专利名称:一种降解燃料油中含硫杂环化合物的细菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及降解燃料油中含硫杂环化合物的细菌菌株及其用途。
背景技术：
矿物燃料燃烧后产生的SO2是形成酸雾、酸雨等环境污染的重要因素。随着燃料油(汽油、柴油)用量的不断增加，持续开发使得世界各国现存含硫量低的石化燃料越来越少，随着能源危机的逐步加剧，高硫化石燃料的开采成为必然，由此造成的环境污染也日趋严重。各国都对燃油的品质，特别是含硫量提出了严格的限制。预计2000-2005年全球50％的燃料油含硫量将降低到0.05％，我国也对燃油的含硫量制订了严格的控制标准。
降低大气中的SO2排放量的最有效的办法就是减少燃料中的硫含量。不同来源的燃料油中硫含量相差很大，其重量百分比大约在0.03％-10％的范围内变化。原油中的含硫化合物大致可分为无机硫和有机硫。无机硫主要由溶解或悬浮在油中的元素硫、硫化氢、硫化物和硫铁矿等组成；而占含硫量的大部分的是石油中大约有200种左右之多的有机硫，这些有机硫由各种硫醇、硫醚和噻吩及其衍生物组成。
针对高品质清洁燃料油的需求，迫切需要开发燃烧前深度脱硫技术。目前从石油及其产品中脱硫普遍采用的方法为加氢脱硫(HDS)。HDS是在高温(＞300℃)、高压(＞10MPa)、加氢和金属催化剂的条件下进行的脱硫反应。该法可有效地脱除无机硫和简单的有机硫化合物，而对于杂环类含硫化合物，如二苯并噻吩(DBT)，特别是烷基取代DBT衍生物，HDS很难脱除这部分硫。相比于传统的加氢脱硫技术，国际上近年来迅速发展中的生物脱硫技术(BDS)具有许多优点，如能有效脱除传统加氢装置难以处理的DBT等含硫杂环化合物；在常温常压下操作，反应条件温和；投资和操作费用低等。据估计，BDS的设备投资仅为HDS的50％，操作费用将减少10％-20％。
生物脱硫技术(BDS)，又称生物催化剂脱硫，是一种在常温常压下利用需氧、厌氧菌去除杂环化合物中结合的有机硫的一种新技术。细菌的生存是以硫而不是碳为能源。在生化反应过程中，细菌或酶可以再生或自身补充。“4S”氧化路径是一种硫选择性氧化过程，在生物催化剂的作用下，选择性的剪断含硫化合物中的C-S键，将有机化合物中的硫原子氧化成无机硫化合物转入水相，含硫化合物脱去硫原子后仍留在油相中，不损失油的热值，从而为深度脱硫提供了可能性。从环保和能源两方面综合考虑，用BDS替代HDS，或同HDS共同作用生产超低硫石油产品将是各国炼油工业的抉择之一。生物脱硫技术将成为21世纪很有发展前途的脱硫技术之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解燃料油中含硫杂环化合物的细菌菌株及其用途。
降解燃料油中含硫杂环化合物的细菌菌株属于微杆菌属(Microbacteriumsp.)；菌落形状呈圆形，直径1～2mm；个体形状呈略弯曲的杆状，0.2×0.5-1.1mm；无芽孢，无夹膜；属革兰氏阳性菌株，好氧；能以DBT为唯一硫源。
该菌株用于燃料油中的含硫杂环化合物的脱硫。
本发明采用生物脱硫技术，利用自行分离的微杆菌株作为生物催化剂，在常温常压下去除燃料油中杂环化合物结合的有机硫；细菌的生存是以硫而不是碳为能源。二苯并噻吩(DBT)是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，此菌株基本上遵循“4S途径”代谢，能专一地切断DBT中的C-S键，将硫原子氧化成无机硫化合物转入水相，产物2-羟基联苯(2-HBP)仍留在油相中，不损失油的热值，同时有另外两种新产物2-甲氧基联苯和联苯生成，能部分消除2-HBP对酶的抑制和对细胞的毒害，从而更有利于生物脱硫。除DBT外，该菌株还能以燃料油中的其他含硫有机化合物噻吩、苯并噻吩、二苯硫醚和4，6-二甲基二苯并噻吩为硫源生长，表现出较广的底物范围，具有较好的燃料油生物脱硫工业应用前景。
具体实施方式
菌种的选育方法从油田、炼油厂、污水处理厂等地取污泥和被污染的土壤样品，经浸取、富集和驯化之后，将培养液按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到10-8稀释倍数的菌液涂布于固体选择培养基平板，倒置于恒温培养箱，30℃培养5～6天，挑出分离的单菌落扩大培养，用GC-MS检测降解DBT后的产物，初筛得到按“4S”氧化途径选择性降解DBT的菌株。以DBT为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。该菌株的短期保藏，接入添加DBT的斜面培养基，于冰箱4℃保藏。长期保藏，制备冻干管，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2005年9月27日，保藏编号1468。
该菌株属于微杆菌属Microbacterium sp.；菌落形状呈圆形，直径1～2mm；个体形状呈略弯曲的杆状，0.2×0.5-1.1mm；无芽孢，无夹膜；属革兰氏阳性菌株，好氧。
在第一个方面，本发明的特征是一种能降解燃料油中含硫杂环化合物的微杆菌属细菌，能以DBT为唯一硫源生长，按“4S”氧化途径专一性切断DBT中的C-S键，不损失油的热值。
在第二个方面，本发明的特征是在选择性平板培养基上培养4～5天后，生成菌落为圆形，直径1～2mm，表面光滑，周边平整，呈淡黄色。
