类命名为解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)，菌株号为yr-2，现已保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2020604，保藏日期为2020年10月19日。

解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2菌株来源于垃圾渗滤液污水处理系统活性污泥中，经分离纯化后，在染料培养基中于35℃好氧条件下生长良好，菌体边缘不规则，直径大小为2～6mm，米白色菌落，不透明，为革兰氏阳性菌。

其中，上述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为cctccm2020604的解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2和保藏编号为cctccm2020605的克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3分别按体积分数1％～3％接种于液体lb培养基中，于35℃下好氧培养至菌液的od值为1.5～2.0，分别得到yr-2的扩培菌液和hr-3的扩培菌液；

(2)将步骤(1)得到的yr-2扩培菌液和hr-3扩培菌液按体积比1:1混合，得到复合菌剂。

本发明还要解决的技术问题是提供上述复合菌剂在染料废水脱色中的应用。

所述的应用为：将复合菌剂接种于模拟染料废水中，于厌氧/缺氧下反应24～48h；其中，复合菌剂的接种量为1％～10％(体积分数)，染料废水的温度为30～55℃，染料废水的ph值为7～10，染料废水的盐度为1％～5％；染料废水中，染料的质量浓度为25～200mg/l；染料废水中的染料为活性艳红x-3b、活性黑5、中性红、甲基橙、刚果红、亚甲基蓝或孔雀石绿中的一种或多种的混合。

有益效果：本发明复合菌剂能够在高碱度及高盐度环境中对印染废水具有较高的脱色率，同时还能够适用于多种不同类型染料的高效降解脱色，本发明复合菌剂有效增加了微生物对印染废水的适应性与广谱性，具有良好的应用前景和生态效益。

附图说明

图1为克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3对不同染料的脱色效率图；

图2为解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2系统发育树；

图3为解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2在不同温度条件下对染料的脱色效率图；

图4为解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2对不同染料的脱色效果；

图5为复合菌剂在不同ph条件下的脱色效率图；

图6为复合菌剂在不同盐度条件下的脱色效率图；

图7为复合菌剂对不同染料的脱色效率图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3菌株是从某垃圾渗滤液处理系统活性污泥中筛选获得，具体过程如下：

(1)取某垃圾渗滤液生物段活性污泥；

(2)将得到的污泥按体积比10％接种至100ml灭菌后的染料培养基(染料培养基中的染料浓度为25mg/l)中，在生化培养箱中于35℃静置培养，观察染料培养基中颜色变化；培养至染料培养基无色后，将一级培养液按体积比10％接种至新的染料培养基(染料培养基的染料浓度为50mg/l)中，继续于35℃静置培养，观察染料培养基中颜色变化；培养至染料培养基无色后，将二级培养液按体积比5％接种至100ml新的染料培养基中(染料培养基中染料浓度为100mg/l)，培养至染料培养基无色后，再将三级培养液按体积比5％接种至100ml新的染料初始浓度为100mg/l的染料培养基中，如此在染料初始浓度为100mg/l的染料培养基中连续接种驯化3次，完成驯化；

(3)取出步骤(2)中驯化后的污泥，经过梯度稀释后，涂布于固体含活性艳红x-3b的培养基中(固体培养基包括如下质量组分：每升水中含琼脂20g、蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5.0g，mgso4·7h2o0.2g，活性艳红100mg，培养基的ph为7.0～7.5)，35℃下静态培养1～3d，获得单菌落；

(4)挑取步骤(3)中的单菌落划线纯化后，于斜面上划线保存，得到纯菌株；

(5)将步骤(4)得到的纯菌株-克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3接种1环于扩大培养基中35℃下好氧培养24～48h，得到hr-3的扩培产物。

