一种犬流感病毒H3亚型HA蛋白、其制备方法和应用

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及疫苗制备，更具体地说涉及一种犬流感病毒h3亚型ha蛋白、其制备方法及其在制备疫苗中的应用。

背景技术：

犬流感(canineinfluenza,ci)是由正粘病毒科甲型流感病毒属的犬流感病毒(canineinfluenzavirus,civ)引起的犬类动物接触性呼吸道传染病。civ主要分为h3n8和h3n2亚型。h3n8亚型是马流感病毒跨种间传播赛犬，感染宠物犬临床症状轻微或未见明显的临床症状。h3n2亚型civ感染犬后，犬表现出明显的发热、精神沉郁、咳嗽流鼻汁等明显临床症状，部分犬治疗不及时死亡，或治愈后易发生呼吸道疾病。h3n2亚型civ主要通过气溶胶传播，是我国目前主要流行亚型。

2004年，美国佛罗里达州的赛犬第一次暴发ci，研究发现该civ为h3n8亚型且起源于马流感病毒(equineinfluenzavirus,eiv)。2007年韩国暴发犬流感疫情，研究分离得到h3n2亚型civ，该亚型最早于2005年左右从禽类转移至中国犬类，极易在犬之间传播。2009-2010年，在浙江、江苏、北京、辽宁等地也相继分离到了禽源h3n2亚型civ，且与中国华南及韩国h3n2亚型civ高度同源。截至2015年，h3n2亚型在中国及韩国等亚洲地区广泛流行。流行趋势表明h3n2亚型犬流感已经成为包括中国在内的亚洲及美国地方性动物传染病。除此之外，h3n2亚型civ出现仅十多年，就已经出现多起与人流感病毒重配事件。2012及2014年韩国报道了从犬分离的新型civ毒株由h3n2亚型civ与h1n1亚型人流感病毒重配而来。

目前，预防civ感染最有效的策略是疫苗接种，美国、韩国等犬流感高发国家市面上已有针对该病的疫苗，但国内尚无有效疫苗。鉴于此，研发一种新型高效犬流感疫苗具有重要的公共卫生学意义。civ为单股负链rna病毒，包含8个rna片段，病毒的两个蛋白血凝素(hemagglutinin,ha)和神经氨酸酶(neuraminidas,na)是在宿主中诱导保护性免疫最重要抗原。ha可介导病毒与宿主细胞膜上的唾液酸受体结合，促进病毒基因组进入宿主，ha的糖基化在免疫反应中起关键作用。

亚单位疫苗可减少疫苗的副反应，对犬安全性高。但目前此类产品还不成熟，存在各种缺陷。因此，研制有效的犬流感亚单位疫苗，是犬流感病毒新型亚单位疫苗研究的主要方向。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种可以制备犬流感病毒h3亚型亚单位疫苗的ha蛋白、编码核苷酸、其制备方法及用该蛋白制备的疫苗。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种h3亚型犬流感病毒ha蛋白，所述的ha蛋白为：

(1)氨基酸序列为seqidno:2的蛋白；或

(2)在(1)的蛋白上通过删除、缺失、置换或增加一个或多个氨基酸，形成的具有(1)中蛋白功能的蛋白。

进一步优选的，ha蛋白含有gp67信号肽，所述的gp67信号肽的氨基酸序列为seqidno:4。编码该信号肽的核苷酸序列为seqidno:3。ha蛋白中含有6×his标签。所述的ha蛋白氨基端为gp67信号肽，羧基端为6×his标签。

改进后的另一种优选方案，一种h3亚型犬流感病毒ha蛋白，所述的ha蛋白为：

(1)氨基酸序列为seqidno:6的蛋白；或

(2)在(1)的蛋白上通过删除、缺失、置换或增加一个或多个氨基酸，形成的具有(1)中蛋白功能的蛋白。

一种基因，其核苷酸序列为seqidno:1，编码seqidno:2氨基酸序列。

一种基因，其核苷酸序列为seqidno:5，编码seqidno:6氨基酸序列。

本发明的另一个方面，本发明还提供ha蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述ha蛋白的基因；优选地，使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达所述ha蛋白；优选地，使用杆状病毒表达系统bac-to-bac构建表达所述ha蛋白的杆状病毒表达载体，然后在昆虫细胞中表达所述ha蛋白；优选地，昆虫细胞包括highfivetm细胞。

杆状病毒表达系统是一种成熟的真核表达系统，有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰能力。该系统多依托苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,acmnpv)为载体，在昆虫细胞表达外源蛋白，表达出的蛋白结构接近天然蛋白。本研究利用bac-to-bac杆状病毒表达系统表达h3n2亚型ha蛋白，并进行镍柱纯化，为基于杆状病毒的犬流感病毒ha蛋白亚单位疫苗奠定基础。

所述的h3亚型犬流感病毒ha蛋白可以在制备疫苗或诊断试剂中应用。

本发明的另一个方面是提供一种亚单位疫苗，所述的亚单位疫苗，是使用上述的h3亚型犬流感病毒ha蛋白作为抗原制备的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pfastbac1-civha质粒图谱。

图2为ha蛋白镍柱纯化过程。

m为26616marker，对照：是未接种细胞的上清，上清：接种病毒后的细胞上清，ft：流穿样品ft，20mm：指的是柱纯化过程用20mm咪唑洗涤除杂样品，1-8：洗脱1-8样品。

图3为ha蛋白sds-page鉴定结果。

m为26616marker，1为纯化后ha蛋白样品。

图4为ha蛋白westernblotting鉴定结果。

m为26616marker，1-3分别为非还原性ha蛋白、highfive细胞上清、还原性ha蛋白。

具体实施方式

本发明优化了分离的犬流感病毒h3亚型毒株的ha蛋白基因序列(seqidno:2是完整的ha序列，seqidno:6是截去1段跨膜区，加入信号肽优化而成的序列)，从而可以使用杆状病毒表达系统表达重组ha蛋白，与疫苗佐剂混合制备的基因工程亚单位疫苗，免疫犬安全性和效力均良好。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1：

ha基因的扩增及序列分析

将2019年在北京某宠物医院发生疑似犬流感，经实验室检测，初步诊断为犬流感病毒感染。对本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株毒株属于h3亚型犬流感病毒，攻毒实验结果表明筛选的该病毒可引起犬精神沉郁、咳嗽、流鼻涕、发烧，解剖发现肺部出现实变。

对筛选鉴定毒株的ha蛋白进行了测序，ha基因全长1701bp，编码566个氨基酸，其氨基酸序列为seqidno:2，编码基因的核苷酸序列为seqidno:1；将其与genbank中收录的ha基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，与近年来流行毒株的同源性在97.35％～98.94％之间，有多个位点发生了变异，第93位(v变i)，第128位(v变i)，第426位(r变k)。

在一些优选地实施方式中，将分离毒株的ha基因的抗原位点进行了分析，将其氨基端16aa删除，羧基端61aa删除，帮助蛋白更好地折叠为三级结构，将其抗原位点更好地暴露出来。同时将其密码子进行优化，能很好地表达出抗原位点。为了促进ha蛋白在宿主细胞中的分泌表达，优选地ha蛋白含有gp67信号肽，gp67信号肽能够引导外源蛋白进入内质网进行糖基化修饰，并促进外源蛋白分泌表达。gp67信号肽的氨基酸序列为seqidno:4，所述的基因编码gp67信号肽的核苷酸序列为seqidno:3。优化修饰后的氨基酸的序列为seqidno:6，优化后的基因的核苷酸序列为seqidno:5。以下实施例2～4中详细介绍了氨基酸序列为seqidno:6的ha蛋白的制备方法，实施例5中介绍了采用氨基酸序列为seqidno:6的ha蛋白作为抗原制备的疫苗及疫苗的效果验证。

实施例2：

表达ha基因重组杆粒的构建

2.1酶切反应

首先将序列进行密码子优化，通过杆状病毒表达系统bac-to-bac，利用pfastbac1

载体构建重组供体质粒pfastbac1-bcha，如图1。具体的实验步骤如下：

(1)pfastbac1供体质粒进行双酶切，于1.5mlep管中按下表进行加样、混匀，按下表配制：

(2)将步骤(1)中的1.5mlep管置于37℃恒温水浴锅中2h；

2.2双酶切产物胶回收

(1)将目的dna条带(seqidno:5)在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5ml离心管中，称重，记录数值；

(2)向步骤(1)中的1.5ml离心管中按100μl/100mg加入相应pcbuffer，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(3)柱平衡：向吸附柱cb2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μl平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(4)将步骤(2)所得溶液加至吸附柱cb2中，静置2min，10,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb2放入收集管中；

(5)向吸附柱中加入600μl漂洗液pwbuffer，静置3min，10,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中；

(6)重复步骤(5)；

(7)12,000rpm空吸附柱离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(8)将吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlelutionbuffer(65℃预热)，静置3min，12,000rpm离心2min；

(9)从离心机中取出步骤(8)中离心管，丢弃中间的吸附柱cb2，盖上离心管盖子，4℃保存保留离心管中的dna样品。

2.3连接反应

(1)于0.2ml管中按下表进行加样、混匀，按下表配制：

(2)将步骤(1)中0.2ml管置于37℃反应3h，直接用于转化实验。

2.4转化反应

(1)将pfastbac1-bcha质粒快速加入100μldh10bac^tme.coli感受态细胞中，并用指尖轻轻拨动混匀，冰浴30min。迅速取出样品管，置于42℃水浴45s，然后立即冰浴2-3min；

(2)取出样品管，37℃恒温箱恢复5-10min。(可选步骤：在超净工作台中，向样品管中加入900μl三抗lb液体培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm培养5h，梯度稀释10倍、50倍、100倍)；

(3)依据质粒抗性制备转化用lb抗性平板；

(4)涂板：在超净台中将200μl稀释的菌液滴入标记好的转化平板中，十字交叉将菌液均匀铺开；

(5)将步骤(4)平板在37℃生化恒温培养箱中正置至菌液吸收后，倒置过夜培养约36h。

2.5菌落pcr筛选阳性克隆

(1)挑取单菌落：将超净工作台的紫外灯照射20-30min，准备1.5mlep管。准备好分装到0.2mlep管中菌落pcr反应样品，在超净工作台里，随机挑选转化板上的白斑，用高温灭菌的镊子夹取灭菌枪头挑取单菌落加入到20μlddh2o中，混匀，吸取1μl置于配制好的pcr溶液中，吹打混匀，剩余加入500～700μl三抗培养基；

(2)菌落pcr：于1.5mlep管中按下表配制所需反应倍数预混液后分装到0.2mlep管中，按下表配制：

(3)pcr扩增程序如下：

(4)琼脂糖凝胶电泳鉴定：取pcr反应产物3-10μl进行琼脂糖凝胶电泳，用成像仪拍照电泳结果。

2.5omega无内毒素大量质粒提取试剂盒(型号d6228-01)大提质粒

(1)扩大培养：挑选验证正确的阳性克隆，加入30～40μl至100ml三抗lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床，220rpm，培养16h；

(2)检测菌液od值(在0.4-0.6之间即可)，符合对数期数值，将100ml菌液4℃、5000×g离心10min，去上清(彻底除尽)；

(3)加入2ml溶液1(确保加入rnasea)(4℃冰箱)，吹打混匀并涡旋振荡至完全悬浮；补加8ml溶液1；

(4)加入10ml溶液2，温和颠倒10次，获得澄清裂解液；

(5)加入5ml预冷的n3，温和颠倒10次，该步需室温孵育2min并不断颠倒混匀，出现白色沉淀，4℃、5000×g离心10min；

(6)取出lysateclearancefiltersyrine活塞，将滤器垂直置于新的50ml离心管上，拔掉推送塞，小心将步骤(5)处理后的裂解液转移到活塞中；

(7)etr去内毒素：测量滤液体积，加入0.1体积的etr(蓝色)到收集液中(溶液变浑浊)，轻轻颠倒混匀10次，冰浴放置10min(溶液变澄清)；

(8)42℃孵育5min，溶液变浑浊。25℃、5000×g离心30min，etr分层于离心管底部；

(9)室温静置10min，上层溶液变澄清；将上层水相小心转移至新的50ml白色圆底离心管中，这时要计算好转移的体积，加入2/3倍体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒旋转混匀几次，冰浴30min以上，4℃、12000rpm离心30min；

(10)弃上清，加入10ml75％乙醇(现用现配)，上下温和颠倒洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心10min，重复一次；

(11)弃上清完全，可倒扣于干净滤纸上，室温大风干燥30min，用200μlelutionbuffer(65℃预热)溶解沉淀，获得bcha质粒。

(12)将提取的质粒dna进行pcr鉴定。

实施例3：

sf9细胞的转染

(1)打开紫外照明0.5h，将sf900iiisfm培养基放入28℃水浴锅温浴；

(2)将20μg实施例2提取好的bcha质粒加入到100μlgrace’sinsectcellculture培养基中，用手弹混匀(质粒较大，吹打容易使其断裂)；

(3)颠倒混匀cellfectin转染试剂，取24μl至300μlgrace’sinsectcell培养基中，制成cellfectin转染混合物，手弹混匀，室温孵育5min；

(4)取108μlcellfectin转染混合物加至(2)bcha质粒溶液中，制成dna-转染混合物，剩余108μl作阴性对照，手弹混匀，室温孵育0.5h；

(5)当sf9细胞密度达到2×10⁶个/ml，吸取2ml细胞加入6孔板中，28℃培养0.5h，再吸出2ml细胞上清，用2mlgrace’sinsectcell培养基清洗，画十字混匀，吸出grace’sinsectcell培养基，再加入1mlgrace’sinsectcell培养基；

(6)在dna-转染混合物中补加800μlgrace’sinsectcell培养基，手弹混匀，总共1ml，加入至6孔板中，一滴一滴地滴加且均匀滴在细胞四周，画十字混匀，28℃孵育5h；

(7)弃grace’sinsectcell培养基，每孔加入2.5mlsf900iiisfm培养基；

(8)收p1代毒：对转染72h后细胞拍照，将每孔2ml细胞培养基(阴性对照、20μg质粒)分别吸取到2管1.5ml离心管中，共4管，500×g离心5min，吸取上清到新的1.5ml离心管中，避光保存为p1代毒，并进行sds-page和westernblotting检测。结果发现ha蛋白在细胞上清中表达。

实施例4：

蛋白表达与纯化

4.1重组ha蛋白在sf9细胞内的表达与鉴定

(1)将实施例3收获的p1代毒接种至10mlsf9细胞，贴壁培养72h后，500×g离心5min，吸取上清到新的15ml离心管中，避光保存为p2代毒，并进行蛋白检测；

(2)将步骤(1)收获的p2代毒接种至30mlsf9细胞，悬浮培养72h后，500×g离心5min，吸取上清到新的50ml离心管中，避光保存为p3代毒，并进行蛋白检测；

(3)将步骤(2)收获的p3代毒接种至330mlhighfive细胞，悬浮培养48h后，8000×g离心30min，吸取上清到新的250ml离心瓶中，避光保存为ha蛋白液，并检测蛋白表达情况。

4.2重组ha蛋白的层析纯化

(1)将4.1的ha蛋白液，用ge的nisepharoseexcel介质进行亲和层析；

(2)用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质；

(3)用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗介质；

(4)上样，用20倍柱体积的含20mm咪唑洗涤缓冲液清洗介质；

(5)用5倍柱体积的含500mm咪唑洗脱缓冲液将蛋白洗脱，即为纯化后的ha蛋白液，纯化过程用sds-page进行鉴定，结果如图2，鉴定结果表明ha蛋白大部分能挂柱，洗脱过程大部分为目的蛋白；

(6)透析换液：将(5)纯化的ha蛋白加至10kd透析袋中，使用2l透析buffer透析，每2h更换一次透析buffer，共3次，用0.22μm滤器过滤除菌，-80℃保存。

4.3sds-page和westernblot试验

4.3.1sds-page：将5μg4.2纯化的ha蛋白液用sds-page进行纯测定，根据泳道内条带比例计算ha蛋白纯度。鉴定结果表明：纯化产品经sds-page电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符，ha蛋白纯度为89％。ha蛋白含量0.648mg/ml。结果见图3。

4.3.2将sds-page，采用湿转法200ma转印90min，将目的蛋白条带转移至nc膜，转印膜用封闭液封闭过夜，pbst洗涤3次，1:100稀释的犬流感病毒阳性血清室温作用2h，pbst洗3次，用1:1000稀释的hrp标记的鼠抗犬酶标抗体室温作用1h，pbst洗涤3次，底物溶液作用2min，在chemidoc进行显色。结果在highfive细胞表达的ha蛋白条带很亮，说明表达的抗原蛋白抗原性好。结果见图4。

实施例5：

疫苗的制备与检测

5.1疫苗的制备

(1)使用无菌pbs将上述步骤4.2纯化的ha蛋白(seqidno:6，其前38个氨基酸为信号肽即seqidno:4)进行适当比例稀释，使水相中蛋白含量不低于100μg/ml，用0.5％鸡红血球测定ha蛋白的血凝价，结果为1:128；

(2)将步骤(1)稀释的蛋白液与montanidegel01佐剂按合适比例(8％)混合，以200r/min继续搅拌10min，充分混匀，得到疫苗。

5.2疫苗的安全性和效力检验

5.2.1单剂量重复：取2只比格犬，每只颈部皮下注射亚单位疫苗1ml，连续观察14日，记录试验犬采食、饮水及临床情况。结果表明，制备的疫苗没有出现局部和全身不良反应。

5.2.2效力检验：取6～36月龄比格犬5只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗0.5ml，免疫28日后以相同剂量进行二次免疫，同时设对照5只；二免后21日，采血分离血清，进行hi抗体检测。结果如下表1，结果表明对照犬抗体均为阴性，亚单位免疫组抗体均为阳性。同时所有犬通过鼻内接种h3亚型犬流感病毒(约含1×10⁷eid50)，14日后剖检观察肺部病变；结果对照犬5只均出现流鼻涕、咳嗽等临床症状，肺脏均出现严重病变；免疫组试验犬临床症状均正常，肺脏均未出现实变。

表1hb株攻毒保护结果

注：实变百分比计算方法为眼观实变面积与整个肺脏之比。