专利名称:神经突起延伸引导装置及其制造方法
技术领域：
本发明是关于一种可引导及加速神经细胞突起生长的装置及其制造方法，可用以做为神经细胞的培养与神经组织再生。
背景技术：
人体的各种感觉、行动、思考、情绪乃至于脏器的运作，皆由神经系统来负责统合与调控，因此只要神经系统的任何部位发生损伤或病变，皆会造成患者生活上极大的不便，甚至深深影响意识与精神状态，由此可见，任何可以维持神经组织系统正常运作的相关技术与产品的重要性与迫切性。
神经系统生理功能的运作由神经细胞执行，神经细胞在结构上分为细胞本体(soma)与细胞突起(processes)二部分，其中细胞突起的部分又分为轴突(axon)与树突(dendrite)。轴突负责传送信息至另一神经细胞，树突则负责接收其它神经细胞所传递而来的信息。神经细胞突起的末端有一隆起的构造，称为突触(synapse)。突触为神经细胞之间相互接触的部位，神经细胞利用此一部位分泌神经传递物质(neurotransmitter)刺激另一株神经细胞，同样的，另一株神经细胞亦利用此一结构接受神经化学物质的刺激，引发细胞体内一连串的信息传递作用而反应的。
成熟的神经系统内，有二项主要维持其基本功能的标准需求首先神经细胞必须位于其特定位置，此外神经突起(即轴突与树突)或是突触的连结必须正确。神经细胞所处的位置及其所联结的标的并非随机产生，而是经由一连串分化与发育过程而形成。发育过程中个别神经细胞有其不同的移动路径，以使细胞位于特定的位置。除了细胞位置外，神经细胞之间的连结亦需要正确，这仰赖发育过程中轴突末端的生长点(growthcone)沿着特定路径延伸，最后与其标的(target)接触，再分化成为突触。不同生长点有其延伸的路径，典型的生长点的外形上有一些小触须(microspike)是由肌纤维蛋白(actin)所支撑的构造，生长点即是通过由这些小触须的伸长或缩短来向前延伸或是改变延伸的方向。
神经轴突生长点的延伸不只于发育过程扮演重要角色，当神经组织受损之后，神经轴突生长点的再生路径搜寻与标的连结，亦是受损神经功能恢复与否的重要关键。因此，神经轴突延伸(或再生)与生长点的路径搜寻(path-finding)机转如能被充分了解，将可于神经组织工程技术领域：
中协助开发神经组织工程相关产品，例如神经再生引导基材型式设计与神经再生引导活性分子的发明；同时，亦可以将轴突与生长点的生长特性分析运用于神经系统相关药物的开发。
研究神经轴突生长点的延伸机制一直是神经科学领域一大重要课题，从文献资料中得知，已经有相当多的科学家尝试运用目前最新的材料与微机电技术于神经细胞体外培养上，通过此达到引导神经轴突依一定方向生长，形成特定型式神经网络的目的，同时也方便纪录神经轴突生长的各项参数，并利于神经细胞膜电位与神经传导物质分泌的分析。目前在这一方面研究投入与产出最多的单位为德国的Max Planck Institute，其主要的技术开发方向包含1.特定结构的硅芯片基材加工(fabrication of patterned silicon chip)、2.将神经路径引导分子以一定型式固定在基材上(surface modification with neuronalpath-finding molecule)、3.将体外培养的神经组织或细胞培养在材料上，形成神经细胞网络。惟其发展的技术只提供神经细胞网络的基本架构，科学家在体外神经细胞网络建构上仍有许多瓶颈尚待突破，例如1.如何突破神经细胞与材料界面的联系，以充分接收并刺激神经细胞信息传导2.如何延长神经细胞在相关基材上培养的存活时间，以提高运用的效率3.如何建构一实时的神经轴突生长检测系统，以充分掌握神经轴突延伸的机制4.如何设计神经细胞网络芯片，以符合神经药物筛选、神经组织再生引导、与神经信息传导刺激/接收的运用，以及5.如更有效引导神经轴突生长延一定路径延伸。
在神经细胞培养与再生技术领域：
中，已知美国专利公开号20030032946技术中是利用50～100纳米宽的凹槽，用以引导神经轴突的速结，以应用于组织内与神经网络连接。此外在L.Lauer et al.2002，“Electrophysiological recordings of patterned ratbrain stem slice neurons”所发表的技术论文中，揭露不同宽度与连接点(线宽2～6微米、结点直径大小10～20微米)的设计，其是将蛋白质以特定型式涂布于培养基材上，然而前述技术的引导分子材料是为一连续式的神经引导路径或于特定节点加强引导分子涂布区域，这与本发明的神经细胞生长装置之间断式引导分子型态显然不同。
传统的神经细胞培养装置或方法大多以连续式神经细胞引导路径的设计或是改变基材上的涂布材料，而培养时间需花费较长，因此开发一种可快速促使神经细胞再生与延伸的装置是为重要的课题。
发明内容
为有效促进神经细胞的生长与再生，通过以控制神经细胞轴突的延伸，本发明是通过由基材表面微结构的设计形式，使基材得以运用于神经细胞培养或神经再生引导，加速神经轴突的延伸速度，缩短神经网络连结或再生的时程。
本发明的目的是提供一种神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，其是包含一基材，其是具有一表面，可允许神经细胞粘着成长于其上；及一引导分子材料，其是位于前述基材表面，用以引导神经细胞轴突成长；其中前述引导分子材料的分布是至少一部分为间断式的型式。较佳地，前述引导分子材料的分布是为间断式的线条或不连续的区块的线条，其宽度是为2～10微米，且每20～100微米的长度间具有一2～15微米之间隔。前述装置的基材上亦可进一步包含神经细胞培植区。
本发明的另一目的是提供一种神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的方法，其步骤是包含(a)提供一微压印图章，该微压印图章上具有间断式的图案；(b)将引导分子材料形成于微压印图章上；(c)将步骤(b)的微压印图章覆盖于一基材上，以将引导分子材料转移至基材上；及(d)将微压印图章与基材分离，即可获得具有引导分子材料的神经细胞生长装置，且该装置的引导分子材料的分布至少一部分为间断式的型式。
本发明的再一目的是提供一种利用前述神经细胞生长或神经突起延伸引导装置培养神经细胞的方法，其步骤包含提供一欲培养的神经细胞；将神经细胞置于本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的引导分子材料上；及将前述装置置于适合神经细胞生长的环境进行神经细胞生长或神经突起延伸的培养。
利用本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，其引导分子材料是为间断或不连续的型态，以其进行神经细胞培养或神经再生引导时，不仅可控制神经轴突生长方向，同时可加速神经轴突的延伸速度，故可应用于神经细胞培养、植入式神经细胞芯片、体外神经网络建构、神经再生引导基材及神经组织修复鹰架。
图1A是为具备直线与圆形细胞培植区结构的微压印图章；图1B是为具备直线与间断式直线结构的微压印图章；图1C是为具备间断式直线结构的微压印图章的表面电子显微镜影像图；图2A是为本发明的具有间断式引导分子材料型态的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，其中间断式的引导分子材料型态是为每10微米接续5微米之间断裂口；图2B是为本发明的具有间断式引导分子材料型态的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，其中间断式的引导分子材料型态是为每100微米接续10微米之间断裂口；图2C是为现有的连续式引导分子材料型态；图3A是为神经细胞于本发明的装置上培养的轴突延伸趋势图，其中间断式的引导分子材料型态是为每50微米接续5微米之间断裂口；图3B是为间断式与连续式的引导分子材料型态对神经细胞轴突平均延伸速度的长条比较图；图4A是为神经细胞于本发明的装置上培养的轴突延伸趋势图，其中间断式的引导分子材料型态是为每20微米接续5微米之间断裂口；图4B是为间断式与连续式的引导分子材料型态对神经细胞轴突平均延伸速度的长条比较图；
图5A是为神经细胞于本发明的装置上培养的轴突延伸趋势图，其中间断式的引导分子材料型态是为每40微米接续10微米之间断裂口；图5B是为间断式与连续式的引导分子材料型态对神经细胞轴突平均延伸速度的长条比较图。
1 神经细胞培植区结构2 直线结构3 间断式直线结构具体实施方式
本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置是由基材及引导分子材料的结合所构成，其中基材的材质可为硅芯片、玻璃、石英、聚合物、细胞培养基等材料所制成的组织鹰架、神经再生引导装置、培养皿、芯片及微流体芯片。本发明的基材具有一表面，可允许神经细胞粘着成长于其上，而为使神经细胞的轴突依照预期方向生长，则需仰赖引导分子材料的作用，引导分子材料若欲更稳定地形成于基材表面，基材制作时可利用一体成型的方法将凹陷或隆起的线条或区块制作于其表面上，或利用蚀刻法或沈积法于基材表面制作凹陷或隆起的线条或区，以便于将引导分子材料形成于其上。基材也可以是本技术领域：
所熟知的神经再生引导装置或神经修复组织鹰架，通过由本发明的引导分子材料特殊分布型态，提升神经细胞于该基材上的生长及再生能力。