纯菌株的扩大培养基为lb培养基、牛肉膏蛋白胨培养基或染料培养基中的一种。

lb培养基包括如下质量的组分：每升水中含酵母粉5.0g、氯化钠10g和蛋白胨10g，lb培养基的ph为7.0～7.5。

牛肉膏蛋白胨培养基包括如下质量的组分：每升水中含牛肉3g、蛋白胨10g和氯化钠5g，牛肉膏蛋白胨培养基的ph为7.2～8。

染料培养基包括如下质量组分：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5.0g，mgso4·7h2o0.2g，活性黑25～100mg，培养基的ph为6.5～7.5。

实施例2

将实施例1中筛选得到降解效果最佳、生长速率最快的菌株hr-3进行鉴定，经鉴定，菌株hr-3为克雷伯氏菌(klebsiellasp.)。

克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3，在lb培养基中，35℃好氧条件生长良好，菌体边缘不规则，直径大小3～5mm，乳白色菌落，不透明，表面湿润有黏液，革兰氏阴性菌。

通过pcr扩增和sanger法测序，得到hr-3菌株16srrna全序列如下(seqidno.1)：

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hr-3测序结果提交genbank进行blast比较，从blast结果中挑选hr-3碱基序列相似度大于99％的菌株序列，通过clustalw进行多重系列比对，并利用mage构建系统发育树得到hr-3与klebsiellasp.ccfm8376，登录号为kj803933.1的亲缘关系最近，因此鉴定菌株hr-3为克雷伯氏菌。

实施例3

克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3对不同染料脱色效果分析，具体步骤如下：

将实施例1中得到的克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3的扩培产物按体积比5％接种于液体模拟染料废水培养基中，染料废水温度为35℃，初始ph值为7.2，静置培养72h。菌株hr-3对不同染料的脱色效果见图1。

模拟染料废水培养基由以下原料组成：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5g，mgso4·7h2o0.2g以及混合染料100mg；混合染料由任意比例混合的活性艳红x-3b、活性黑5、甲基橙和孔雀石绿组成。

如图1所示，克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3对不同种类的染料脱色率均可达到90％以上，表明hr-3菌株对不同染料的脱色有一定的广谱性。从hr-3脱色速率观察，其前期(24h)脱色速率慢，后期(48～72h)脱色速率快，通过对脱色过程中体系ph的检测发现hr-3反应前期ph很快由7.2降低至6.3，表明前期有酸性物质产生。

实施例4

解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2菌株是从某垃圾渗滤液处理系统活性污泥中筛选获得，具体过程如下：

(1)取某垃圾渗滤液生物处理段活性污泥；

(2)将得到的污泥按体积比10％接种至100ml灭菌后的染料培养基(染料培养基中的染料浓度为25mg/l)中，在生化培养箱中于35℃静置培养，观察染料培养基中颜色变化；培养至染料培养基无色后，将一级培养液按体积比10％接种至新的染料培养基(染料培养基的染料浓度为50mg/l)中，继续于35℃静置培养，观察染料培养基中颜色变化；培养至染料培养基无色后，将二级培养液按体积比5％接种至100ml新的染料培养基中(染料培养基中染料浓度为100mg/l)，培养至染料培养基无色后，再将三级培养液按体积比5％接种至100ml新的染料初始浓度为100mg/l的染料培养基中，如此在染料初始浓度为100mg/l的染料培养基中连续接种驯化3次，完成驯化；

(3)取出步骤(2)中驯化后的污泥，经过梯度稀释后，涂布于固体含活性艳红x-3b的培养基中(固体培养基包括如下质量组分：每升水中含琼脂20g、蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5.0g，mgso4·7h2o0.2g，活性艳红100mg，培养基的ph为7.0～7.5)，35℃下静态培养1～3d，获得单菌落；

(4)挑取步骤(3)中的单菌落划线纯化后，于斜面上划线保存，得到纯菌株；

(5)将步骤(4)得到的纯菌株-解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2接种1环于扩大培养基中35℃下好氧培养24～48h，得到yr-2的扩培产物。

纯菌株的扩大培养基为lb培养基、牛肉膏蛋白胨培养基或染料培养基中的一种。

lb培养基包括如下质量的组分：每升水中含酵母粉5.0g、氯化钠10g和蛋白胨10g，lb培养基的ph为7.0～7.5。

牛肉膏蛋白胨培养基包括如下质量的组分：每升水中含牛肉3g、蛋白胨10g和氯化钠5g，牛肉膏蛋白胨培养基的ph为7.2～8。

染料培养基包括如下质量组分：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5.0g，mgso4·7h2o0.2g，活性艳红25～100mg，培养基的ph为6.5～7.5。

实施例5

将实施例4中筛选得到降解效果最佳、生长速率最快的菌株yr-2进行鉴定，经鉴定，菌株yr-2为解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)。

解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2，在lb培养基中，35℃好氧条件生长良好，菌体边缘不规则，直径大小2～6mm，米白色菌落，不透明，革兰氏阳性菌。

通过pcr扩增和sanger法测序，得到yr-2菌株16srrna全序列如下(seqidno.1)：

caggcggcgtgctatacatgcaagtcgagcggaccaacgaagagcttgctcttcggcggttagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcctgtacgactgggataactccgggaaaccggagctaataccggatacttctttcagaccgcatggtctgaaagggaaagacctttggtcacgtacagatgggcctgcggcgcattagctagttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgaacgatgaaggttttcggatcgtaaagttctgttgttagggaagaaccgccgggatgacctcccggtctgacggtacctaacgagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggcttcttaagtcaggtgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggccacttgaaactgggaagcttgagtgcaggagaggagagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacacccgtggcgaaggcggctctctggcctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgagtgctaggtgttggggactccaatcctcagtgccgcagctaacgcaataagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccagggcttgacatcccgctgaccctcctagagataggagctctcttcggagcagcggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgccagcatttggttgggcactctagggagactgccgtcgacaagacggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcctgggctacacacgtgctacaatggatggaacaacgggcagccaactcgcgagagtgcgcgaatcccttaaaaccattctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaaccgcaaggagccagccgccgaagtgacaggt

将菌株yr-2测序结果提交genbank进行blast比较，从blast结果中挑选与yr-2碱基序列相似度大于99.9％的菌株序列，通过clustalw进行多重系列比对，并利用mage构建系统发育树(见图2)得到yr-2与解硫胺素芽孢杆菌aneurinibacillussp.nccp-1217，登录号为lc065244.1，亲缘关系最近，因此，鉴定菌株yr-2为解硫胺素芽孢杆菌。

实施例6

解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2在不同温度条件下对模拟染料废水的脱色效率进行测定，具体步骤如下：

将实施例4中得到的解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2按体积比5％接种于液体的模拟染料废水培养基中，设置五组平行实验，五组平行实验的温度分别设置为30℃、35℃、40℃、50℃、60℃，染料废水初始ph值为7.2，静置培养72h，菌株yr-2在不同温度下对染料的脱色效率见图3。

模拟染料废水培养基由以下原料组成：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5g，mgso4·7h2o0.2g以及活性艳红100mg。

如图3所示，解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2在35～60℃下对活性艳红染料均可达到90％以上的脱色率。

实施例7

解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2对不同染料脱色效果分析，具体步骤如下：

将实施例4中得到的解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2按体积比5％接种于液体模拟染料废水培养基中，染料废水温度为40℃，初始ph值为7.5，静置培养72h。菌株yr-2对不同染料的脱色效果见图4。

模拟染料废水培养基由以下原料组成：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5g，mgso4·7h2o0.2g以及混合染料100mg；混合染料由任意比例混合的活性艳红x-3b、活性黑5、甲基橙和孔雀石绿组成。

如图4所示，解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2对不同种类的染料脱色效率有所不同，其对活性黑5染料72h的脱色率达80.47％，对其他染料72h的脱色率均达到95％以上，表明解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2能适用于不同染料的脱色处理。从yr-2脱色效率观察，其前期(24h)脱色速率快，后期(48～72h)脱色速率变缓。

