一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1及其应用的制作方法

专利名称：:一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程
技术领域：
：。具体涉及一种调控水稻植株赤霉素合成的DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。
背景技术：
：赤霉素(GA)是一类植物生长激素，属于双萜类化合物，能够促进植物的生长、发芽、开花和结果，因而对植物的生长发育起着至关重要的作用。植物体内的GA成分有数十种，但具有生物活性的主要有两种，即GA1和GA4，其生物合成是通过trans-geranylgeranyldiphosphate(GGPP，牦牛儿焦磷酸)途径合成而来(HeddenandKamiya，Gibberellinbiosynthesis:enzymes，genesandtheirregulation.A皿uRevPlantPhysiolPlantMolBiol.1997，48:431-460;HedenandPillips，Gibberellinmetabolism:newinsightsrevealedbythegenes.TrendsPlantSci.2000，5:523-530)。具体过程是，在内根-贝壳杉烯合成酶的作用下从牦牛儿焦磷酸(GGPP)首先合成内根_贝壳杉烯；然后在细胞色素P450催化下，内根_贝壳杉烯转化成GA12醛；最后，GA12醛在双加氧酶的作用下氧化成为具有生物活性的GA。在水稻中，参与GA早期合成的氧化酶基因(如CPS，KS，K0和KA0)主要由单基因编码，而参与GA后期合成的氧化酶基因(如GA20ox，GA3ox禾PGA2ox)则由家族基因编码(Satkamoto等，Anoverviewofgibberellinmetabolismenzymegenesandtheirrelatedmutantsinrice.PlantPhysiol.2004，Apr;134(4):1642-53)。已有的研究表明，在水稻株高发育上，GA起到十分重要的作用。目前已有一批水稻GA缺失突变体被鉴定出来，这些突变体无一类外均表现出矮化的突变表型。水稻中首先被鉴定出来的GA缺失突变体是D18的缺失突变体，D18编码GA合成中的氧化酶基因0sGA3ox2，D18功能缺失以后引起水稻半矮突变(ItohH等，Cloningandfunctionalanalysisofgibberellin3P—hydroxylasegenesthataredifferentlyexpressedduringthegrowthofrice.ProcNatlAcadSciUSA.2001，98:8909—8914)。另夕卜一个是SDl(Semi-Dwarfl)基因，SDl编码GA合成中的氧化酶基因0sGA20ox2，SDl功能缺失以后也弓l起水稻半矮突变(Sasaki等Amutantgibberellin-synthesisgeneinrice-Nature.2002,416:701-702)。此外还有一个半矮基因是D35，编码GA合成中的氧化酶基因0sK02，其功能缺失突变体也表现为半矮突变(ItohH等，Aricesemi-dwarfgene，Tan_Ginbozu(D35)，encodesthegibberellinbiosynthesisenzyme,ent_kaoreneoxidase.PlantMolBiol.2004，Mar;54(4):533-47)。这三个基因因为能控制株高的生长发育而被誉为水稻中的绿色革命基因。赤霉素氧化酶基因的表达也要受到很多转录因子的调控，如烟草中的RSG基因可以调控GA3氧化酶基因的表达(JutarouFukazawa等，REPRESSIONOFSHOOTGROWTH,abZIPTranscriptionalActivator,RegulatesCellElongationbyControllingtheLevelofGibberellins.PlantCell,2000，Vol.12，901-915)。中国发明专利申请公开说明书(公开号CN1566147A)公开了一种调控赤霉素生成的转录因子及其编码的基因与应用，该转录调控因子命名为GPBF，来源于玉米，但是它没有转化玉米本身，而是转化拟南芥。在植物种属的分类上，拟南芥是双子叶植物而玉米是单子叶植物，因此该基因是否能够转化玉米并调控玉米植物的赤霉素的合成，其功能尚待进一步研究。本发明找到了一个来源于水稻并能调控水稻赤霉素合成的转录因子基因，这个基因在超量表达以后能够降低其调控的内源赤霉素氧化酶基因的表达，从而降低植物体内赤霉素的水平，并最终引起植株的矮化。
发明内容本发明的目的在于提供一种调控赤霉素合成的转录因子，通过转化水稻本身，培育一种能够调控赤霉素合成的转基因水稻。本发明通过以下技术方案实现本发明从水稻中分离得到一种调控植物赤霉素合成的转录因子基因OsYABl，它是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO:1中第106-615所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。本发明的转录因子OsYABl的编码基因(SEQIDNO:1)来源于水稻，由1043个碱基组成，其推测的蛋白质编码序列有510个碱基，是序列1自5'端第106位碱基到615位碱基组成。所述的基因OsYABl与水稻赤霉素合成有关。将该基因的完整编码序列(Codingsequence)与花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S结合后直接转入水稻，转基因植株株高明显比野生型对照植株株高要矮；在外源赤霉素(GA3)作用下，转基因植株的株高可恢复正常。进一步的分析发现，本发明的转基因植株内赤霉素氧化酶基因(0sGA3ox2)的表达受到了抑制，表明本发明转录因子基因OsYABl能够调控0sGA3ox2的表达。赋予植物调控赤霉素合成能力的DNA序列，它是与SEQIDNO:1中第340-1173位所示DNA序列相似性在85%以上且能调控与赤霉素氧化酶基因0sGA3ox2表达的同源DNA序列。如附图2所示，本发明构建了一种超表达载体pDS1301，获得转化载体pDS1301-YABl。利用该转化载体转化水稻品种"日本晴"(一种粳稻亚种)，得到转基因水稻植株。具体操作步骤如下(1)利用农杆菌介导的转基因方法将所述的基因OsYABl导入水稻受体，获得转化植株；(2)借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；(3)将步骤(2)的转基因植株进行大田种植并观察其性状；(4)利用反转录(RT)-PCR分析转基因植株中目标基因的表达，(5)用外源赤霉素(GA3)对转基因植株进行处理，并观察其表型；(6)借助RT-PCR分析转基因植株和野生型植株中参与赤霉素合成的氧化酶基因的表达。本发明所克隆的转录因子基因OsYABl可用于抗倒伏和紧凑型水稻育种上。更详细的技术发明细节由以下实施例给出，但并不是限制该发明的保护范围。图1:为FIL和OsYABl的蛋白质序列分析图图2:为pDS1301-YABl转化载体构建示意图图3:为野生型植株及OsYABl转基因植株株高及各节示意图。图中A，转基因水稻植株出现矮化表型；B，野生型水稻植株和转基因植株各节示意图。图4:为OsYABl在野生型对照及其转基因植株中的表达分析(RT-PCR)。本发明的转基因水稻植株(YABl-n)中OsYABl的表达比野生型水稻植株(W.T)OsYABl的表达要强。图5:为OsYABl转基因矮化植株的GA3互补实验图6:为OsYABl转基因植株和对照植株体内GA氧化酶基因的表达分析。A，表示其中的一个转基因家系YAB1-1植株体内各赤霉素氧化酶基因的表达情况，仅发现GA3ox2的表达受到了抑制；B，显示的另外两个家系GA3ox2的表达情况，发现GA3ox2的表达也受到了抑制。具体实施方式实施例10sYABl基因的克隆及序列分析用拟南芥的FIL(YABBY类转录因子，NCBI蛋白质登录号为AAD33715)基因的蛋白质序列在REDB(http:〃redb.ncpgr.cn/)网站中选择Regularblast工具，在"RiceEST"数据库做tblastx分析，找到水稻中的同源克隆(EI#95-L17)，从cDNA文库(见参考文献储昭晖、彭开蔓等，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定。科学通报.2002，47(21).1656-1662)获得这个克隆，测序获得全长cDNA序列(序列测定由上海国家基因测序中心完成)，将该DNA序列命名为OsYABl，它的cDNA核苷酸序列如序列表SEQNO:1所示(见序列表)。用GenDoc软件(版本GenDoc3.2)对FIL和OsYABl的蛋白质序列分析发现，OsYABl具有典型的YABBY类转录因子特征，即具有典型的锌指结构域(Zincfingerdomain)和YABBY结构域(YABBYdomain)(见图1)。实施例2双元Ti质粒载体的构建和转化农杆菌的建立具体步骤如下1)将带有OsYABl的cDNA克隆，装载质粒为pSPORTl(见附图2)用Kpnl和BamHI酶切后，分离目标基因片段(加上pSPORTl来源的酶切接头片段，OsYABl基因的大小为1103bp)，直接与Kpnl和BamHI酶切的载体质粒pDS1301连接(所使用的内切酶均购自TAKARA公司，用法及用量按照产品说明书；连接酶为invitrogen公司产品，用法及用量按照产品说明书)；2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为印pendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入DH10B(购自Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(Roche公司产品)的LA(LA配方参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)抗性培养基上涂皿培养；[0036]3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37。C摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述抽提质粒，用Kpnl和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达双元Ti质粒载体:pDS1301-YABl(见附图2);4)把新构建的pDS1301-YABl通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如上所述)导入农杆菌EHA105(购于CAMBIA公司)菌株中。转化后的菌株命名为T-YAB1。实施例3双元Ti质粒载体的转化及转基因植株的阳性检测1)将T-YAB1向受体品种"日本晴"转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(参见-Efficienttransformationofrice，OryzasativaL，mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT_DNA，1994，PlantJournal6:271-282)进行。