原上或免疫上不同于AAV4。此外，AAV2 病毒颗粒优选保持例如本文实例例示的不同于AAV4的组织嗜性，尽管包含至少一种AAV2 外被蛋白的AAV2嵌合颗粒可具有不同于仅由AAV2外被蛋白组成的AAV2颗粒的组织嗜性。
[0045] 如图6A和6B所示，AAV2衣壳序列和AAV4衣壳序列约为60%同源的。在某些实 施方案中，AAV2衣壳包含与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列有至少65%同源性的序列（或由 与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列有至少65%同源性的序列组成）。
[0046] 在某些实施方案中，本发明还提供含有（即用衣壳包裹）包含一对AAV2反向末端 重复的载体的AAV2颗粒。AAV2 ITR的核苷酸序列是本领域已知的。此外，颗粒可以是包 含AAV4和AAV2衣壳蛋白两者（即嵌合蛋白）的颗粒。此外，颗粒可以是用衣壳包裹包含 来自其它AAV (例如AAV1-AAV8)的一对AAV反向末端重复的载体的颗粒。在颗粒中被衣 壳包裹的载体还可包含插入反向末端重复之间的外源核酸。
[0047] AAV的下列特征使之成为基因转移的有吸引力的载体。已表明AAV载体在体外稳 定整合至细胞基因组中；具有宽泛的宿主范围；体外和体内转导分裂和不分裂的细胞两者 并保持高水平的转导基因表达。病毒颗粒是热稳定的，抵抗溶剂、去污剂、pH变化、温度变化 的，可在CsCl梯度上浓缩。AAV原病毒的整合与对细胞生长或分化的任何长期负面作用无 关。已表明ITR是复制、包装和整合所必需的唯一顺式元件，并且可含有一些启动子活性。
[0048] 本发明提供给予AAV颗粒、重组AAV载体和重组AAV病毒粒子的方法。例如，AAV2 颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒，或AAV4颗粒是包含AAV4衣壳蛋白的病毒颗粒。重 组AAV2载体是包含至少一种独特的AAV2核酸的核酸构建体。重组AAV2病毒粒子是含有 重组AAV2载体的颗粒。在术语"AAV2 ITR"内要考虑的是，核苷酸序列必须保持将AAV2 ITR与AAV4 ITR区分开来的本文所述的一个或两个特征：（1)三个（而非AAV4中的四个） "GAGC"重复序列，和（2)在AAV2 ITR R印结合部位中，前2个"GAGC"重复序列的第4个核 苷酸是C而非T。
[0049] 启动子可以是任何所需的启动子，根据已知的考虑事项选择，例如与启动子功能 性连接的核酸的表达水平和将在其中使用载体的细胞类型。启动子可以是外源或内源启动 子。启动子可包括例如已知的强启动子例如SV40或诱导型金属硫蛋白启动子或AAV启动 子，例如AAV p5启动子。启动子的其它实例包括来源于以下的启动子：肌动蛋白基因、免疫 球蛋白基因、巨细胞病毒（CMV)、腺病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒启动子例如腺病毒主要晚期 启动子、诱导型热激启动子、呼吸道合胞体病毒、劳斯肉瘤病毒（RSV)等。具体地说，启动子 可以是AAV2 p5启动子或AAV4 p5启动子。此外，保持启动子活性的p5启动子的较小片段 可容易地通过标准方法测定，包括例如在P5启动子中构建一系列的缺失，使该缺失与报道 基因连接，并测定报道基因是否表达，即转录和/或翻译。
[0050] AAV载体还可包含与启动子功能性连接的外源（异源）核酸。所谓"异源核酸"意 指可插入载体中的任何异源或外源核酸，所述载体用于转移到细胞、组织或生物体中。例 如，在某些实施方案中，异源核酸编码保护性ApoE同种型。所谓"功能性连接"意指如本领 域已知，使得启动子可促进异源核酸的表达，例如启动子相对于异源核酸的适当取向。此 夕卜，如本领域已知，异源核酸优选具有用于核酸表达的所有适当序列，以功能性编码待表达 的核酸（即允许核酸表达）。核酸可包括例如表达调控序列，例如增强子和必要的信息处理 位点，例如核糖体结合部位、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。核酸可编 码多于一种的基因产物，仅受可被包装的核酸的大小限制。
