一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒以及使用方法与流程

1.本发明涉及医疗领域，特别是一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒以及使用方法。


背景技术：

2.近年来，分子生物学飞速发展，随着pcr与pr-pcr在病毒检测的应用越来越广泛，核酸提取工作量飞速增加，传统的提取核酸方法步骤繁琐，需要使用苯酚或氯仿等方法抽提，时间长且毒性大，且不支持自动化提取，从而导致不能满足大批量疾病检测的要求。
3.市面上也出现了比传统核酸提取方法操作简单便捷的核酸提取技术，主要包括：层析柱法与磁珠法。由于层析柱核酸提取技术需离心柱配套使用且需要自动化离心设备，成本较高，目前层析柱核酸提取仍以手工提取为主，效率低。
4.而磁珠法核酸提取，仅需要一种可用于核酸分离的磁珠与磁分离装置（磁力架）即可提取，操作简单，成本较低，并可进行自动化提取，实现大批量样本抽提。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒以及使用方法。
6.实现上述目的本发明的技术方案为，本发明提供一种磁珠法病毒核酸提取试剂，其特征在于包括：裂解液、磁珠液、洗涤液ⅰ、洗涤液ⅱ、洗涤液ⅲ及洗脱液。
7.第一方面，所述裂解液包括tris-hcl、硫氰酸胍、edta、triton-100、peg-6000；sds；异丙醇；其中tris-hcl为0.1m-0.5m；硫氰酸胍为3-5m；edta为10-40mm；peg-6000占总质量的2-5%；sds占总质量1%-3%；triton-100占总质量的4.5-9%；异丙醇占总质量的5-15%。
8.所述磁珠液为外购磁珠，磁珠浓度为20-50mg/ml所述洗涤液ⅰ包括tris-hcl、盐酸胍，其中盐酸胍为1-3m,ph为5.0~7.0所述洗涤液ⅱ为60-75%乙醇所述洗涤液ⅲ为75~85%乙醇所述洗脱液为te缓冲液，包括edta、tris-hcl第二方面，本发明还提供了一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：向样本中加入裂解液、磁珠，室温混匀裂解将装有混合液的离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液加入所述洗涤液ⅰ混匀后，将装有混合液的离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液加入所述洗涤液ⅱ混匀后，将装有混合液的离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液加入所述洗涤液ⅲ混匀后，将装有混合液的离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液
将磁珠晾干后，加入所述洗脱液，50-80℃温育洗脱后，收集核酸液并保存。
[0009][0010]
一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒，包括：试剂瓶、试剂密封帽以及密封结构；所述试剂瓶与实际密封帽之间通过螺纹啮合，所述密封结构位于密封帽与试剂瓶的瓶口之间；所述试剂密封帽包含：密封面板、面板塞、弹性顶柱；所述密封面板位于面板塞上，弹性顶柱位于密封帽与密封面板之间；还包括：环状密封盘、环形密封条、以及环形连接体；所述环形连接体与实际密封帽的底部一体成型，且向外延伸，所述环状密封盘位于试剂瓶上，所述环形连接体的底部具有一圈的嵌入槽，环形密封条潜入到环形连接体的嵌入槽中；所述环状密封盘上也开设有与环形密封条宽度相同的嵌入槽，所述环形密封条的底部进入到环状密封盘的嵌入槽中。
[0011]
利用本发明的技术方案制作的一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒以及使用方法，本发明提供的裂解液，无需使用蛋白酶k从而节省成本，通常样本裂解时需要加热裂解，会加速有机溶剂的挥发，对操作人员的健康有危害，本发明无需加热裂解液，可减少对操作人员的危害。通过发明人研究裂解液的各组分配比，获得了提取核酸的裂解液配方。
附图说明
[0012]