所获得的TO代转基因植株命名为YABl-n，其中n二1，2，3...代表转基因的不同家系。2)取TO代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，geneticdiversityanddifferentiationofindicaanj邻onicaricedetectedbyRFLPanalysis,1992，TheorApplGenet，83，495-499)。然后用PCR方法对TO代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物的序列如下Hn-F5'-agaagaagatgttggcgacct-3'，Hn-R5'-gtcctgcgggtaaatagctg-3'(上海生物技术公司提供)。PCR反应总体积为20iil，具体配法是模板lOOng，lOxPCRbuffer2iil，10mMdNTP1.6iil，2.5mMMg2+1.5iU，左、右引物各0.4iU，TAQ酶O.2iU加水到20iU(所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下①94°C4分钟，②94°C1分钟，56°Cl分钟，④72t:2.5分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72t:10分钟，⑦4t:保存。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株。3)对TO代阳性植株收种子(Tl代)，为Tl代的大田种植和性状调查做准备。在本实施例中，遗传转化(转基因植株获得)的主要步骤、培养基以及使用的试剂如下遗传转化的主要步骤、培养基及其试剂如下(D培养基中试剂和溶液縮写本发明中培养基所用到的植物激素的縮写表示如下6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素);KT(Kinetin，激动素);NAA(萘乙酸);IAA(喷哚乙酸);2，4-D(2，4_二氯苯氧乙酸);AS(Acetosringone，乙酰丁香酮);CH(水解酪蛋白);Hn(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6基本培养基的大量成分溶液)；N6mix(N6基本培养基的微量成分溶液)；MSmax(MS基本培养基的大量成分溶液)；MSmix(MS基本培养基的微量成分溶液)[OO46](2)主要溶液配方1)N6基本培养基大量元素母液[10倍浓縮液]的配制硝酸钾(KN03)28.3g磷酸二氢钾(KH2P04)4.0g[0050]硫酸铵((NH4)2S04)4.63g硫酸镁(MgS047H20)1.85g氯化f丐(CaCl22H20)1.66g将上述试剂逐一用蒸馏水溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000ml，备用。2)N6基本培养基微量元素母液[100倍浓縮液(100X)]的配制碘化钾(KI)0.08g硼酸(H3B03)0.16g硫酸锰(MnS044H20)0.44g硫酸锌(ZnS047H20)0.15g室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOml，备用。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(配制成100X液)的配制准备800ml双蒸水并加热至70。C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA2H20)3.73克，充分溶解后在7(TC水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4t:保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinicacid)0.lg维生素Bl(ThiamineHC1)0.lg维生素B6(PyridoxineHC1)0.lg甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加蒸馏水定容至1000ml，4t:保存备用。5)MS基本培养基的大量元素母液(10X)的配制硝酸铵16.5g硝酸钾19.Og磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3.7g氯化f丐4.4g室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOml，备用。6)MS基本培养基的微量元素母液(100X)的配制碘化钾0.083g硼酸0.62g硫酸锰0.86g钼酸钠(Na2Mo042H20)0.025g硫酸铜(CuS045H20)0.0025g室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOml，备用。7)2，4-D贮存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-DlOOmg，用1mlIN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后用蒸馏水定容至100ml，于室温下保存、备用。8)6-BA贮存液(lmg/ml)的配制秤取6-BAlOOmg，用1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml用蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存，备用。0087]9)萘乙酸(NAA)贮存液(lmg/ml)的配制0088]秤取NAA100mg，用lmlIN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml，4t:保存备用。0089]10)口引哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制:0090]秤取IAAlOOmg，用lmlIN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml。0091]11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制:0092]秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4。C保存备用。0093]12)AS贮存液的配制0094]秤取AS0.392g，DMSO10ml，分装至1.5ml离心管内，4"C保存备用。0095]13)1N氢氧化钾贮存液0096]秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。0097](3)用于水稻遗传转化的培养基组分及用量0098]1)愈伤组织诱导培养基00"]N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)100ml0100]N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)10ml0101]Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)10ml0102]维生素贮存液(从已配好的100X浓縮液中)10ml01(K3]2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)2.5ml0104]脯氨酸(Proline)0.3g/L0105]CH0.6g/L0106]蔗糖(Sucrose)30g/L0107]Phytegel3g/l0108]加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，在121。C下灭菌12分钟。0109]2)愈伤组织继代培养基0110]N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)100ml0111]N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)10ml0112]Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)10ml0113]维生素贮存液(从已配好的ioox浓縮液中)10ml0114]2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)2.Oml0115]脯氨酸0.5g/l0116]CH0.6g/l0117]蔗糖30g/l0118]Phytegel3g/l0119]加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口在121。C下灭菌12分钟:3)预培养基奢养皿中(25ml/皿h0131]4)共培养基0121]0122]0123]0124]0125]0126]0127]0128]0129]0130]N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100K浓縮液中)维生素贮存液(从已配好的100X浓縮液中)2，4-D贮存液(从已配好的贮存液)CH12.5ml1.25ml2.5ml2.5ml0.75ml0.15g/L5g/L琼脂粉(Agarose)1.75g/L加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，在12rC下灭菌12分钟。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和2501AS贮存液，分装倒入0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)维生素贮存液(从已配好的100X浓縮液中)2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)CH12.5ml1.25ml2.5ml2.5ml0.75ml0.2g/L5g/L琼脂粉1.75g/L加蒸馏水至250ml，用lN氢氧化钾调节pH值至5.6，封口，在12rC下灭菌12分钟。0141]使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250y1AS贮存液，分装倒入奢养皿中(25ml/每皿)。0142]5)悬浮培养基N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)维生素贮存液(从已配好的100X浓縮液中)2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)CH0143]0144]0145]0146]0147]0148]0149]0150]中，封口0151]0152]0153]0154]0155]5ml0.5ml0.5mllml0.2ml0.08g/L2g/L加蒸馏水至100ml，用IN氢氧化钾调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶,在12rC下灭菌12分钟。