一种新型光敏感通道蛋白VR1.0在制备视网膜感光细胞退行性疾病药物中的应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新型光敏感通道蛋白vr1.0在制备视网膜感光细胞退行性疾病药物中的应用。

背景技术：

视网膜感光细胞退行性疾病，是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的退行性疾病。该类疾病主要是由基因突变或视网膜色素上皮细胞(rpe细胞)功能障碍引起的，常见的典型例子是视网膜色素变性(rp)和老年黄斑变性(amd)，也是两种重要的棘手的致盲眼病。由遗传性原因所导致的感光细胞退行性改变的患病率约为1/3500-1/4000，中国目前有视网膜色素变性的病人40万人，全世界的患者在150万人以上。而后天药物和疾病原因所引起的继发性视网膜感光细胞退行性疾病也日益增高。

由于视网膜感光细胞退行性疾病中感光细胞的凋亡不可逆且有大多数疾病具有高度的遗传异质性，相关疾病的治疗也变得十分困难。目前的治疗手段包括干细胞移植、基因治疗、视网膜假体植入及光遗传学等。光遗传学正是利用退行性病变视网膜剩余结构的完整性，以腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)为载体将光敏蛋白靶向表达在视锥细胞(退行性病变早期)、on型双极细胞或神经节细胞(退行性病变中晚期)来恢复视网膜的光反应，除此之外还可结合干细胞、虚拟现实系统和全息成像技术等来恢复视觉功能。

光遗传学作为一个不依赖突变位点基因功能，并能在单细胞水平响应光刺激的治疗策略，在治疗视网膜感光细胞退行性疾病上有很大潜力。然而，光遗传学工具的生物学性能一直是限制视觉功能恢复的关键因素，尤其是光敏感性和动力学。目前应用于视觉恢复的光敏蛋白不能很好平衡光敏感性和动力学来满足视觉信号需求。因此，需要一类兼顾高敏感性、快动力学，并在高频率响应下保持电流信号的稳定，用于视网膜感光细胞退行性疾病药物中。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服了现有技术的缺点与不足，提供一种兼顾高敏感性、快动力学的新型光敏感通道蛋白vr1.0，以及所述光敏感通道蛋白vr1.0在制备视网膜感光细胞退行性疾病治疗药物中应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种光敏感通道蛋白vr1.0，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

一种上述光敏感通道蛋白vr1.0的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

一种载体，含有上述光敏感通道蛋白vr1.0的编码基因，其转入宿主细胞后可表达上述光敏感通道蛋白vr1.0。

一种重组病毒，含有上述光敏感通道蛋白vr1.0的编码基因，其转入宿主细胞后可表达上述光敏感通道蛋白vr1.0。所述的重组病毒可以为重组腺病毒。

上述光敏感通道蛋白vr1.0、光敏感通道蛋白vr1.0的编码基因、载体或重组病毒在制备药物中的应用。所述的药物包括恢复视网膜光感受器功能的药物、恢复视力的药物、恢复感光能力的药物、治疗视网膜退化性疾病的药物。

一种药物，包含上述光敏感通道蛋白vr1.0、光敏感通道蛋白vr1.0的编码基因、载体或重组病毒。所述的药物包括恢复视网膜光感受器功能的药物、恢复视力的药物、恢复感光能力的药物、治疗视网膜退化性疾病的药物。

本发明的优点和有益效果：本发明证实光敏感通道蛋白vr1.0在治疗视网膜感光细胞退行性疾病中具有明确的治疗效果，这种新型光敏感通道蛋白兼顾高敏感性、快动力学，在高频率响应下保持电流信号的稳定，并在相同的光刺激条件下具有更快的响应频率。本发明为开发用于视网膜感光细胞退行性疾病的光遗传治疗提供了新的思路，扩大了临床光遗传治疗的可选择范围，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1是质粒gv388-vr1.0扩增抽提后测序比对结果。

图2是携带vr1.0序列的腺相关病毒raav2/2-cmv-vr1.0-egfp转染hek293t细胞48h后的荧光图。

图3是hek293t细胞表达vr1.0后膜片钳记录的光电流，反应了vr1.0的光敏感性(a、b)和响应频率(c)。

图4显示了膜片钳记录玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠视网膜切片中的神经节细胞实时图像(a)和光电流(b)。

图5显示了c57bl/6j、玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗的rd1和同窝未经任何处理的rd1小鼠的视觉诱发电位。

图6显示了c57bl/6j、玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗的rd1和同窝未经任何处理的rd1小鼠老鼠在明暗箱里的对光趋避反应。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1raav2/2-cmv-vr1.0-egfp重组病毒的包装

合成两端添加bamhi、kpni酶切位点的vr1.0基因片段，将vr1.0基因片段和病毒载体(gv388，paav-cmvbglobin-mcs-egfg-3flag)分别用限制性内切酶bamhi和kpni酶切后，回收、连接，连接产物转化trans5α化学感受态细胞。筛选到转有重组质粒的菌落，扩大培养后提取质粒进行测序验证，序列比对结果见图1，表明重组质粒gv388-vr1.0构建成功。利用aav无辅助病毒系统(aavhelper-freesystem)生产重组腺相关病毒，aavhelper-freesystem主要由病毒载体(gv388)、paav-rc载体和phelper载体组成(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)，参照aavhelper-freesystem说明书进行病毒包装。获得raav2/2-cmv-vr1.0-egfp重组腺相关病毒(病毒血清型为2型的raav，即(raav2/2)，启动子为巨细胞病毒序列(cytomegalovirus，cmv)，标记基因为egfp)。

实施例3细胞系hek293t的培养与raav2/2-cmv-vr1.0-egfp病毒的转染

hek293t细胞首先种植在5ml含有10％胎牛血清、1×dmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium)、100u/ml青霉素g、100μg链霉素的培养基的6cm培养皿中，置于37℃、95％空气、5％co2的生化培养箱中进行传代培养。待hek293t细胞铺满90％左右的培养皿后，将hek293t细胞转入含有包被明胶的玻片的24孔板中进行培养，所含培养基与上述相同，培养24h后进行raav2/2-cmv-vr1.0-egfp病毒的转染。将24孔板中的血清用负压吸引管吸出，替换为1ml含1％胎牛血清、1×dmem、100u/ml青霉素g、100μg链霉素的培养基，再加入2μl的raav2/2-cmv-vr1.0-egfp病毒(滴度为1.01e+12v.g/ml)，继续培养48h。培养完成后用荧光显微镜观察表达情况。结果见图2，raav2/2-cmv-vr1.0-egfp病毒可高效表达在hek293t细胞上。

实施例4全细胞模式膜片钳记录对光反应

转染后继续培养48h后的hek293t细胞在恒定室温25℃条件下进行全细胞电压钳模式记录。细胞外液140mmol/l氯化钠、5mmol/l氯化钾、2mmol/l氯化钙、20mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸、16mmol/l葡萄糖，用氢氧化钠将ph调至7.4，置于室温；细胞内液115mmol/l甲基磺酸铯、20mmol/l氯化铯、2.5mmol/l氯化镁、0.6mmol/l乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、10mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4mmol/l腺苷5ˊ-三磷酸镁盐、0.4mmol/l鸟苷5ˊ-三磷酸钠盐、10mmol/l磷酸肌酸，用氢氧化铯将ph调至7.2，置于冰上。实验前30min将细胞外液用100％o2进行预充氧。用水平拉制仪(信号modelp-1000，sutterinstrument公司)拉制玻璃微电极(bf150-86-10，sutterinstrument)，电阻大小为6～8mω。转染raav2/2-cmv-vr1.0-egfp病毒的hek293t细胞置于细胞外液中暗适应30min，待细胞状态稳定后进行膜片钳实验。为验证vr1.0的光敏感性，依次在2.7×10¹⁶、4.7×10¹⁵、6.4×10¹⁴、7.9×10¹³photons/cm²s光强下记录电流，并在2.7×10¹⁶photons/cm²s的光强下让vr1.0在1s光刺激后充分恢复，在clampfit10.6软件中分析开放时间常数，关闭时间常数。此外，为探讨vr1.0的对光响应频率，设置2、4、8、16及32hz的脉冲光刺激。光源为mightex外置光纤(470nm)，刺激时间由bioled控制软件设置，具体光强由光功率计测量。结果见图3，其中，图3a为vr1.0在470nm波长、光强为2.7×10¹⁶、4.7×10¹⁵、6.4×10¹⁴、7.9×10¹³photons/cm²s的条件下，刺激1s产生的电流图；图3b为在图3a的实验条件下记录的电流大小；图3c为470nm波长、光强为2.7×10¹⁶photons/cm²s的条件下，光刺激频率在2、4、8、16和32hz下vr1.0的电流响应情况。根据国际非电离辐射防护委员会(internationalcommissiononnon-ionizingradiationprotection,icirp)指南，470nm蓝光对视网膜安全的光强不得超过7.62×10¹⁴photons/cm²s，vr1.0可以在7.9×10¹³photons/cm²s，远低于视网膜安全的光强阈值条件下产生光电流，不会对视网膜产生光毒性作用。其次，在响应频率上，视觉信号处理需要24hz，vr1.0可以响应至少32hz的光刺激，满足视觉信号需求。

实施例5rd1小鼠玻璃体腔内注射病毒raav2/2-cmv-vr1.0-egfp

出生后4周的rd1小鼠，按体重用100mg/kg氯胺酮和12mg/kg甲苯噻嗪的混合物腹腔注射麻醉。充分麻醉后用0.5％活力碘消毒眼表及眼眶周围皮肤。为减少玻璃体腔注射给小鼠带来的不适，用盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔卡因)对小鼠眼球进行表麻。固定好小鼠并暴露眼球，使用nanojectiii高精度微量注射器(drummondscientific，usa)搭配玻璃微电极(wpi，usa)吸取raav2/2-cmv-vr1.0-egfp病毒1.5μl(滴度为1.01e+12v.g/ml)，靠小鼠鼻侧的角巩膜缘下0.5mm处进针完成玻璃体腔注射，以相同方式完成另一侧眼玻璃体腔注射。注射完成后在小鼠眼球涂抹盐酸左氧氟沙星眼用凝胶(杰奇)预防感染。2周后用相同的方式在小鼠颞侧角巩膜缘下0.5mm处进针，进行第二次病毒注射，病毒剂量相同。1月后进行疗效观察。

实施例6膜片钳记录rd1小鼠视网膜表达vr1.0-egfp的rgcs的电流

取实施例5的玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后的rd1小鼠处死后快速(30分钟内)将视网膜从预先充满95％o2+5％co2的细胞外液中分离出来。仔细清理离体视网膜周边组织，将视网膜神经节细胞(retinaganglioncells,rgcs)层置于millipore滤纸上，并使用手动切片机(美国seleltingtissueslicer)将视网膜切为150μm宽。在室温(25℃)下使用标准程序进行全细胞模式膜片钳记录。细胞外记录液中含有以下成分：125mmol/l氯化钠，2.5mmol/l氯化钾，1mmol/l硫酸化镁，2mmol/l氯化钙，1.25mmol/l磷酸二氢钠，26mmol/l碳酸氢钠，20mmol/l葡萄糖，使用前至少30分钟预充混合气(95％o2+5％co2)。电极溶液包含以下成分：115mmol/l甲基磺酸铯，20mmol/l氯化铯，2.5mmol/l氯化镁，0.6mmol/l乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，10mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4mmol/l腺苷5ˊ-三磷酸镁盐，0.4mmol/l鸟苷5ˊ-三磷酸钠盐，10mmol/l磷酸肌酸，使用氢氧化铯将ph调整为7.2。光刺激系统和膜片钳装置与实施例4中的实验相同，但本实验贴片电极是由硼硅酸盐玻璃制成的，拉到5～7mω。结果见图4，图4a表示raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后的rd1小鼠视网膜切片在荧光显微镜下的图片；图4b表示全细胞模式膜片钳记录表达vr1.0-egfp的rgcs的电流图。raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后的rd1小鼠视网膜恢复了对光反应，可以产生光信号。

实施例7视觉诱发电位

取野生型c57bl/6j、玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠和同窝未经任何处理的rd1小鼠，100mg/kg氯胺酮和12mg/kg甲苯噻嗪的混合物腹腔注射麻醉动物。理发器将小鼠两眼至两耳之间毛发剔除，充分暴露前囟与人字缝尖。使用大脑立体定向仪(rwd，中国深圳)固定小鼠头部。于flashvep实验前48h，将直径为0.25mm的银丝电极植入右侧初级视觉皮层(记录电极，距bregma点3.6mm处，两侧2.3mm处)。实验前，小鼠暗适应8h，随后小鼠使用100mg/kg氯胺酮和12mg/kg甲苯噻嗪的混合物腹腔注射麻醉，复方托匹酰胺滴眼液(0.5％托匹酰胺+0.5％盐酸脱氧肾上腺素)扩瞳5min。将参考电极插入眼睛之间的皮肤下，接地电极夹在鼠尾上。采用闪光刺激器(irc,china,chongqing)进行64次重复光刺激(2800μs，蓝光，5.0cds/m²)。带通滤波在3.0～70.0hz之间时，记录2000hz采样率的实验结果，使用retiminer4.0软件(irc,china,chongqing)生成并记录数据，得到n1振幅数据表。结果见图5，野生型c57bl/6j小鼠fvep的n1波幅为-24.7±6.7μv、玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠的为-12.4±1.8μv和rd1小鼠的为1.6±1.0μv，n＝8。说明了玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠在视网膜上产生的视觉信号传递到了视觉皮层v1区。