图1是本发明所述一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒的结构示意图；图2是本发明所述一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒的局部俯视结构示意图；图3是本发明所述一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒的局部俯视结构示意图；图4为1000倍稀释乙流提取的核酸pcr结果图；图5为10000倍稀释 乙流病毒提取的核酸pcr结果图图6为1000倍稀释腺病毒提取的核酸pcr结果图；图7为10000倍稀释腺病毒提取的核酸pcr结果图；图中，1、试剂瓶；2、试剂密封帽；3、密封面板；4、面板塞；5、弹性顶柱；6、环状密封盘；7、环形密封条；8、环形连接体。
具体实施方式
[0013]
下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1-7所示，一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒以及使用方法。
[0014]
下面将结合附图及实施例对该发明的技术方案做进一步说明。
[0015]
实施例1乙型流感病毒核酸提取本发明手提步骤如下：将乙流病毒用阴性咽拭子样本稀释1000倍和10000倍，分别取200μl置于离心管中，加入700μl裂解液，20-50mg/ml磁珠液20μl，室温裂解混匀5min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；其中，所述裂解液内的组分分别是：0.25m tris-hcl，3.17m硫氰酸胍，25mmedta，
3.6% peg-6000，2%sds，6%triton-100，9.5%异丙醇，其余量为水向离心管内加1ml涤液ⅰ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；其中，所述涤液ⅰ内的组分分别是：3m盐酸胍，0.25m tris-hcl，ph调至6.5向离心管内加1ml涤液ⅱ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；所述涤液ⅱ为75%乙醇溶液向离心管内加1ml涤液ⅲ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；所述涤液ⅲ为85%乙醇溶液最后加入60μl洗脱液，56℃加热混匀10min后将离心管置于磁力架上，吸磁30s，将上清液转移至新的洁净的离心管内，将提取后的核酸液保存与-20℃。
[0016]
所述洗脱液组分分别是：1mmedta、5mmtris-hcl所述磁珠为硅羟基磁珠，该磁珠粒径为500nm本发明也可配合全自动化核酸提取仪，快速高效的提取出乙流病毒咽拭子的核酸，程序如下表1所示：表1对照试剂盒选用德国qiagen qiaamp viral试剂盒，提取样本量为200μl，洗脱体积为60μl。
[0017]
提取完成后，取上述乙型流感核酸rna提取液5μl作为模板，乙流反应液20μl，总反应体积为25μl，利用ma-688y荧光定量pcr仪进行扩增检测。本发明的核酸提取试剂盒与对比试剂盒检测乙流结果如表2所示，图1为1000倍稀释乙流提取的核酸pcr结果图，图2为10000倍稀释 乙流病毒提取的核酸pcr结果图。
[0018]
表2本发明的核酸提取试剂与对照试剂检测乙流病毒结果
如表2结果和图1、图2所示，德国qiagen公司市场占有率高，应用相当普遍，在国内外一度认可为核酸提取试剂的“金标准”。由以上分析可得，本发明的提取效率已具备同类产品的水平，满足后续试验的要求。
[0019]
实施例2腺病毒核酸提取本发明手提步骤如下：1）将腺病毒用阴性粪便样本稀释1000倍和10000倍，分别取200μl置于离心管中，加入700μl裂解液，20-50mg/ml磁珠液20μl，室温裂解混匀5min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；其中，所述裂解液内的组分分别是：0.25m tris-hcl，3.17m硫氰酸胍，25mmedta，3.6% peg-6000，2%sds，6%triton-100，9.5%异丙醇，其余量为水2）向离心管内加1ml涤液ⅰ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；其中，所述涤液ⅰ内的组分分别是：3m盐酸胍，0.25m tris-hcl，ph调至6.53）向离心管内加1ml涤液ⅱ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；所述涤液ⅱ为65%乙醇溶液4）向离心管内加1ml涤液ⅲ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；所述涤液ⅲ为85%乙醇溶液5）最后加入60μl洗脱液，56℃加热混匀10min后将离心管置于磁力架上，吸磁30s，将上清液转移至新的洁净的离心管内，将提取后的核酸液保存与-20℃。
[0020]
所述洗脱液组分分别是：1mmedta、5mmtris-hcl所述磁珠为，硅羟基磁珠，该磁珠粒径为500nm本发明也可配合全自动化核酸提取仪，快速高效的提取出腺病毒粪便的核酸，程序如下表1所示：表1
对照试剂盒选用山东见微磁珠法核酸提取试剂盒，提取样本量为200μl，洗脱体积为70μl。
[0021]
提取完成后，取上述腺病毒核酸dna提取液5μl作为模板，腺病毒反应液20μl，总反应体积为25μl，利用ma-688y荧光定量pcr仪进行扩增检测。本发明的核酸提取试剂盒与对比试剂盒检测腺病毒结果如表3所示，图3为1000倍稀释腺病毒提取的核酸pcr结果图，图4为10000倍稀释腺病毒提取的核酸pcr结果图。
[0022]
表3本发明的核酸提取试剂与对照试剂检测腺病毒结果如表3结果和图3、图4所示，本发明试剂盒提取腺病毒核酸检测结果与国内已上市的对照试剂盒提取腺病毒检测效果相当。
[0023]
实施例3乙型流感病毒核酸提取本发明手提步骤如下：1）将乙流病毒用阴性唾液样本稀释1000倍，取200μl置于离心管中，加入700μl裂解液，20-50mg/ml磁珠液20μl，室温裂解混匀5min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；
其中，所述裂解液内的组分分别是：0.25m tris-hcl，3.17m硫氰酸胍，25mmedta，3.6% peg-6000，2%sds，6%triton-100，9.5%异丙醇，其余量为水2）向离心管内加1ml涤液ⅰ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；其中，所述涤液ⅰ内的组分分别是：3m盐酸胍，0.25m tris-hcl，ph调至6.53）向离心管内加1ml涤液ⅱ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；所述涤液ⅱ为75%乙醇溶液4）向离心管内加1ml涤液ⅲ，混匀1min，将离心管置于磁力架上，吸磁30s，弃去上清；所述涤液ⅲ为85%乙醇溶液5）最后加入60μl洗脱液，56℃加热混匀10min后将离心管置于磁力架上，吸磁30s，将上清液转移至新的洁净的离心管内，将提取后的核酸液保存与-20℃。
[0024]
所述洗脱液组分分别是：1mmedta、5mmtris-hcl。
[0025]
所述磁珠为，硅羟基磁珠，该磁珠粒径为500nm。
[0026]
提取完成后对rna进行定量与纯度检测。各取5μl样本，以上述洗脱液作为空白检测，使用超微量紫外分光光度计（nanodeop one）测定样本a260/a280数值并利用比值检测核酸纯度，同时与山东见微磁珠法核酸提取试剂盒进行比对，结果如下表4表4从表4可知，本发明试剂盒与对照试剂盒，提取到的核酸浓度纯度都较好，高质量的核酸a260/a280比值应在1.8-2.0之间，可看出本发明纯度比值均在1.8-2.0范围内，说明样本无蛋白质等污染物质。且浓度与纯度都与对照样本相当，故说明本发明能够有效的提取生物样本中的病毒核酸，提取的核酸量可供下一步实验使用；实施例3试剂盒包括：试剂瓶1、试剂密封帽2以及密封结构；所述试剂瓶1与实际密封帽之间通过螺纹啮合，所述密封结构位于密封帽与试剂瓶1的瓶口之间；所述试剂密封帽2包含：密封面板3、面板塞4、弹性顶柱5；所述密封面板3位于面板塞4上，弹性顶柱5位于密封帽与密封面板3之间；还包括：环状密封盘6、环形密封条7、以及环形连接体8；所述环形连接体8与实际密封帽的底部一体成型，且向外延伸，所述环状密封盘6位于试剂瓶1上，所述环形连接体8的底部具有一圈的嵌入槽，环形密封条7潜入到环形连接
体8的嵌入槽中；所述环状密封盘6上也开设有与环形密封条7宽度相同的嵌入槽，所述环形密封条7的底部进入到环状密封盘6的嵌入槽中。
[0027]
需要说明的是，上述中，试剂瓶1的瓶口与试剂密封帽2之间通过面板塞4进行密封，面板塞4为圆盘形，扣在试剂瓶1的瓶口，并通过试剂密封帽2与弹性顶柱5之间进行密封；同时试剂密封帽2的底部通过环形连接体8有环形密封条7，该环形密封条7的底部可进入到环形密封盘上嵌入槽中，从而实现对试剂瓶1的内部液体密封；上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。