使用前加入lml葡萄糖贮存液和1001AS贮存液。6)选择培养基N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)25mlN6min母液(从已配好的100X浓縮液中)2.5mlFe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)2.5ml:0巧S]维生素贮存液(从已配好的IOOX浓縮液中)2.5ml:0巧7]2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)O.625ml:0158]CH0.15g/L:0159]蔗糖7.5g/L:0160]琼脂粉1.75g/L加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0，封口，在121。C下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250ii1Hn和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。:0163]7)预分化培养基:0164]N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)25ml:0165]N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)2.5ml:0166]Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)2.5ml:0167]维生素贮存液(从已配好的100X浓縮液中)2.5ml:0168]6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)0.5ml:0169]KT贮存液(从已配好的贮存液中)0.5ml:01刑NAA贮存液(从已配好的贮存液中)50iil:0171]IAA贮存液(从已配好的贮存液中)50iil:0172]CH0.15g/L:0173]蔗糖7.5g/L:0174]琼脂粉1.75g/L加蒸馏水至250ml，用IN氢氧化钾调节pH值至5.9，封口，在121t:下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250ii1Hn和200ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。:0177]8)分化培养基:0178]N6max母液(从已配好的10X浓縮液中)100ml:0179]N6min母液(从已配好的100X浓縮液中)10ml:0180]Fe2+EDTA贮存液(从已配好100X浓縮液中)10ml:0181]维生素贮存液(从已配好的100X浓縮液中)10ml:0182]6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)2ml:0183]KT贮存液(从已配好的贮存液中)2ml:0184]NAA贮存液(从已配好的贮存液中)0.2ml:0185]IAA贮存液(从已配好的贮存液中)0.2ml:0186]CHlg/L:0187]蔗糖30g/L:0188]Phytagel3g/1加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50m1/瓶)，封口，在121t:下灭菌12分钟。9)生根培养基0192:0193:0194:0195:0196:0197:0198:0199:钟。0200:0201:0202:分钟，0203:0204:0205:0206:0207'奢养基上，在25±rc，黑暗条件下培养2周。0208,0209:25±—0210:0211'0212.:-30213,0214:0215:0216:0217'0218,0219:0220:0221:0222'MSmax母液(从已配好的10X浓縮液中)50mlMSmin母液(从已配好的100X浓縮液中)5mlFe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓縮液中)5ml维生素贮存液(从已配好的100X贮存液中)5ml蔗糖30g/LPhytegel3g/L加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，在12rC下灭菌12分(4)农杆菌介导的遗传转化步骤3.1愈伤组织诱导(1)将成熟的水稻种子(品种为"日本晴")去壳，然后依次用70%的乙醇处理10.15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；(2)用无菌水冲洗种子4-5次；(3)将灭过菌的水稻种子放在诱导培养基上(培养基的组成如上所述)；(4)将接种后的培养基置于25士rC的黑暗处培养4周。3.2愈伤组织继代培养挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于如前所述的愈伤组织继代3.3愈伤组织的预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于前面所述的预培养基上，在t:，黑暗条件下培养2周。3.4农杆菌培养(1)农杆菌EHA105接种在在带有对应抗性选择的培养基LA上预培养，培养温度为28。C培养48小时;(2)再将步骤(1)的农杆菌转移至前面描述的悬浮培养基上，在28t:摇床上培养时。