实施例8

一种用于染料脱色复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将实施例1得到的解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2和实施例5得到的克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3分别按体积分数1％～3％接种于对应的液体lb培养基中于35℃下进行好氧培养，至菌液的od值为1.5～2.0；分别得到解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2的扩培产物和克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3的扩培产物；

(3)将解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillussp.)yr-2的扩培产物和克雷伯氏菌(klebsiellasp.)hr-3的扩培产物按体积比1:1混合，得到复合菌剂。

其中，lb培养基包括如下质量的组分：每升水中含酵母粉5.0g、氯化钠10g和蛋白胨10g，lb培养基的ph为7.0～7.5。

实施例9

实施例8得到的复合菌剂在不同ph条件下对染料模拟废水的脱色效率分析，具体步骤如下：

将上述复合菌剂按体积比5％接种于液体的模拟染料废水培养基中，设置四组平行实验，四组平行实验的培养基初始ph值分别为7、8、9、10，在温度35℃下静置培养48h，同时每组平行实验以不加菌剂的处理组为对照(不加菌剂的处理组是用来显示ph值不同(碱性程度不同)对废水颜色的影响)，不同ph值下脱色情况如图5所示。由图5可知，不加菌剂的对照组染料废水在不同碱性环境下脱色情况为：随着ph值的增加，脱色程度呈先增加后降低的趋势；而加入复合菌剂的处理组，随ph值的增大，脱色率分别为96.13％、96.33％、95.13％、94.74％，均保持在90％以上。复合菌剂可针对体系中的碱性环境能够通过分泌酸性物质进行自我调节，从而保持稳定的脱色环境，进而保证稳定的脱色效率。

模拟染料废水培养基由以下原料组成：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5g，mgso4·7h2o0.2g以及活性艳红x-3b100mg。

实施例10

实施例8得到的复合菌剂在不同盐度条件下对染料模拟废水的脱色效率分析，具体步骤如下：

将上述复合菌剂按体积比5％接种于液体的模拟染料废水培养基中，设置五组平行实验，以培养基中nacl含量的不同设置五组平行实验模拟染料废水的盐度分别为0％、3％、5％、10％、15％，在初始ph值为8、温度为35℃下静置培养96h，不同盐度下脱色效率如图6所示。通过图6可知，随着盐度的增加复合菌剂的脱色效率先增加后降低，3％以下盐度随着盐度增加脱色效率略有提高；3％～10％盐度下脱色效率随着盐度的增加显著降低，但随着脱色时间的延长脱色率仍然显著升高；10％以上盐度脱色效率上升缓慢。

模拟染料废水培养基由以下原料组成：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5g，mgso4·7h2o0.2g、活性艳红x-3b100mg以及nacl10～150mg。

实施例11

实施例8得到的复合菌剂对不同类型染料的脱色效率分析，具体步骤如下：

将上述复合菌剂按接种量5％(体积分数)接种于液体的模拟染料废水培养基中，在温度为35℃，初始ph值为8下静置培养24h。复合菌剂对不同染料的脱色效果如图7所示，由图7可知，复合菌剂对偶氮染料及三甲苯染料24h的脱色率均达到90％以上。

模拟染料废水培养基由以下原料组成：每升水中含蛋白胨2g，na2hpo41.35g，kh2po41.8g，葡萄糖5g，mgso4·7h2o0.2g以及混合染料100mg；混合染料由任意比例混合的活性艳红x-3b、活性黑5、中性红、甲基橙、刚果红、亚甲基蓝和孔雀石绿组成。

序列表

<110>南京江岛环境科技研究院有限公司

<120>一种克雷伯氏菌、采用该克雷伯氏菌制得的复合菌剂及该复合菌剂的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>克雷伯氏菌(klebsiellasp.)

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