引导分子材料位于前述基材表面，其目的是用以引导神经细胞轴突成长，引导分子材料包含蛋白质、胜肽、神经传导物质、生物兼容性复合材料及其混合物等有助于神经细胞生长、再生与贴附的物质，引导分子材料可透过化学固定、涂布、喷墨方式、微接触式压印技术(Micro-contact printing)等现有技术与基材表面接触结。
引导分子材料型态是为间断的线条或不连续的区块，较佳是为不连续的线条，其宽度是为2～10微米，且每20～100微米的长度间具有一2～15微米之间隔。
本发明的神经细胞生长装置其基材的表面是可进一步包含化学引诱剂因子、粘着分子、相斥分子及表面轮廓线材等本技术领域：
所熟知可用以控制及促进神经细胞生长、再生及轴突延伸的物质，以便使神经细胞轴突能于延伸过程中顺利朝预期的方向。
本发明的一种制备神经细胞生长装置的方法的一是利用微接触式压印技术。首先需提供一微压印图章，其是利用机械切割、蚀刻或光罩微影技术制作出一主模后，再将该主模进行翻模程序制得。微压印图章的材料的选用是以软性高分子材料为主，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、聚丙烯或其混合物，其中较佳是为聚二甲基硅氧烷，微压印图章的制作是将液状的微压印图章材料滴在一平面材料(例如玻片)上，再将此平面材料覆盖于主模上，此时将主模及平面材料一起置于真空泵浦内抽气，直到平面材料与主模间的气体完全抽出后置于高温环境中烘烤，直到软性高分子材料固化后由主模上取下，此时微压印图章上即具备和主模互补的图案，亦即本发明的欲用以形成间断式引导分子材料型态的图形(pattern)。
取得微压印图章之后，将引导分子材料形成于前述微压印图章上，过程中可以利用氮气枪吹，加速引导分子材料的干燥成形，的后取欲涂布引导分子材料的基材，覆盖于微压印图章上，基材可先进行酸洗及水洗的动作，之后浸泡于酒精中于使用前才取出烘烤，此外基材及微压印图章在进行引导分子材料的形成及转印的步骤前，可先利用O2电浆进行表面处理，使其表面具有更佳的亲水性，让引导分子材料更容易附着。
当引导分子材料由微压印图章上移转至基材上后，即可将基材与微压印图章分开，此步骤可利用刀片作为分离工具，使两者的分离程序易于进行，也可较容易避免基材与微压印图章间发生两次覆盖的情形。
制备本发明的具间断式神经轴突引导分子材料的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的方法并不限于上述微接触式压印技术，任何可使神经轴突引导分子材料附着于基材上的方法皆可被使用。本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的实施态样包括细胞培养皿、神经细胞芯片、微流体芯片、神经再生导管及神经组织修复鹰架等。可应用于神经细胞培养、植入式神经细胞芯片、体外神经网络建构、神经再生引导基材。
以下实施例是用于进一步了解本发明的优点，并非用于限制本发明的申请专利范围。
实施例1.本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的制备首先利用微影技术制作一硅芯片的主模，接着以10∶1的比例调制Sylgard silicone elastomer 184及PDMS的混合物，接着取一玻片，将前述配制好的PDMS溶液置于玻片上后，将玻片覆盖于主模上，然后置于真空泵浦内抽气，使玻片与主模间的气体完全抽出。接着置于70℃的环境中烘烤，待PDMS固化后由主模上取下，即可制得PDMS的微压印图章(如图1A至图1C所示)。其中由图1A及图1B可知，本实施例的微压印图章的图样是包含一圆形的神经细胞培植区结构1及直线结构2(图1A)，以及接续于该直线结构2后段之间断式直线结构3。此是为了于基材制造出具有用于将神经细胞置入并培养于其中的神经细胞培植区的引导分子材料型态。而直线结构2与间断式直线结构3是可于基材上制作出是用于使神经细胞轴突快速地延伸生长之间断式引导分子材料型态。
接着取另一作为基材的玻片，该玻片在使用前已先经过酸洗、水洗及酒精浸泡的程序，经烘烤后和微压印图章一起进行O2电浆表面处理，接着将作为引导分子材料的层粘连蛋白(laminin)滴在微压印图章上后以氮气枪轻吹，使引导材料分子能平均涂布于微压印图章的表面，等引导分子材料变干后，将玻片覆盖于微压印图章上进行引导分子材料的转移，过程中可轻压玻片，但不可施力过大以免造成压印图案模糊。之后将玻片与微压印图章分开，若不容易分开可使用刀片辅助，过程中需避免玻片和微压印图章发生两次覆盖，分开的后即可制得本发明的神经细胞生长或神经突起延伸装置。
根据上述微接触式压印技术制成的本发明的具有间断式引导分子材料型态的神经细胞生长或神经突起延伸装置如图2A及图2B所示，其与图2C所示现有的连续式引导分子材料型态显然不同。图2A的引导分子材料线条宽度为5微米、两并行线间的距离为20微米，线长以每10微米(Dash line:10微米)接续5微米之间断裂口(Dash gap:5微米)方式重复排列。图2B的引导分子材料线条宽度与两并行线间的距离与图2A一样，分别为5微米与20微米，但图2B中的线长以每100微米接续10微米之间断裂口方式重复排列。图2C的引导分子材料线条宽度为3微米、两并行线间的距离为6微米。
实施例2.利用本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置培养金鱼神经细胞金鱼神经细胞是由金鱼视网膜组织诱导其神经轴突伸出组织块的后，将其置于本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的引导材料分子上，本实施例的基材为一般载玻片、引导分子材料是为层粘连蛋白(laminin)，其型态是为间断式线条，其长度为每50微米接续5微米之间断裂口，对照组则为如图2C所示的连续式线条。将具有金鱼神经细胞的本发明的装置置于适当环境中观察神经细胞生长及神经突起延伸情形，所得结果如图3A及图3B，其中图3A是为神经细胞于本发明的生长装置上培养的轴突延伸趋势图，由图可知在最初的120分钟内，神经细胞轴突可被成功引导延伸，图3B则是比较间断式与连续式的引导分子材料型态对神经细胞轴突延伸速度的差异，由平均速度的长条比较图可知，间断式的引导分子材料型态可以诱发神经细胞以相较于连续式达约2倍的速度进行轴突的延伸。其机制推论乃因生长点(growth cone)以跳跃的方式跨过间断的引导分子材料接口，因此加速了神经轴突延伸的速度。
实施例3.利用本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置培养金鱼神经细胞实验准备及操作方法同实施例2，但本实施例的引导分子材料型态其长度为每50微米接续5微米之间断裂口，对照组同样为连续式线条，所得结果如图4A及图4B，其中图4A是为神经细胞于本发明的生长装置上培养的轴突延伸趋势图，由图可知在最初的120分钟内，神经细胞轴突可被成功引导延伸，图4B则是比较间断式与连续式的引导分子材料型态对神经细胞轴突延伸速度的差异，由平均速度的长条比较图可知，间断式的引导分子材料型态可以诱发神经细胞以相较于连续式达约2倍的速度进行轴突的延伸。
实施例4.利用本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置培养金鱼神经细胞实验准备及操作方法同实施例2，但本实施例的引导分子材料型态其长度为每40微米接续10微米之间断裂口，对照组同样为连续式线条，所得结果如图5A及图5B，其中图5A是为神经细胞于本发明的生长装置上培养的轴突延伸趋势图，由图可知在最初的120分钟内，神经细胞轴突可被成功引导延伸，图5B则是比较间断式与连续式的引导分子材料型态对神经细胞轴突延伸速度的差异，由平均速度的长条比较图可知，间断式的引导分子材料型态可以诱发神经细胞以相较于连续式达约2.5倍的速度进行轴突的延伸。
由上述实施例的结果可知，本发明的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置其间断式的引导分子材料型态，在应用于神经细胞培养或神经再生引导时，可促进神经细胞突起于基材表面的贴附延伸，并引导神经轴突生长方向，加速神经轴突的延伸速度。相较于现有神经细胞生长或神经突起延伸装置的技术，可明显加速神经突起延伸速度，对于未来神经医学重建及再生医疗是为一项重大的突破。
其它实施态样在本说明书中揭露本发明数个实施态样。根据本说明书所揭露的内容，任何熟习本技术领域：
的人士皆可基于本发明的特色，在不脱离本发明精神与目的下，对本发明做不同的更动与修饰，因此，其它实施态样也包含在本发明的申请专利范围内。
权利要求
1.一种神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，其特征在于包含一基材，其是具有一表面，允许神经细胞粘着成长于其上；及一引导分子材料，其是位于前述基材表面，用以引导神经细胞轴突成长；其中前述引导分子材料的分布是至少一部分为间断式的型式。
2.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述引导分子材料的分布是为间断式的线条。
3.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述引导分子材料的分布是为不连续的区块。
4.如权利要求
2所述的装置，其特征在于，所述间断式的线条其宽度是为2～10微米。
5.如权利要求
