一种对胃癌具有治疗作用的过表达RNU12载体的制作方法

一种对胃癌具有治疗作用的过表达rnu12载体
技术领域
1.本发明涉及医药科技技术领域，具体为一种对胃癌具有治疗作用的过表达rnu12载体。


背景技术：

2.胃癌是胃粘膜上皮细胞最为常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家尤其是在中国，胃癌的发病率和死亡率均居世界前列，尤其是山西更是重中之重。尽管外科手术仍被认为是胃癌治疗的最主要手段，但胃癌患者5年生存率仍不足20％。因此，除了传统的治疗方法，探索胃癌发生发展的潜在分子机制并寻找有效的靶向药物已成为胃癌治疗的关键问题。越来越多的研究发现，长链非编码rna(lncrnas)的异常表达有可能引起细胞生物学行为发生变化，导致肿瘤的发生。目前这一类小分子基因的功能以及与此相关的基因调控已成为肿瘤研究的重点。因此，通过对胃癌一种lncrnas(rnu12)的深入研究，为胃癌的早诊早治及预后恢复提供重要的理论意义。


技术实现要素：

3.本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
4.鉴于现有技术中存在的问题，提出了本发明。
5.本文发现了rnu12在胃癌中表达下调，具有抑制胃癌细胞增殖、迁移和促进凋亡的作用，并且发现了一种pcmv6-r，可化学合成，具有过表达rnu12，对胃癌具有潜在的治疗作用。
6.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
7.一种对胃癌具有治疗作用的过表达rnu12载体；
8.命名为pcmv6-r：
9.正义:5
’‑
cacgcctaaaaagtagactgac-3’10.反义:5
’‑
taacggagaaaacaacgaaaaaa-3’。
11.作为本发明所述的一种对胃癌具有治疗作用的过表达rnu12载体的一种优选方案，其中：rnu12抑制胃癌细胞的增殖
12.体外实验：在两个胃癌细胞系hgc-27和mgc-803中，构建了一个包含rnu12-orf的脂质载体(pcmv6-r)，分别转染到两个细胞中，通过cck8(cellcountingkit-8)实验，在0、12、24、48、72和96h后，与空载脂质体(pcmv6-nc)进行比较，发现过表达rnu12能显著抑制hgc-27和mgc-803细胞增殖；
13.体内实验：用携带rnu12-orf的慢病毒感染hgc-27和mgc-803细胞，在免疫缺陷裸鼠后侧皮下注射(3
×
106细胞/只)，在7周后发现注射过表达rnu12(pcmv6-r)的裸鼠肿瘤体
积明显小于对照组(pcmv6-nc)的裸鼠。
14.作为本发明所述的一种对胃癌具有治疗作用的过表达rnu12载体的一种优选方案，其中：rnu12抑制胃癌细胞的侵袭
15.体外实验：在两个胃癌细胞系hgc-27和mgc-803中，构建了一个包含rnu12-orf的过表达脂质载体(pcmv6)，分别转染到两个细胞中进行侵袭实验，在transwell滤膜上加入40μlmatrigel(0.5g/l)；收集转染空载体pcmv6-nc以及pcmv6-r的hgc-27和mgc-803细胞，离心重悬细胞，计数调整为2
×
105cell/ml，在transwell小室中加入400μl细胞悬液，下室沿侧壁加入600μl含10％胎牛血清的dmem培养基，37℃、5％co2恒温箱中培养24h，取出小室，吸干上室固定液，甲醇固定后移到预先加入800μl的结晶紫染液的孔中染色；显微镜下拍照并计数侵袭细胞数，发现过表达rnu12能显著抑制hgc-27和mgc-803细胞侵袭；
16.体内实验：用携带rnu12-orf的慢病毒感染hgc-27和mgc-803细胞，通过免疫缺陷裸鼠尾静脉注射到体内，5周后处死裸鼠发现，注射过表达rnu12(pcmv6-r)的裸鼠肝脏肿瘤细胞转移数量明显低于注射对照组(pcmv6-nc)的裸鼠。
17.作为本发明所述的一种对胃癌具有治疗作用的过表达rnu12载体的一种优选方案，其中：rnu12促进胃癌细胞的凋亡
18.在hgc-27和mgc-803细胞中，通过流式细胞术分析表明，与空载脂质体(pcmv6-nc)相比，过表达rnu12(pcmv6-r)能显著促进hgc-27和mgc-803细胞早期和晚期凋亡；而rnu12在mapk通路中能介导许多分子mrna稳定性与肿瘤的发生发展相关。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和促进胃癌细胞的凋亡，具有促进rnu12表达，对胃癌具有潜在的治疗作用。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
21.图1为本发明图1为rnu12基因在大多数胃癌组织中表达下调。通过芯片数据发现，rnu12在胃癌患者表达中存在明显下调(图1a)。在100例胃癌组织和癌旁正常组织中验证了rnu12的表达变化，以及转移和非转移胃癌、不同进展期胃癌的表达变化，发现，与癌旁正常组织相比，rnu12在胃癌组织中表达明显下调(图1b)；在转移性胃癌中rnu12表达低于非转移性胃癌(图1c)；随着胃癌恶性程度的发展，rnu12表达逐渐下降(图1d)。此外，rnu12低表达患者有明显的恶化和较低的生存率趋向。说明rnu12可能参与了胃癌的发生发展。
22.图2为本发明rnu12对于胃癌的功能具有调控作用。在胃癌细胞中过表达rnu12，发现升高rnu12表达能明显抑制胃癌细胞的迁移(图2a)、侵袭(图2b)和增殖(图2c)，促进胃癌细胞的凋亡(图2d)，引起细胞形态学上的改变。
23.图3为本发明皮下成瘤试验中，rnu12(pcmv6-r)在体内能抑制肿瘤细胞的增殖能力。
24.图4为本发明尾静脉注射实验中，rnu12(pcmv6-r)在体内能抑制肿瘤细胞的迁移能力。
具体实施方式
25.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
26.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
27.其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施方式时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
29.实施例1
30.本发明的目的在于为胃癌的早诊早治及预后恢复提供理论依据。
31.本文发现了rnu12在胃癌中表达下调，具有抑制胃癌细胞增殖、迁移和促进凋亡的作用，并且发现了一种pcmv6-r，可化学合成，具有过表达rnu12，对胃癌具有潜在的治疗作用。
32.过表达rnu12，能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和促进胃癌细胞的凋亡
33.1、细胞培养
34.1.1、培养条件：实验中使用的胃癌hgc-27和mgc-803细胞为贴壁细胞，分别培养于1640和dmem完全培养基中[在50ml离心管中加45ml 1640或dmem培养基，加5ml胎牛血清(fcs)，加50μg链霉素，50u青霉素]。
[0035]
1.2、培养环境：37℃，5％co2及饱和湿度。
[0036]
2.细胞rna提取
[0037]
采用传统trizol法提取胃癌细胞rna，用紫外分光光度仪测定rna纯度和浓度。
[0038]
3、rt-pcr检测rnu12基因表达
[0039]
使用oligo(dt18)，m-mlv逆转录酶合成cdna第一链，并pcr扩增，以β-actin为相对定量的内参，扩增反应设3个复孔。
[0040]
3.1、m-mlv逆转录cdna第一链：在无rnase的灭菌离心管中加入以下成分：
[0041]
表4.1逆转录混合物
[0042]
[0043]
3.2、将上述溶液混匀后，置于65℃水浴温育5min后，立即置于冰上冷却，加入以下成份：
[0044]
表4.2逆转录混合物
[0045][0046]
3.3、将上述溶液混匀，轻离心后置于37℃水浴5min，加入1.0μlm-mlv(200u/μl)。
[0047]
3.4、混匀溶液后，37℃水浴反应60min，移至70℃水浴15min终止反应，-20℃冻存备用。
[0048]
3.5、以hgc-27和mgc-803细胞的cdna为模板，进行pcr扩增反应，pcr反应体系和条件如下：
[0049]
表4.3 pcr反应体系
[0050][0051]
表4.4 pcr反应条件
[0052]
[0053][0054]
4、细胞转染
[0055]
4.1、转染前一天，以合适密度传代细胞，第二天在细胞处于对数生长期，细胞汇合度达到50％～70％时进行转染；
[0056]
4.2、用无血清培养基洗涤细胞一次，然后以1
×
106～2
×
106cells/孔的密度将细胞重悬于不含抗生素的完全培养基中，1ml/孔，转入6孔板中培养；
[0057]
4.3、将5μl浓度为20nm的pcmv6-r以及阴性对照pcmv6-nc，加入200μl无血清培养基中混匀，脂质体neofect 3～4μl也加入200μl无血清培养基中，室温静置5min；
[0058]
4.4、将pcmv6-r和质脂质体混合后，室温静置20min；
[0059]
4.5、将混合物直接加入6孔板hgc-27和mgc-803细胞中，并轻轻摇晃使其混匀，于37℃，5％co2培养箱中培养4～6h后，可将培养基换为加抗生素的完全培养基，继续培养24～48h；
[0060]
4.6、转染24h后可以检测rna水平的变化，转染48h后检测蛋白的变化。
[0061]
5、细胞增殖实验
[0062]
分别使用空载体pcmv6-nc及过表达rnu12(pcmv6-r)转染hgc-27和mgc-803细胞，转染6h后，收集细胞，离心后弃去含转染试剂的培养基，重悬于新鲜的完全培养基，按照1
×
103cells/孔种植于96孔板，每组3～6个复孔，待细胞贴壁后测定细胞活性(0h)，然后每隔24h后检测一次细胞活性。
[0063]
细胞活性的检测是利用cck-8试剂盒，cck-8试剂盒里的wst-8试剂与线粒体内的脱氢酶还原生成具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，细胞活性越强，颜色越深。在检测前每孔加入10μl cck-8，37℃孵育3h后，利用酶标仪测定450nm-630nm吸光度值。
[0064]
6、细胞侵袭实验
[0065]
6.1、matrigel胶(5mg/ml)在4℃过夜融化；
[0066]
6.2、用4℃预冷的无血清培养基稀释matrigel至1mg/ml，冰上操作；
[0067]
6.3、在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的matrigel，37℃温育4～5h使其干成胶状；
[0068]
6.4、mgc-803细胞在转染24h后，收集细胞，用pbs洗涤细胞后用无血清培养基再洗涤一次，用无血清的培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2
×
105cells/ml；
[0069]
6.5、在24孔板底部加入600～800μl dmem完全培养基，上室加入100～150μl细胞
悬液，继续在孵箱培养24h；
[0070]
6.6、用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定细胞30min；
[0071]
6.7、取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl giemsa染液的孔中，室温染色15～30min；
[0072]
6.8、轻轻用清水浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉签小心擦去上室底部膜表面上的细胞；
[0073]
6.9、用镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片，显微镜下观察十个不同的视野计数并统计。
[0074]
7、细胞凋亡实验
[0075]
7.1、细胞在转染6～12h后换1％～3％血清的1640或dnem培养基在37℃，5％co2培养箱培养；
[0076]
7.2、24h后换10％血清的1640或dmem完全培养基并实时观测；
[0077]
7.3、将对照组和实验组分别用250μl pbs悬浮，每组分别分成100μl对照组双染(annexin/7-aad)，100μl实验组双染(annexin/7-aad)，100μl对照组+实验组未染、100μl单染(annexin)、100μl单染(7-aad)；
[0078]
7.4、流式细胞检测。
[0079]
8、免疫印迹(western blot)检测rnu12表达
[0080]
8.1、蛋白的提取及定量
[0081]
8.1.1、收集样本细胞，l
×
pbs洗涤两遍，900rpm离心5min去上清，加入适量蛋白裂解液(约80μl，用之前加蛋白酶抑制剂)，吹散混匀细胞，冰上裂解30min；
[0082]
8.1.2、4℃，13,000rpm离心15min，取上清液分装或-80℃冻存备用，整个过程要在冰上进行；
[0083]
8.1.3、bca法测定样品蛋白浓度，bsa稀释成0.5mg/ml的蛋白标准品(20μl bsa加60μl pbs)；
[0084]
8.1.4、在96孔板中加入20μl不同浓度的蛋白标准品和待测样品，以及空白对照组，同时加入稀释10倍的样品20μl(2μl样品加18μl pbs)；
[0085]
8.1.5、每孔各加200μl工作液(bca reagent a:bca reagent b按50:1混合)，于37℃放置30min；
[0086]
8.1.6、酶标仪上测定样品570nm下的吸光度值；
[0087]
8.1.7、根据蛋白标准品浓度和吸光度，绘制蛋白浓度标准曲线，并计算样品蛋白浓度，加水及5
×
loading buffer将蛋白调至统一浓度；
[0088]
8.1.8、样品置于水浴锅，沸水煮沸5～10min，于-80℃冰箱保存。
[0089]
8.2、蛋白的sds-page电泳
[0090]
8.2.1、在蛋白样品中加入5
×
loading buffer混和均匀，沸水煮约10min。4℃，10,000g离心10min，将上清移至新的离心管中；
[0091]
8.2.2、配制好合适浓度的分离胶和浓缩胶，蛋白样品上样进行电泳分离，80v恒定电压电泳，当样品从浓缩胶进入分离胶时，调节电压至120v。当溴酚蓝离底部0.5cm时结束电泳，取下凝胶，常规考马斯亮蓝r-250染色，或进行下一步印迹。
[0092]
8.3、蛋白的电转移
[0093]
8.3.1、pvdf膜先用甲醇浸湿1min作用，再将转膜所用的滤纸、海绵和pvdf膜用电转缓冲液浸湿，pvdf膜平衡至少10min；
[0094]
8.3.2、转膜时物品放置顺序是：电转仪塑料支架、海绵、三层滤纸、凝胶、pvdf膜、三层滤纸、海绵、电转仪塑料支架(每层之间不要有气泡)，将塑料支架夹紧；
[0095]
8.3.3、将上述系统放入电转槽中，pvdf膜朝向正极，凝胶朝向负极。200ma电流，转膜1～2h；
[0096]
8.3.4、电转完毕后，依次取走各层，取出pvdf膜，标记好上样顺序。
[0097]
8.4、杂交
[0098]
8.4.1、电转完毕的pvdf膜在1
×
tbst[20mm tris(ph＝7.6～8.0)，100mm nacl，0.1％tween-20]溶液中洗涤5min；
[0099]
8.4.2、将pvdf膜放于含有5％脱脂奶粉的1
×
tbst中室温封闭2～3h；
[0100]
8.4.3、再将膜放于封闭液稀释的一抗溶液中，4℃孵育过夜；
[0101]
8.4.4、1
×
tbst洗膜3次，每次10min；
[0102]
8.4.5、再将膜放于封闭液稀释的二抗溶液中，室温孵育1～2h；
[0103]
8.4.6、1
×
tbst洗膜3次，每次10min；
[0104]
8.4.7、吸去膜上多余水分，蛋白面向上放在保鲜膜上。ecl反应液均匀滴加于pvdf膜表面避光反应1min后，小心将膜包裹；在暗室中用x光片进行显影。
[0105]
8.5、二次免疫印迹
[0106]
反复标记和再标记：每张膜可以同时标记很多抗体，通常两个目的蛋白相差在5kd以上时，使用不同的二抗；小于5kd时，需要经过抗体洗脱液的处理后，再标记。
[0107]
8.5.1、直接杂交另一抗体
[0108]
pvdf膜用1
×
tbst洗膜2次，每次10min。5％脱脂奶粉-tbst室温封闭1h。按以上杂交步骤进行杂交。
[0109]
8.5.2、洗掉抗体后杂交另一抗体
[0110]
显影完毕后pvdf膜用1
×
tbst洗膜1次，抗体洗脱液洗膜10min，然后用1
×
tbst洗膜3次，每次5min，用5％脱脂奶粉封闭半小时以上，加入一抗标记。其它步骤同上述免疫印迹。
[0111]
9、统计学分析
[0112]
采用spss16.0统计软件。计量资料以均数
±
标准差(x
±
s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)，两因素间的差异比较及相关性分析采用x2检验，p＜0.05为具有统计学意义，不符合正态分布资料比较采用两样本秩和检验比较。
[0113]
10、结果显示
[0114]
rnu12基因在大多数胃癌细胞和组织中表达下调，在下调表达的胃癌患者中，总生存时间及复发转移生存期均较rnu12高表达胃癌患者短。rnu12高表达的细胞中，细胞的增殖能力和侵袭能力明显抑制，而凋亡能力显著提高。皮下成瘤和尾静脉注射都说明rnu12在体内能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。
[0115]
上述结果表明，rnu12可以成为胃癌的肿瘤标记物，并且能抑制胃癌细胞的增殖和迁移，促进胃癌细胞的凋亡。
[0116]
pcmv6-r的设计：针对rnu12基因序列，设计pcmv6-r，由天一辉远公司合成。
[0117]
正义:5
’‑
cacgcctaaaaagtagactgac-3’[0118]
反义:5
’‑
taacggagaaaacaacgaaaaaa-3’。
[0119]
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。