[0051] AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。本文考虑AAV2衣壳蛋白的氨基酸序 列的变异，只要所得的包含AAV2衣壳的病毒颗粒保持在抗原上或在免疫上不同于AAV4,如 可通过标准方法常规测定的。具体地说，例如，ELISA和蛋白质印迹可用来测定病毒颗粒是 否在抗原上或免疫上不同于其它AAV血清型。
[0052] AAV4是AAV家族的独特成员。美国专利号6, 468, 524中提供了 AAV4的论述，所 述专利通过引用结合到本文中。DNA杂交数据表明AAV1-4同源性的相似水平。然而，与其 它AAV形成对比，在AAV4中鉴定出对应于衣壳蛋白的唯--个0RF，且针对Rep蛋白未检出 0RF。本发明提供包含AAV4病毒的载体以及AAV4病毒颗粒。虽然AAV4与AAV2相似，但本 文发现两个病毒在物理上和遗传上不同。这些差异赋予AAV4 -些独特的优势，使之更好地 适于用于基因疗法的载体。例如，野生型AAV4基因组比AAV2大，允许较大重组基因组有效 衣壳化。此外，野生型AAV4颗粒具有比AAV2颗粒大的浮力密度，因此比基于AAV2的颗粒 更容易从污染性辅助病毒和空的AAV颗粒中分离。另外，与AAV1、2和3形成对比，AAV4能 够使人、豚鼠和绵羊红细胞凝聚。
[0053] 在某些实施方案中，本发明提供包含AAV5病毒的载体或包含该病毒的子部件的 载体以及AAV5病毒颗粒。美国专利号6, 855, 314中提供了 AAV5的论述，所述专利通过引用 结合到本文中。虽然AAV5与AAV2相似，但是发现两种病毒在物理上和遗传上不同。这些 差异赋予AAV5某些独特的性质和优势，使之更好地适于用于基因疗法的载体。例如，使用 AAV2作为基因疗法的载体的一个限制性特征是产生大量的病毒。采用标准生产技术，AAV5 以是AAV2的10-50倍高的水平产生。因为其独特的TRS位点和R印蛋白，AAV5应还具有 较之于AAV2不同的整合基因座。
[0054] 此外，再次出乎意料的是，AAV5衣壳蛋白不同于AAV2衣壳蛋白，并显示不同组织 嗜性，因此使得含AAV5衣壳的颗粒适于转导AAV2不适于或不太适于的细胞类型。已表明 AAV2和AAV5在血清学上是不同的，因此，在基因疗法应用中，AAV5和AAV5来源的载体可允 许转导由于天然免疫防疫或因之前暴露于AAV2载体的结果所致已具有AAV2中和抗体的患 者。AAV5的另一个优势是AAV5不能被其它血清型拯救。仅AAV5可拯救整合的AAV5基因 组，并引起复制，因此避免由其它AAV血清型引起的非有意的AAV5复制。
[0055] 本文所用术语"多肽"是指氨基酸的聚合物，包括全长蛋白质及其片段。因此，"蛋 白质"、"多肽"和"肽"在本文常常互换使用。可通过已知参数选择中性取代。如本领域技 术人员所理解的，本发明还包括在氨基酸序列或其它性质中具有细微变化的那些多肽。这 些变化可作为等位基因变化（例如由于遗传多态性所致）天然产生或可通过人为干预（例 如通过克隆的DNA序列的诱变）产生，例如诱导的点、缺失、插入和取代突变体。一般优选 氨基酸序列的少量变化，例如保守氨基酸置换、小的内部缺失或插入和在分子末端的添加 或缺失。这些修饰可导致氨基酸序列的改变、提供沉默突变、更改限制位点或提供其它特定 突变。
[0056] 本发明的方法提供将核酸递送至细胞的方法，所述方法包括给予细胞含有包含插 入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的AAV颗粒，从而将核酸递送至细胞。给予细 胞可通过任何方法实现，包括使任选包含在所需液体（例如组织培养基或缓冲盐水溶液） 中的颗粒与细胞简单接触。可使颗粒保持与细胞接触任何所需的时长，通常给予颗粒并允 许无限期地保留。对于这种体外方法，可通过本领域已知的和本文所例示的标准病毒转导 方法将病毒给予细胞。待给予的病毒的滴度尤其可根据细胞类型而变化，但总的来说用于 AAV转导的应是典型的。另外可以使用本发明实施例中用于转导特定细胞的滴度。细胞可 包括人以及其它大型（非啮齿类）哺乳动物（例如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪和狗）中 的任何所需细胞。
[0057] 更具体地说，本发明提供将核酸递送至室管膜细胞的方法，所述方法包括给予室 管膜细胞含有包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的AAV颗粒，从而将核酸 递送至室管膜细胞中。
[0058] 本发明还包括将核酸递送给受试者的方法，所述方法包括给予受试者的细胞包含 插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，并将细胞再输回给受试者，从而将核酸 递送给受试者。在某些实施方案中，AAV ITR可以是AAV2 ITR。对于这种离体给予，根据细 胞类型通过标准方法，从受试者中分离细胞，再次根据细胞类型，将细胞置于合适的培养基 中。然后如上所述，使病毒颗粒与细胞接触，使病毒转染细胞。然后可再次通过针对细胞类 型和组织的标准方法，使细胞回植入受试者的机体。如有需要，在移植前，可通过已知的检 测方法和如本文所述，针对病毒的转染度对细胞进行研究。
[0059] 本发明还提供将核酸递送至受试者的细胞的方法，所述方法包括给予受试者包含 插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，从而将核酸递送至受试者的细胞。给 予可以是对取自受试者的细胞（例如上文列举的细胞的任一种）的离体直接给予，接着通 过将细胞置换返回受试者，或给予可以是对受试者的细胞的体内给予。对于离体给予，可根 据细胞类型通过标准方法，从受试者中分离细胞，再次根据细胞类型，将细胞置于合适的培 养基中。然后如上所述，使病毒颗粒与细胞接触，使病毒转染细胞。然后可再次通过针对细 胞类型和组织的标准方法，将细胞回植入受试者的机体。如有需要，在移植前，可通过已知 的检测方法和如本文所述，针对病毒的转染度对细胞进行研究。
[0060] 还提供将核酸递送至受试者的室管膜细胞的方法，所述方法包括给予受试者包含 插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，从而将核酸递送至受试者的室管膜细 胞。
[0061] 在某些实施方案中，靶向脑血管内皮的氨基酸序列靶向患有疾病（例如阿尔茨海 默病）的受试者的脑血管内皮。
[0062] 在某些实施方案中，靶向脑血管内皮的氨基酸序列靶向未患阿尔茨海默病的受试 者的脑血管内皮。
[0063] 在某些实施方案中，病毒载体包含编码治疗剂的核酸序列。在某些实施方案中，治 疗剂是保护性ApoE同种型。
[0064] 本公开内容的某些实施方案提供包含本文所述的病毒载体的细胞。
[0065] 在某些实施方案中，细胞是非啮齿类哺乳动物的哺乳动物细胞。在某些实施方案 中，细胞是灵长类动物细胞。在某些实施方案中，细胞是人细胞。在某些实施方案中，细胞 是非人类细胞。在某些实施方案中，细胞是体外的。在某些实施方案中，细胞是体内的。在 某些实施方案中，细胞是室管膜细胞。
[0066] 本公开内容的某些实施方案提供治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括将本 文所述病毒载体或细胞给予哺乳动物。
[0067] 在某些实施方案中，哺乳动物是人。
[0068] 本公开内容的某些实施方案提供将作用剂递送给受试者的中枢神经系统的方法， 所述方法包括将本文所述病毒载体给予CSF，使得转导的室管膜细胞表达治疗剂并将作用 剂递送至受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中，病毒载体转导室管膜细胞。
[0069] 本公开内容的某些实施方案提供本文所述的病毒载体或细胞用于医学治疗。
[0070] 本公开内容的某些实施方案提供本文所述的病毒载体或细胞制备用于治疗哺乳 动物的疾病（例如阿尔茨海默病）的药物的用途。
[0071] 载体还可包含保护性ApoE同种型蛋白。本文所用术语"分泌的蛋白质"包括任何 分泌的蛋白质，不论是天然分泌的，还是经修饰以含有信号序列使得它能够分泌。
[0072] 核酸当放置成与另一个核酸序列有功能关系时是"有效连接"的。一般而言，"有 效连接"意指连接的DNA序列是邻接的。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在适宜的限 制位点上的连接来实现。如果所述位点不存在，则按常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子 或接头。另外，编码酶的核酸的多个拷贝可在表达载体中连接在一起。这类的多个核酸可 被接头分隔。
[0073] 本公开内容还提供含有本文所述载体的哺乳动物细胞。细胞可以是人的，并可来 自脑。细胞类型可以是干细胞群或祖细胞群。
[0074] 本公开内容提供通过给予本文所述的多核苷酸、多肽、表达载体或细胞来治疗哺 乳动物的疾病（例如遗传疾病或癌症）的方法。遗传疾病可以是神经变性疾病，例如阿尔 茨海默病。
[0075] 本公开内容的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和遗传工程细胞（体内修饰的 细胞）及其用途。具体地讲，本公开内容涉及能够全身递送治疗有效剂量的治疗剂的基因 或蛋白质疗法的方法。
[0076] -方面，提供用于在哺乳动物接受者中表达治疗剂的细胞表达系统。该表达系统 (本文亦称为"遗传修饰细胞"）包含细胞和用于表达治疗剂的表达载体。表达载体包括但 不限于用于将异源遗传物质递送至细胞的病毒、质粒和其它载体。因此，本文所用术语"表 达载体"是指用于将异源遗传物质递送至细胞的载体。具体地讲，表达载体为重组腺病毒、 腺伴随病毒或慢病毒或反转录病毒载体。
[0077] 表达载体还包括用于调控异源基因转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子 (下文描述）。表达系统适于给予哺乳动物接受者。表达系统可包含大量非永生化的遗传 修饰细胞，每个细胞含有编码至少一种治疗剂的至少一个重组基因。
[0078] 细胞表达系统可在体内形成。又一方面，提供用于体内治疗哺乳动物接受者的方 法。该方法包括例如通过静脉内给予，将表达异源基因产物的表达载体原位导入患者的细 胞中。为了体内形成表达系统，将用于表达治疗剂的表达载体体内i.v.导入哺乳动物接受 者中，其中载体通过血管系统迁移至脑。
[0079] 又一方面，提供用于体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括将目标蛋白质 体内导入患者中。
[0080] 用于表达异源基因的表达载体可包括用于调控异源基因产物转录的诱导型启动 子。因此，通过将细胞原位暴露于诱导异源基因转录的条件下，来控制原位治疗剂的递送。
[0081] 哺乳动物接受者可患有适于基因置换疗法的病况。如本文所用，"基因置换疗法" 是指给予接受者编码治疗剂的外源遗传物质，随后原位表达所给予的遗传物质。因此，短语 "适于基因置换疗法的病况"包括例如遗传疾病（即可归因于一个或多个基因缺陷的疾病病 况）、获得性病理（即不归因于先天缺陷的病理病况）、癌症等病况和预防方法（即疾病或 非期望的医学病况的预防）。因此，本文所用术语"治疗剂"是指对哺乳动物接受者具有有 益作用的任何作用剂或物质。因此，"治疗剂"包括具有核酸或蛋白质组分的治疗性和预防 性分子两种。
[0082] 按照一个实施方案，哺乳动物接受者患有遗传疾病，且外源遗传物质包含编码用 于治疗该疾病的治疗剂的异源基因。在又一个实施方案中，哺乳动物接受者患有获得性病 理，且外源遗传物质包含编码用于治疗该病理的治疗剂的异源基因。按照另一个实施方案， 患者患有癌症，且外源遗传物质包含编码抗肿瘤剂的异源基因。在又一个实施方案中，患者 患有非期望的医学病况，且外源遗传物质包含编码用于治疗该病况的治疗剂的异源基因。
[0083] 本文所用术语"保护性ApoE同种型"包括该多肽的变体或有生物活性或无生物活 性的片段。该多肽之一的"变体"是与天然蛋白质不完全相同的多肽。可通过经由一个或多 个氨基酸的插入、缺失或取代改变氨基酸序列来获得这类变体蛋白质。蛋白质的氨基酸序 列例如通过取代而被修饰，产生与天然多肽相比，具有基本相同的性质或性质得到改进的 多肽。取代可以是保守取代。"保守取代"是氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸取代。 保守取代可以是被在氨基酸的电荷或氨基酸侧链的大小（或者侧链内的化学基团的大小、 电荷或种类）方面的变化尽可能小的氨基酸的取代，使得总体上肽保持其空间构象但生物 活性被改变。例如，常见的保守变化可为Asp至Glu、Asn或Gin ;His至Lys、Arg或Phe ;Asn 至61]1、48?或6111和361'至〇78、1111'或617。丙氨酸常用来取代其它氨基酸。20种必需 氨基酸可如下分组：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有不带电荷的极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨 酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；和具有碱性侧链的赖氨酸、 精氨酸和组氨酸。
[0084] 通过改变相应的核酸序列的密码子来实现氨基酸改变。已知可根据用某些氨基酸 取代多肽结构的其它氨基酸，来获得这类多肽，以改变或改进生物活性。例如，通过备选氨 基酸的取代，可赋予多肽导致活性提高的小的构象改变。或者，某些多肽中的氨基酸取代可 用来提供残基，所述残基然后可与其它分子连接以提供肽-分子缀合物，所述缀合物保持 充分的起始多肽的性质以用于其它目的。
[0085] 在赋予多肽相互作用性生物功能时，可使用氨基酸的亲水指数（hydropathic index)，其中发现，可用某些氨基酸取代具有类似亲水指数的其它氨基酸，并仍保持类似的 生物活性。或者，可根据亲水性进行相似氨基酸的取代，特别是当待产生的多肽中所需的生 物功能欲用于免疫实施方案时。受其邻近氨基酸的亲水性支配的"蛋白质"的最大局部平 均亲水性，与其免疫原性关联。因此，注意到，可根据各个氨基酸所分配的亲水性进行取代。 [0086] 在使用亲水性指数或亲水指数（其将值分配给各个氨基酸）时，优选进行其中这 些值为±2的氨基酸的取代，其中±1是特别优选的，为±0. 5的那些是最优选的取代。 [0087] 变体蛋白质与相应的天然蛋白质的氨基酸序列具有至少50%、至少约80%或甚至 至少约90%但小于100%的邻接氨基酸序列同源性或同一性。
[0088] 变体多肽的氨基酸序列基本上相当于天然多肽的氨基酸序列。本文所用的"基本 上相当于"是指可诱导与由天然蛋白质所产生的反应基本上相同的生物反应的多肽序列。 所述反应可以是由天然蛋白质所产生的水平的至少60%，甚至可以是由天然蛋白质所产生 的水平的至少80%。
[0089] 变体可包括不存在于相应天然蛋白质中的氨基酸残基或相对于相应天然蛋白质 的缺失。与相应的天然蛋白质相比，变体还可以是截短"片段"即仅是全长蛋白质的一部分。 蛋白质变体还包括具有至少一个D-氨基酸的肽。
[0090] 变体蛋白质可由编码变体蛋白质的分离的DNA序列表达。"重组体"定义为通过遗 传工程方法产生的肽或核酸。应注意，本领域众所周知的是，由于遗传密码的丰余性所致， 各个核苷酸可在密码子中容易地交换，并仍导致相同的氨基酸序列。术语"蛋白质"、"肽" 和"多肽"在本文可互换使用。
[0091] 本公开内容提供通过将表达载体给予细胞或患者治疗哺乳动物的疾病的方法。对 于基因治疗方法，具有分子生物学和基因疗法领域普通技术的人员无需过多实验，便能够 测定给予用于本公开内容的新的方法的表达载体的合适剂量和途径。
[0092] 按照一个实施方案，细胞是在体内转化的或以别的方式遗传修饰的。哺乳动物接 受者的细胞用含有用于表达编码治疗剂的异源（例如重组）基因的外源遗传物质的载体体 内转化（即转导或转染），并且治疗剂原位递送。
[0093] 如本文所用，"外源遗传物质"是指天然或合成（即不是天然存在于细胞中）的核 酸或寡核苷酸；或如果其天然存在于细胞中，则不被细胞以生物学上显著的水平转录或表 达。因此，"外源遗传物质"包括例如可转录成反义RNA的非天然存在的核酸以及"异源基 因"（即编码在天然存在的相同类型的细胞中不表达或以生物学上不显著的水平表达的蛋 白质的基因）。
[0094] 在某些实施方案中，哺乳动物接受者患有适于基因置换疗法的病况。如本文所用， "基因置换疗法"是指给予接受者编码治疗剂的外源遗传物质，随后原位表达所给予的遗传 物质。因此，短语"适于基因置换疗法的病况"包括例如遗传疾病（即可归因于一个或多个 基因缺陷的疾病病况）、获得性病理（即不归因于先天缺陷的病理病况）、癌症等病况和预 防方法（即疾病或非期望的医学病况的预防）。因此，本文所用术语"治疗剂"是指对哺乳 动物接受者具有有益作用的任何作用剂或物质。因此，"治疗剂"包括具有核酸（例如反义 RNA)和/或蛋白质组分的治疗性和预防性分子两者。
[0095] 或者，适于基因置换疗法的病况是预防方