3.5农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤组织转移至灭过菌的玻璃瓶内；(2)调节农杆菌的悬浮液至0D6。。0.8-1.0;(3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；然后将其接种到如前所述的共培养基上，培养温度19-2(TC，培养3天c3.6愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选)(1)用无菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌；(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟；(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400毫克/升，第二次以后为250毫克/升)[0223]3.7预分化和分化(1)将以上得到的抗性愈伤组织转移至如前所述的预分化培养基上，在黑暗处培养5-7周；培养温度26°C。(2)转移预分化培养的愈伤组织至如前所述的分化培养基上，置光照下，光照强度2000lx培养，培养温度为26°C。3.8诱导生根(1)剪掉分化时产生的根；(2)然后将其转移至如前所述的生根培养基中，在光照强度20001x下培养2_3周，培养为温度26t:，经过15天得到生根的小植株。[0229]3.9移栽洗掉小植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室培养，同时在移栽的最初的几天保持水分湿润。实施例4T1代性状调查和表达分析1)将本发明的转基因YABl-n的阳性家系以及野生型按20株/家系进行Tl代大田种植。在各家系的全生育期进行性状调查。调查数据显示在OsYABl的转基因家系中，绝大部分家系表现出株高变矮的变异表型，出现矮化特征(参见图3所示)。3)为了比较0sYABl转基因矮化植株各节相对于野生型植株各节的变化，我们对0sYABl转基因植株中的5个家系在稻粒完全成熟以后取各家系所有的矮化植株进行调查。结果发现，转基因植株除了基部的第五节变化不大外，其上各节(包括穗部)都较野生型要矮，数据如下表表1野生型植株及0sYABl转基因植株各节长度及株高调查(单位厘米)[0235]家系各家系诉杏怖站伴各节长度株高H口、J但怀数目PIIIIIIIVV野鄉1319.8±1.132.6±3.013.4±2.07.9±1.33.8±1.80純378.4±3.2YAB1-1"11.9±2.113.3±2.96.3±1.744±1.12.5±0.51.5±1.0肌0±42YAB1-21417,9±3.324.3±4.98.4±1.643±0.81.2±0.40她156.9±4.7YAB1-3916.3±2.727.8±458.3±1.743±0.81.7±0.70.7±0.159.0±2.9YAB"911.2±0.811.4±2.14.8±1.44.0±1.12.6±0.71城535.1±4.4丫AB1-5914.1±1.620.2±1.57.7±1.53.7±1.42.0±1.30.6±0.248.3±4.13)另外，我们发现矮化的植株均表现出分蘖增多的现象，表明这些植株有更广阔的增产潜力。数据来自于OsYABl的5个家系，每个家系取10株进行调查。结果如下[0237]表2本发明的OsYABl转基因植株与野生型植株分蘖情况的调查。家系野顿YAB1-1YAB1-2YAB1-3YAB1>4YAB1-5[0238]分麟化.7土4.0邻.2±3.056.6±8.061.1±24.068.2±19.067±25.04)为了检测转基因植株中目标基因的表达量，我们用RT-PCR和northern杂交等方法对转基因矮化植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自剑叶期的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下①配混合液1:总RNA2yg，DNAseI2u，10xDNAseIbuffer1yl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01%DEPC)到lOiU，混匀后将混合液1在37t:放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于7(TC水浴中温浴10分钟以去除DNAseI活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入liil500iig/ml的Qligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于7(TC水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2:混合液110iU，5xfirststrandbuffer4iU，0.1MDTT(巯基乙醇)2ii1，IO慮d證mixture1.5iU，DEPC处理水0.5ii1，反转录酶2ii1，混匀后将混合液2置于42t:水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于9(TC干浴3分钟，⑦-2(rC保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20iU，具体配法为cDNA第一链模板1y1，10xPCRbuffer2iil，10mMdNTP1.6iil，2.5mMMg2+1.5ii1，左、右引物各0.4iil，TAQ酶0.2ii1，加水到20iil(所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下①94。C2分钟，②94°C1分钟，③56°C1分钟，72°C1分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72。C7分钟，⑦4。C保存。PCR产物在1.2X的琼脂糖凝胶上电泳检测。RT-PCR用到的OsYABl基因的引物为YAB1-F5'-ctcctcctccagcattgaag-3'，YAB1-R5'-gctcatgcacttccttcctc-3'，Actin引物为Actin-F5'-tatggtcaaggctgggttcg-3'，Actin-R5'-ccatgctcgatggggtactt-3'(均为上海生物技术公司提供)。结果显示在这些矮化植株中OsYABl的表达量都得到提高，表明矮化的变异表型是由目标基因的超量表达弓I起的，表达分析结果如图4所示。实施例5转基因矮化植株的GA3互补分析和GA氧化酶基因的表达分析GA3互补实验的具体操作步骤是①配制发芽培养基MSmax母液(取已配好的10X浓縮液中)50mlMSmin母液(取已配好的100X浓縮液中)5mlFe2+EDTA贮存液(取已配好的100X贮存液中)5ml维生素贮存液(取已配好的100X贮存液中)5ml蔗糖15g/LPhytegel3g/1加蒸馏水至900ml，lN氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(30m1/瓶)，封口高温湿热灭菌12分钟左右，冷却到6(TC左右，在超净工作台向三角瓶中加入125mg/L的Hn，然后向一半加有Hn的三角瓶中加入30mg/L的GA3(Sigema公司产品)(野生型对照瓶不加Hn和GA3)，摇匀，冷却并使之凝固后待用；[0251]②种子脱毒任选OsYABl转基因的三个阳性家系(YAB1-1，YAB1-2,YAB1-4)和野生型(品种日本晴)的成熟种子，去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，倒去乙醇后用0.15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒18分钟；用灭菌水洗种子4-5次；[0253]③种子接种及发芽培养[0254]将0sYABl各家系脱毒后的种子分成两等分，一份接种于仅加有Hn的培养基，另一份接种于既加有Hn又加有GA3的培养基，这样接种的目的是完全抑制转基因种子中分离出来的与野生型种子基因型相同的种子的萌发，并观察在加与不加GA3的情况下种苗的生长情况。然后野生型种子接种于不加Hn利GA3的培养基，接种后的培养基在2『C光照培养室培养两个星期；④两个星期后取样并照相。结果显示，在施加30ppm的外源GA3后，这些转基因植株的矮化表型基本能得到恢复，说明这些植株体内的GA水平较之其野生型对照体内的GA水平要低。结果见图5。实施例6转基因矮化植株中GA氧化酶基因的表达分析对OsYABl转基因植株的三个家系(如实施例5所述)和野生型对照植株赤霉素代谢过程中各氧化酶基因的表达进行了分析。所用到的总RNA、反转录方法、RT-PCR反应体系和反应条件如实施例4中所述，RT-PCR所用到的各基因的引物如下表表3GA氧化酶基因表达分析所用到的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>[0261]结果表明，在这些矮化植株中，GA3oxidase2(0sGA3ox2)的表达降低了，而其它氧化酶基因的表达不受影响。从而说明OsYABl能负调控GA3ox2，结果见图6。SEQUENCELISTING〈110〉华中农业大学〈120〉一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYABl及其应用〈130〉[0266]<141>2005-11-08〈160>2〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>1043〈212>DNA〈213>水稻(0ryzasativa)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(1043)〈223〉〈220〉〈221>3，UTR<222>(616)..(1043)〈223〉〈220〉〈221>CDS〈222>(106)..(615)〈223〉〈220>〈221〉5，證〈222〉(1)(105)〈223〉〈400>1gctcctggatatategctegcttctttctttcttcctctctccctgtgtggcacgcgcct60ccaatcgatctcttcggtgagtagacgcatcgagatcggggggaaatgtcggtccag117MetSerValGin1tttacatcggagcatgtttgctatgtcaactgcaactattgcaacact165PheThrSerGluHisValCysTyrValAsnCysAsnTyrCysAsnThr5101520atecttgtggtgaatgtgccaaacaattgttectecaacattgtgact213lieLeuValValAsnValProAsnAsnCysSerTyrAsnlieValThr253035gttagatgtgggcattgcacaatggtgetctecatggatcttgetcct261ValArgCysGlyHisCysThrMetValLeuSerMetAspLeuAlaPro404550tttC3Cc朋gcacgcactgttc朋gatC3CcaggteC3g朋C3g3gga309PheHisGinAlaArgThrValGinAspHisGinValGinAsnArgGly15[0305]556065tttc朋ggt朋t朋ctttggaagetetgacategettcc3ga朋tcag357PheGinGlyAsnAsnPheGlySerTyrAsplieAlaSerArgAsnGin707580￡iggtcgseagccatgtecCC33tgCC33CC3gtC3gC3gc朋gtg405ArgThrSerThrAlaMetTyrProMetProThrSerGinGinGinVal859095100teacctatecgtccccctgagaaaagacagcgtgtcccatctgcatac453SerProlieArgProProGluLysArgGinArgValProSerAlaTyr105110115朋c3gattcate朋ggaggagatecagaggatt朋aaccage朋tcct501AsnArgPhelieLysGluGlulieGinArglieLysThrSerAsnPro120125130gagattagecacagggaggcattcagtgetgetgcaaagaactggget549GlulieSerHisArgGluAlaPheSerAlaAlaAlaLysAsnTrpAla135140145catcttccceggetccattttggcetcaacgtcgccgacggcggcggc597HisLeuProArgLeuHisPheGlyLeuAsnValAlaAspGlyGlyGly150155160ggcggcggcageaacteatcgcggcggcgcggcctgccggccggccac645GlyGlyGlySerAsn165cgatcgccggcgtgcacgccggcgcgcgcgacggccggtcgagaatgegegegcaggagg705gacgacgacgatetettettatcgcgtgtgcccctctctcttcgccgcgtaatteattea765tcagtteattaatteegtecgacctectgtgttetgetetcgatccgtgtteatteatte825cctecgtetcttgatteattagtctegtetteteegtectatteteegtecgtgctgtgc885tetgtecgtegac朋c朋朋a朋朋tgtgcgtgatgagttctecteegteegteegtect945gtgttctegtgtttteatttgtetccgaaccaaggagttgttteatteactgeatgeaca1005tgcactggacttg朋tctggagte朋朋朋朋朋朋朋1043〈210>2〈211>169〈212>PRT〈213〉水稻(0ryzasativa)〈400>2MetSerValGinPheThrSerGluHisValCysTyrValAsnCysAsn151015TyrCysAsnThrlieLeuValValAsnValProAsnAsnCysSerTyr202530AsnlieValThrValArgCysGlyHisCysThrMetValLeuSerMet[0344]354045[0345]AspLeuAlaProPheHiSGinAlaArg／hrValGinAspHiSGinVal[0346]505560[0347]GinAsnArgGlyPheGinGlyAsnAsnPheGlySet／yrAsp工leAla[0348]65707580[0349]SetArgAsnGinArg／hrSet／hrAlaMet／yrProMetPro／hrSet[0350]859095[0351]GinGinGinValSetPro工leArgProPro61uLysArg61nArgVal[0352]100105110[0353]ProSetAla／yrAsnArgPhe工leLys61u61u工le61nArg工leLys[0354]115120125[0355]／hrSetAsnPro61u11eSetHiSArg61uAlaPheSetAlaAlaAla[0356]130135140[0357]LysAsn／rpAlaHiSLeuProArgLeuHiSPhe61yLeuAsnValAla[0358]145150155160[0359]Asp61y61y61y61y61y61ySetAsn[0360]165权利要求一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1，其序列是序列表SEQIDNO1中第106-615位所示的DNA序列。2.权利要求1所述的基因在调控水稻赤霉素合成中的应用。专利摘要本发明涉及植物生物
技术领域：
：。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因OsYAB1与水稻赤霉素合成有关。将该基因的完整翻译序列(Codingsequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)结合后直接转入水稻，转基因植株明显比野生型对照植株矮；在外源赤霉素(GA3)作用下，转基因植株株高可恢复正常，进一步的分析发现，转基因植株内赤霉素氧化酶基因(OsGA3ox2)的表达受到了抑制，而其它氧化酶基因不受影响。表明OsYAB1可负调控OsGA3ox2的表达，并影响植物株高。文档编号C12N15/29GKCN1966687B发布类型授权专利申请号CN200510019814公开日2010年5月12日申请日期2005年11月16日发明者代明球,周道绣,张启发申请人:华中农业大学导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(1),非专利引用(2),