2所述的装置，其特征在于，所述间断式的线条其每20～100微米的长度间具有一2～15微米之间隔。
6.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述引导分子材料包含蛋白质、胜肽、神经传导物质、生物兼容性复合材料或其混合物。
7.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述基材的表面可进一步先利用蚀刻法或沈积法制作具有间断式型式的神经轴突引导路径，用于使引导分子材料涂布于其上。
8.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述引导分子材料是可通过由化学固定、涂布方式、喷墨方式或微接触压印方式附着于基材表面上。
9.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述基材上可进一步包含一神经细胞培植区。
10.如权利要求
1所述的装置，其特征在于，所述基材的表面是可进一步包含化学引诱剂因子、粘着分子、相斥分子及表面轮廓线材。
11.一种制备神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的方法，其特征在于，包含(a)提供一微压印图章，该微压印图章上具有间断式的图案；(b)将引导分子材料形成于前述微压印图章上；(c)将前述步骤(b)的微压印图章覆盖于一基材上，通过以将引导分子材料转移至基材上；及(d)将前述微压印图章与基材分离，即可获得具有引导分子材料的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，且该装置的引导分子材料的分布至少一部分为间断式的型式。
12.如权利要求
11所述的方法，其特征在于，所述微压印图章是利用一以微影技术制得的主模将其翻模后制得。
13.如权利要求
11所述的方法，其特征在于，所述微压印图章的材料是包含聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚丙烯或其混合物。
14.如权利要求
13所述的方法，其特征在于，所述微压印图章的材料是为聚二甲硅氧烷。
15.如权利要求
11所述的方法，其特征在于，所述引导分子材料的分布是为间断式的线条。
16.如权利要求
11所述的方法，其特征在于，所述引导分子材料的分布是为不连续的区块。
17.如权利要求
15所述的方法，其特征在于，所述间断式的线条其宽度是为2～10微米。
18.如权利要求
15所述的方法，其特征在于，所述间断式的线条其每20～100微米的长度间具有一2～15微米之间隔。
19.如权利要求
11所述的方法，其特征在于，所述基材上可进一步包含一神经细胞培植区。
20.如权利要求
11所述的方法，其特征在于，所述引导分子材料包含蛋白质、胜肽、神经传导物质、生物兼容性复合材料或其混合物。
21.一种利用权利要求
1所述的神经细胞生长或神经突起延伸引导装置培养神经细胞的方法，其特征在于，步骤包含提供一欲培养的神经细胞；将前述神经细胞置于神经细胞生长或神经突起延伸引导装置的引导分子材料上；及将前述装置置于适合前述神经细胞生长的环境进行神经细胞生长或神经突起延伸的培养。
22.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述引导分子材料的分布是为间断式的线条。
23.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述引导分子材料的分布是为不连续的区块。
24.如权利要求
22所述的方法，其特征在于，所述间断式的线条其宽度是为2～10微米。
25.如权利要求
22所述的方法，其特征在于，所述间断式的线条其每20～100微米的长度间具有一2～15微米之间隔。
26.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述引导分子材料包含蛋白质、胜肽、神经传导物质、生物兼容性复合材料或其混合物。
专利摘要
本发明是关于一种神经细胞生长或神经突起延伸引导装置，其是利用于基材上设计间断式的神经路径引导分子材料，达到引导并加速神经细胞轴突的延伸速度，缩短神经网络连结或再生的时程。本发明亦揭露一种利用微接触压印方法制备该神经细胞生长装置的方法。
文档编号C12N5/08GKCN1861779SQ200510070169
公开日2006年11月15日 申请日期2005年5月9日
发明者沈欣欣, 骆婉珣, 林奇宏, 刘宏文 申请人:财团法人工业技术研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan