Rapv2蛋白相关的抗原表位肽及其应用

本发明属于生物学技术领域，具体涉及rapv2蛋白相关的抗原表位肽及其应用。

背景技术：

食物过敏是部分易感人群在摄入某些特定食物后所产生的一种不良应激免疫反应，在临床上表现为皮肤、口腔及消化道、呼吸道、心血管系统和神经系统等组织和器官的不良症状，严重的食物过敏可导致休克甚至死亡。食物中的蛋白质是引发过敏的主要过敏原成分，而过敏原的抗原表位是直接参与食物过敏免疫应答反应的关键基团，也是决定过敏原蛋白免疫原性及特异性的物质基础。因此，过敏原抗原表位的鉴定有助于揭示抗原与抗体结合反应的本质，对过敏性疾病的诊断及预后判定，疫苗的研发以及免疫治疗等具有重要意义。

软体动物是一个庞大而多样的群体，分布在咸水、淡水和陆地上约有10万种，其中有些软体动物是人们的重要食物来源，同时也是引发食物过敏反应的一大类食物。本团队从海螺中分离出一种名为rapv2的过敏原，根据氨基酸组成及分子量等测试，确定rapv2为副肌球蛋白。副肌球蛋白(pm)是存在于软体动物中的一种重要过敏原，同时它也是一种交叉反应性过敏原并具有良好的耐热性及消化稳定性。但目前，国内外对于该食物过敏原蛋白的特异性抗原表位未见报道。

目前对软体动物过敏原的研究还不够深入，副肌球蛋白是一种能够使机体发生过敏性反应的致敏蛋白，也是软体海产品中重要的过敏原，其摄入后对过敏患者的身心健康产生严重危害。抗原表位信息的缺失将导致软体过敏患者的诊断及治疗存在较大难度，因此对于软体动物中新型过敏原及抗原表位的研究十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供rapv2蛋白相关的抗原表位肽，以及所述抗原表位肽的应用，其技术方案如下：

本发明提供一种抗原表位肽，其氨基酸序列选自seqidno:1～7中的至少一条。

上述所有抗原表位肽，来自于rapv2蛋白，rapv2蛋白的序列如seqidno:8所示。

rapv2蛋白为副肌球蛋白，是一种新型的过敏原蛋白，源自于海螺(rapanavenosa)，其氨基酸序列可由ncbi的蛋白质数据库获得，登录号为gb:mn784956，该副肌球蛋白的一级结构含有859个氨基酸。

在上述方案的基础上，本发明还提供一种抗原表位肽，其氨基酸序列与seqidno:1～7所示的任一氨基酸序列存在≥80％的同源性，且与seqidno:1～7所示的任一氨基酸序列表现出相同的免疫原性和相同的抗原性。优选地，上述同源性≥90％；进一步地，上述同源性≥95％；在一个最佳的技术方案中，上述同源性≥97％。

在上述方案的基础上，本发明还提供一种抗原表位肽，其氨基酸序列是在seqidno:1～7任一氨基酸序列的基础上经过氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，且与seqidno:1～7所示的任一氨基酸序列表现出相同的免疫原性和相同的抗原性。

在上述方案的基础上，本发明还提供了编码上述抗原表位肽的核酸，包含所述核酸的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。

在上述方案的基础上，本发明还提供了上述抗原表位肽的相关应用，包括但不限于如下情形：

(1)制备具有低致敏性的副肌球蛋白；

(2)过敏患者血清中rapv2蛋白ige抗体的检测；

(3)制备一种用于检测食品或其它样品中rapv2蛋白的试剂盒；

(4)制备治疗性抗体、药物组合物或疫苗。

在上述方案的基础上，本发明还提供了由上述抗原表位肽制备的具有低致敏性的副肌球蛋白，用于检测rapv2蛋白的试剂盒，以及治疗性的抗体、药物组合物和疫苗。

本发明所提供的一种试剂盒，包括上述抗原表位肽。

本发明所提供的一种抗体，能够特异性结合上述抗原表位肽。

在上述方案的基础上，本发明提供了一种检测rapv2蛋白的方法，如下：利用上述抗原表位肽偶连惰性蛋白免疫动物，使动物产生与该抗原表位肽结合的抗体，提取纯化抗体，然后用该抗体去检测rapv2蛋白。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的抗原表位肽段可用于检测样品中是否存在副肌球蛋白抗原的抗体或用于检测过敏患者是否对副肌球蛋白抗原过敏。

2、本发明提供了全新的食物过敏原副肌球蛋白rapv2特异性抗原表位，可以用于检测软体海产品过敏患者的诊断，对疫苗设计、单克隆抗体以及抗体检测试剂盒的研发等应用具有重要意义。

附图说明

图1为利用生物信息学方法预测的rapv2蛋白潜在表位结果图；

图2为抗原表位肽与海螺过敏患者血清的ige反应结果图；

图3为抗原表位肽对ku812嗜碱性粒细胞脱颗粒影响结果图(a，β-己糖苷酶释放率；b，类胰蛋白酶含量；c，组胺含量；d，il4含量；e，il13含量)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明提供了氨基酸序列为seqidno:1～7所示的7种抗原表位肽；具体如表1所示：

表1

上述7种抗原表位肽，均来自于rapv2蛋白。rapv2蛋白为副肌球蛋白，是一种新型的过敏原蛋白，源自于海螺(rapanavenosa)，其氨基酸序列可由ncbi的蛋白质数据库获得，登录号为gb:mn784956，该副肌球蛋白的一级结构含有859个氨基酸。

rapv2蛋白的序列如seqidno:8所示：

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seqidno:1～7所示抗原表位肽的筛选和鉴定过程

(1)利用生物信息学方法预测副肌球蛋白抗原表位

根据dnastar和antheprot软件对rapv2蛋白的亲疏水性、表面可及性、可塑性及抗原指数等性质的分析，综合得出表位预测结果，预测结果如图1所示。然后再结合3种生物信息学在线服务器(bepipred、abcpred及immunomedicinegrouptoolsserver)的预测结果，进行预测表位的最终筛选。上述五种生物信息学方法分别预测得到的抗原表位位点，如表2所示。

表2

综合分析上述五种生物信息学预测方法得到的潜在抗原表位，共12条表位，预测表位的氨基酸长度在11-18之间。将预测的12个抗原表位进行固相合成并按照氨基酸开始顺序分别命名为p1到p12。利用上述生物信息学方法最终预测的rapv2蛋白抗原表位位点，如表3所示。

表3

注：表3中pm指的是rapv2蛋白。

(2)免疫斑点印迹阵列技术筛选rapv2蛋白抗原表位

采用fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)固相方法合成p1～p12所述氨基酸序列，同时采用高效液相色谱(hplc)和电喷雾离子化质谱(esi-ms)方法验证合成多肽的纯度(>98％)和分子量，以符合实验要求。

取6个海螺过敏患者血清样品(来自青岛大学附属医院，所有6名受试者在食入海螺后表现至少两种或更多种症状的临床病史，包括急性荨麻疹，过敏性鼻炎，过敏性休克和哮喘等)，编号从s1至s6，作为试验组；取2个没有任何贝类过敏史的正常志愿者的血清样品(来自青岛大学附属医院变态反应科室)作为阴性对照组；各血清样品以等分试样储存在-80℃直至使用。

将每个试验组血清、每个对照组血清与每个预测抗原表位(编号从p1至p12)进行免疫斑点印迹阵列检测。

免疫斑点印迹试验步骤如下：

1)硝酸纤维素膜处理：将硝酸纤维素膜(nc膜)浸于超纯水中，使nc膜充分湿润。

2)点样：用cbs溶液将rapv2蛋白溶解至1.5mg/ml，制备点样液。从超纯水中取出nc膜，将nc膜上多余水分晾干后进行点样。每个阵列点加2μl过敏原点样液，于室温下自然晾干。

3)洗膜：用pbst缓冲液洗nc膜三次，每次5min，去掉点样液中未与nc膜结合的过敏原蛋白。

4)膜封闭：将nc膜在膜反应封闭液中室温下封闭2h后，用pbst缓冲液洗膜三次。

5)一抗孵育：先将海螺过敏患者血清用1％脱脂乳以1:5(v/v)进行稀释，而后将合成的预测抗原表位肽与稀释血清混合，孵育1h后，点样于nc膜。于室温孵育4h后，用pbst洗膜三次。

6)二抗孵育：按照hrp-conjugatedgoatanti-humanigesecondaryantibody抗体说明书，用1％脱脂乳按1:10000(v/v)稀释后，滴加到nc膜上，室温孵育1h后用pbst缓冲液洗膜三次。

7)ecl显影：将ecl试剂盒中a液与b液等体积混合后，将nc膜浸没于显色液中反应1min，而后取出nc膜，用凝胶成像仪进行曝光处理并采集图像。

根据ayuso等的编码分类，将ige免疫印迹反应结果根据反应强度分为四个等级进行评分：强ige反应强度(黑色阵列，3分，对应白色dot-blot反应)、中等ige反应强度(黑灰色阵列，2分，对应浅灰色dot-blot反应)、弱ige反应强度(浅灰色阵列，1分，对应黑灰色dot-blot反应)、无ige反应(白色阵列，0分，对应黑色dot-blot反应)。抗原表位肽与抗原蛋白竞争血清ige越强的位点，呈现越弱的dot-blot免疫阵列反应信号，阵列的ige反应强度越强。另外，根据ayuso等的标准，可被半数或以上过敏血清识别或免疫阵列强度评分高于平均得分与评分误差之和的多肽可被认定为抗原表位多肽，用“+”表示。

检测结果如图2所示，12个预测抗原表位与健康对照血清无ige反应，但与海螺过敏患者血清有不同程度的ige反应。根据ige反应性的频率和强度，确定了七个主要的预测ige结合表位：p1：rapv2(10-27)，p2：rapv2(32-47)，p3：rapv2(64-81)，p4：rapv2(106-116)，p7：rapv2(273-289)，p8：rapv2(361-374)和p10：rapv2(491-502)，每个预测表位的ige识别强度的得分分别为10、8、8、6、8、7和12。因此这7个预测抗原表位可被筛选为rapv2蛋白的抗原表位。

(3)抗原表位肽致敏ku812细胞脱颗粒实验

1)细胞培养

ku812细胞在包含10％胎牛血清(fbs)，1％青霉素和链霉素的完全rpmi1640培养基中培养，并置于37℃的5％co2湿润培养箱中。

2)细胞刺激

用含人骨髓瘤ige的1640培养基(0.5μg/ml)连续培养1周，以刺激ku812细胞表面fcεri受体表达，培养期间每两天更换一次细胞培养液，共更换3～4次。

3)细胞致敏与激发

最后一次更换含人骨髓瘤ige的1640新鲜培养基(0.5μg/ml)后，次日首先消化细胞，将5ml细胞悬浮液在400×g离心5分钟，hank’s(hbss)平衡盐溶液清洗1次。将细胞沉淀悬浮于5ml1640完全培养基中，并用移液器以50μl/孔接种到所需量的96孔板中。采用1640基础培养基1:5稀释人血清并于每孔加入50μl血清稀释液置于co2培养箱中孵育过夜。接下来在室温下用纯化的副肌球蛋白和预测的表位刺激细胞1小时。

4)ku812细胞的五种生物标志物含量检测

使用商品化的elisa试剂盒，将ige免疫的ku812细胞与收集的上清液进行离心，测定上清液中类胰蛋白酶、组胺、il-4和il-13细胞因子的释放，并通过测定上清液中β-己糖苷酶含量来观察细胞脱颗粒情况。

结果如图3所示，分析了所有潜在表位在ku812细胞中诱导应答的能力。与阴性对照相比，具有显着差异(p<0.01)的预测表位被视为潜在的过敏原表位。β-己糖苷酶释放率(图3a)，组胺含量(图3b)和类胰蛋白酶含量(图3c)的总体释放趋势相对一致。p6，p9和p11表位肽与阴性对照组之间无显着差异(p>0.05)，而rapv2蛋白和预测表位(包括p1，p2，p3，p4，p7，p8和p10)在嗜碱性粒细胞上具有明显的脱粒作用(p<0.01)。此外，il-4(图3d)和il-13(图3e)细胞因子含量的结果相似，预测的表位p1，p2，p4，p7，p8和p10显示出明显的脱粒效果(p<0.01)。综合五个生物标记物结果，rapv2蛋白的p1，p2，p3，p4，p7，p8和p10有明显脱颗粒效果，这表明它们是过敏原性表位区域。该试验结果也与斑点印迹抑制试验一致。

基于以上两种方法，进一步证明本发明的7种肽(p1，p2，p3，p4，p7，p8和p10)为主要的rapv2的特异性ige结合序列。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110>中国海洋大学

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