实施例8小鼠光诱导明/暗箱行为实验

明/暗箱(light/darkbox)由左右两个同等大小(18cm*20cm*18cm)的隔室，两隔室之间由一个拱形门(7cm*5cm)相联。明箱装有470nmled光源(加拿大mightex)，暗箱用一黑色布套包裹。所有野生型c57bl/6j、玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠和同窝未经任何处理的rd1小鼠周龄都在10-12周之间。实验前小鼠暗适应2小时。所有行为实验均在18:00至21:00之间进行。实验开始时，把将c57bl/6j、玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后的rd1小鼠和rd1小鼠单独放在蓝光(470nm)光强为4.7×10¹⁴photons/cm²s的明箱里，让它们自由探索，以小鼠头部位置分析其在明暗箱中的运动情况。随后将收集到的数据导入prism7(graphpadsoftware,lajolla,ca)。采用单因素方差分析(one-wayanova)评估其显著性，p<0.05为显著水平。结果见图6，在明箱中的活动时间占总时间比：c57bl/6j小鼠：40.1％±2.1，n＝11；玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠：40.8％±3.7，n＝19；rd1小鼠：86.1％±4.0，n＝13。玻璃体腔注射raav2/2-cmv-vr1.0-egfp治疗后rd1小鼠恢复了对光的逃避反应，证明了vr1.0可以恢复视网膜退行性病变rd1小鼠的视觉指导的行为学，在治疗视网膜退行性病变中的有效性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>一种新型光敏感通道蛋白vr1.0在制备视网膜感光细胞退行性疾病药物中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>341

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metargproglnileleuleuleuleualaleuleuthrleuglyleu

151015

alaasnglythrgluglyproasnphetyrvalpropheserasnlys

202530

thrglyvalvalargsermetglypheglnleuasnproglutyrleu

354045

asngluthrileleuleuaspaspcysthrproiletyrleuasnval

505560

glyproleutrpgluglnlysvalalaargglythrglntrpphegly

65707580

valileleuserleualapheleuiletyrtyriletrpilethrtyr

859095

lysalathrcysglytrpglugluleutyrvalcysthrilegluphe

100105110

cyslysilevalilegluleutyrpheglupheserproproalamet

115120125

iletyrglnthrasnglygluvalthrprotrpleuargtyralaglu

130135140

trpleuleuthrcysprovalilecysilehisleuserasnilethr

145150155160

glyleuasnaspasptyrserglyargthrmetserleuilethrser

165170175

aspleuglyglyilecysmetalavalthrseralaleuserlysgly

180185190

trpleulystrpleuphephevalileglycyscystyrglyalaser

195200205

thrphetyrhisalaalaleuiletyrileglusertyrtyrthrmet

210215220

prohisglyvalcyslysasnmetvalleualametalaalavalphe

225230235240

phethrsertrpphemetpheproglyleupheleualaglyproglu

245250255

glythrasnalaleusertrpalaglyserthrileglyhisthrval

260265270

alaaspleuleuserlysasnalatrpglymetileglyhispheleu

275280285

argleugluilehislyshisileileilehisglyaspvalargarg

290295300

proilethrvalasnthrleuglyarggluvalthrvalsercysphe

305310315320

valasplysgluglugluaspgluaspgluargileserthrlysthr

325330335

tyralaasnargala

340

<210>2

<211>1023

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgcgaccccaaatactcctcttgctggctttgttgacccttggactggctaacggaaca60

gaaggtcccaacttctacgttcctttcagcaataagacaggcgtagtcagatccatgggc120

ttccagctcaatccggaatacctgaacgaaacaattttgctggacgactgtacgccaatc180

tatctgaacgtcggtcccctgtgggagcaaaaggttgcccgaggtacgcaatggtttggt240

gttatcctctcgttggcgtttctcatctattatatatggataacatataaggcgacttgc300

ggatgggaagaactgtacgtgtgtacgatcgaattttgtaaaattgtaattgaactctac360

ttcgagttttcgcctccggcgatgatatatcagaccaacggagaggtaacgccctggttg420

cgatatgctgaatggctcttgacctgcccagtcatttgcatacatttgagtaacattaca480

ggactcaatgacgactattcgggccgaactatgtccctgatcacatccgacctgggaggc540

atctgcatggccgttacttccgccttgagtaaaggctggttgaagtggctctttttcgtg600

atcggctgttgttacggtgctagtacgttttatcatgcggcgctcatatatatagaaagt660

tactacactatgcctcacggtgtttgtaaaaacatggtattggcgatggcagcggtattt720

tttacaagttggttcatgtttcccggtttgttcctggcaggccctgaaggaaccaatgca780

ctgtcgtgggcgggctcgactatcggtcataccgtggcagatttgctctccaaaaacgcc840

tggggtatgattggtcacttcctccgactggagatacacaaacatataattattcatggt900

gatgttcgtcgcccgataacggttaataccttgggacgagaagtcacggtgtcgtgtttt960

gtcgataaagaagaggaggatgaagacgaacgtatcagcactaagacctacgcgaaccgg1020

gca1023