1000mL液体培养基组成如下K2HPO4·3H2O 5.0g，NaH2PO4·2H2O 2.0g，MgCl2·6H2O 0.2g，NH4Cl 2.0g，甘油2g，微量元素1mL，硫源为0.2～0.5mmol/L DBT。其中微量元素组成(每100mL蒸馏水)CuCl2·2H2O 0.011mg，CoCl2·6H2O 0.04mg，ZnCl20.02mg，CaCl20.4mg，H3BO30.005mg，NaMoO4·2H2O 0.02mg，FeCl3·7H2O 0.4mg，AlCl3·6H2O 0.01mg，MnCl2·4H2O 0.08mg。
固体选择性培养基平板和斜面液体选择培养基加1～2％水洗琼脂。
培养条件适宜生长pH范围为6.5～9.5；适宜生长温度为20～40℃；以氯化铵为氮源，适宜浓度为0.5～2.0g/L；以甘油为碳源，适宜浓度为1.0～4.0g/L；以DBT为硫源，浓度为0.2～0.5mmol/L。
将4℃冰箱保存的菌种接种于斜面培养基，20～40℃下培养96小时。再将经活化的菌种接入灭菌后的DBT为唯一硫源的液体培养基，置于20～40℃摇床，100～300rpm培养至对数期后期停止培养，将菌悬液离心分离，用0.85％的生理盐水洗涤两次，下层菌相浓缩悬浮于pH7.0的0.1mol/L的磷酸缓冲液中，制备得到休止细胞，用于含硫杂环化合物的脱硫。
水溶液脱硫时，将休止细胞悬浮液和一定浓度DBT，置于转速100～300rpm，温度20～40℃的摇床中反应，间隔一定时间取样，用等量乙酸乙酯萃取，4800rpm离心分离10分钟，有机相用GC分析。
油水两相脱硫时，以正十六烷为有机相，一定浓度的DBT为模型硫反应物，油水两相的适宜配比为0.5～2.0，置于转速100～300rpm，温度20～40℃的摇床中反应，间隔一定时间取样，4800rpm离心分离10分钟，有机相用GC分析。
实施例1用正十六烷作为模型研究有机相，水相为休止细胞菌悬液，油水相的体积比为1.0，以0.2～0.5mmol/LDBT为反应物，置于转速100～300rpm，温度20～40℃的摇床中反应，间隔3、6、9、12、24、48小时取样，4800rpm离心分离10分钟，有机相用GC分析，测定产物2-HBP生成量，同时与水相脱硫作对比。在油水两相溶液中该菌株产生的2-HBP在9小时后基本不增加，而在水溶液中大约24小时后失去活性。油水两相溶液中的脱硫活性比水溶液中的活性高，可见有机相的存在能提高菌株对DBT的脱硫活性。由于2-HBP对DBT的降解有很强的抑制作用，存在的有机相能从水相中有效吸收2-HBP，从而减少对菌体降解活性的抑制作用。另外，十六烷的加入能增加DBT的生物可得性而加速降解。
实施例2DBT是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，但是除DBT外，油中的含硫杂环化合物还有很多，如噻吩，苯并噻吩，4，6-二甲基二苯并噻吩(4，6-DMDBT)和二苯硫醚。液体培养基中分别加入不同的含硫有机化合物噻吩、苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩、二苯硫醚作为唯一硫源，浓度均为0.2～0.5mmol/L。接入1g/L休止细胞菌液，置于转速100～300rpm，温度20～40℃的摇床中反应，间隔时间取样，加入10％盐酸调pH≤2后，等量乙酸乙脂萃取，4800rpm离心分离10分钟，萃取相用GC分析。在46小时之内，该菌能完全脱除噻吩，在72小时完全脱除苯并噻吩；对4，6-二甲基二苯并噻吩也有较好的去除效果，在46小时之内脱除94％后在72小时也能将其完全脱除。相对脱除效果较差的二苯硫醚在72小时之内也能去除70％。此菌株能完全去除噻吩，苯并噻吩，4，6-二甲基二苯并噻吩，并脱除部分二苯硫醚中的硫，比其他菌株的脱硫范围更广，对燃料油脱硫来说具有无可比拟的优越性，因此将更具有工业应用前景。
权利要求
1.一种降解燃料油中含硫杂环化合物的细菌菌株，其特征在于它属于微杆菌属(Microbacterium sp.)，其保藏编号为CGMCC NO.1468；菌落形状呈圆形，直径1～2mm；个体形状呈略弯曲的杆状，0.2×0.5-1.1mm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧；能以二苯并噻吩为唯一硫源。
2.权利要求
1所述的降解含硫杂环化合物细菌菌株的用途，其特征是用于燃料油中的含硫杂环化合物的脱硫。
专利摘要
本发明公开了一种降解燃料油中含硫杂环化合物的细菌菌株及其用途。该菌株属于微杆菌属(Microbacterium sp.)；呈略弯曲的杆状，0.2×0.5－1.1mm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。本发明采用生物脱硫技术，利用该菌株作为生物催化剂，在常温常压下去除燃料油中杂环化合物中的硫；细菌的生存是以硫而不是碳为能源。该菌株代谢二苯并噻吩基本遵循“4S途径”，不损失油的热值，同时有另外两种新产物2－甲氧基联苯和联苯生成，能部分消除2－甲氧基联苯对酶的抑制和对细胞的毒害，更有利于生物脱硫。该菌株还能脱除燃料油中的噻吩、苯并噻吩、二苯硫醚和4，6－二甲基二苯并噻吩等含硫有机化合物。
文档编号C12S1/00GKCN1793333SQ200510061671
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月22日
发明者李伟, 施耀, 张英, 蔡郁蓓 申请人:浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan