ELISA所定量测定（图1B)且通过蛋白质印迹所证实的，与AAV4-GFP处理的动 物相比，在AAV4-AP0E注射小鼠中可检测到低水平的重组蛋白。
[0137] 2.ApoE各同种型的过量表达差异性地影响淀粉样变的进程。
[0138] 使用体内双光子成像在活的动物中跟踪随时间推移的淀粉状蛋白沉积。简单地 说，给APP/PS小鼠（7月龄）立体定位地注射编码ApoE2、ApoE3、ApoE4和Venus的AAV4载 体。1周后，植入颅窗，对开颅术后随时间推移的淀粉状蛋白沉积成像。2个月后，处死动物， 进行死后分析。
[0139] 制备 了注射 AAV4-ApoE2、AAV4-ApoE3 或 AAV4-ApoE4 的 APP/PS 小鼠的双光子图 像。在腹膜内注射Meth〇xy-X04 (5mg/kg)后可检测到淀粉状蛋白斑，将德克萨斯红葡聚糖 (70, 000 Da分子量；12. 5 mg/ml，在无菌PBS中）注射入外侧尾静脉以提供荧光血管造影 片。在注射后1周（=T0)、1个月和2个月拍摄图像。随时间拍摄相同视野以跟踪病变的进 展。出现少量新的淀粉状蛋白沉积，而其少数几个在2个月时间内不能再检测到。
[0140] 体内图像的全面分析显示，与AAV4-ApoE3和AAV4-Venus处理的动物两者相比，在 AAV4-Ap 〇E4注射的APP/PS小鼠中淀粉状蛋白沉积的数目显著更快地增加。相比之下，当使 用AAV4-ApoE2时，测量到斑块密度小但显著的降低（图2)。在注射AAV4-ApoE4的APP/PS 小鼠中,观察到趋于较大斑块的趋势（P〈〇. 06)，但总体上斑块的大小保持不变。体内成像的 汇总数据显示，各APOE同种型的过量表达体内差异性地影响淀粉状蛋白沉积的进展。注射 AAV4-Ap 〇E2导致淀粉状蛋白密度随时间轻微降低，而注射AAV4-Ap〇E4使淀粉样变加剧。
[0141] 3.淀粉状蛋白斑的大小根据各ApoE同种型而改变。
[0142] 体内双光子成像允许跟踪在2个月时间内各淀粉状蛋白沉积大小的变化。斑块的 大小可随时间保持稳定、增大或减小。介于T1/T0和T2/T1之间的大小比率的分布显示与 其它组相比，在注射AAV4-Ap 〇E4的小鼠中有趋于较大淀粉状蛋白斑的变化（图3)。
[0143] 4.淀粉状蛋白负荷的死后评价证实ApoEmAp〇E4对淀粉状蛋白沉积的作用。
[0144] 在AAV4注射后2个月，死后体视学评价显示，AAV4-ApoE4注射动物在皮质中具有 较高密度的淀粉状蛋白斑，而在其它组间未能检出差异（图4A)。当斑块用ThioS或BamlO 标记时，观察到这种淀粉状蛋白沉积数目的增加。然而，未检出BamlO和ThioS之间比率的 变化。与2个月的相比，在注射后5个月，各ApoE同种型的作用更明显（图4B)。当给小鼠 注射AAV4-Ap 〇E4时，观察到沉积密度显著增加，而用Ap〇E2检测到相反的作用。再次，未检 出BamlO和ThioS间比率的变化。
[0145] 5.各ApoE同种型差异性地影响淀粉状蛋白沉积周围的突触密度。
[0146] 采用阵列断层扫描术来精确地测定淀粉状蛋白沉积周围突触前和突触后成分的 密度。这种新的成像方法提供组织分子构造的高分辨率成像的能力。阵列断层扫描术基于 样本的超薄切片（70nm)、免疫染色和3D重建。针对淀粉状蛋白斑和突触后标志物PSD95 染色阵列断层扫描术样品的代表性图像。阵列断层扫描术图像显示，在淀粉状蛋白沉积周 围观察到突触后标志物PSD95的数目减少，但远离斑块处这种作用消失。在注射AAV4的小 鼠的各组中定量测定在斑块附近或远离斑块的突触前（突触蛋白-1)和突触后标志物（图 5A-D)。突触前和突触后成分的广泛量化证实，突触蛋白1和PSD95密度的增加与淀粉状蛋 白斑有关，当Ap 〇E4在APP/PS1小鼠脑中过量表达时，这种作用被急剧放大（图5C，图。 与其它组相比，在淀粉状蛋白沉积附近，Ap 〇E4的过量表达与脊丢失（spine loss)增加有 关。与此相反，突触蛋白点（synapsin puncta)的密度在ApoE2处理的动物中在斑块周围 较闻。
[0147] 结论 脑室内注射AAV病毒血清型4导致整个脑实质可溶性重组蛋白持续和长期的过量生 产。ApoE2、ApoE3和ApoE4的过量表达差异性地影响APP/PS小鼠中病理的进程，使得与 Ap〇E3相比，当注射Ap 〇E4时淀粉状蛋白负荷的进展显著加快。相反地，Ap〇E2与保护作用有 关，少量的淀粉状蛋白沉积在注射后2个月再无法检测出。死后免疫组织学分析证实Ap 〇E4 的不良作用。与Ap〇E3相比，Ap〇E4的持续过量生产加剧淀粉状蛋白沉积周围所观察到的 突触丢失，而ApoE2具有轻微作用。本研究表明体内ApoE同种型、淀粉样变进展和突触丢 失之间的直接联系。
[0148] 实施例2 大型晡乳动物中通讨脑脊液（CSF)治疗中枢神经系统病症 为了实现针对脑病症（例如阿尔茨海默病）的基因疗法，需要测定是否可在哺乳动物 中达到治疗性酶的长期稳态水平。发现室管膜细胞（位于脑室的细胞）可被转导，并分泌 所靶向的酶进入脑脊液（CSF)中。测定了在小鼠模型中，腺伴随病毒（AAV4)可以高效率转 导室管膜。（Davidson等，/WA?，28:3428-3432, 2000)。在小鼠中，在AAV4治疗后，疾病脑 中存在归一化的贮存的底物水平。
[0149] 研究了载体的全面递送是否可有效地进行，以实现酶在CSF中的稳态水平。首先， 需要发现可转导较大哺乳动物脑中的室管膜细胞（内衬脑室的细胞）的载体。在LINCL的 狗模型和LINCL的非人灵长类动物模型中进行了研究。LINCL狗出生时正常，但在7个月左 右出现神经病学征兆，在5-6个月左右出现可测试的认知缺陷，在10-11个月出现癫痫发作 和进行性视力丧失。
[0150] 腺伴随病毒（AAV)由于其小的尺寸（20 nm)被选为载体，可去除（"挖去"）其遗 传物质的大部分，使得不存在病毒基因，并使之无能力复制。之前测试过腺伴随病毒4型 (AAV4)载体是否可在由葡糖醛酸糖苷酶缺乏症引起的黏多糖贮积症VII型（MPS VII) 鼠模型中介导全面的功能和病理改进（Liu等，J Afetfroscimce，25(41):9321-9327， 2005)。将编码葡糖醛酸糖苷酶的重组AAV4载体单侧注射进患有已证实疾病的MPS VII小鼠的侧脑室。转导的室管膜表达高水平的重组酶，其分泌的酶穿透大脑和小脑结构 以及脑干。免疫组织化学研究显示重组酶和脑微脉管系统的密切关系，表明葡糖醛酸 糖苷酶通过内衬血管的血管周围间隙达到脑实质。通过场景恐惧条件反射（context fear conditioning)测试了厌恶性联想学习。与年龄相配的杂合对照相比，受累小鼠显示条件性 恐惧反应和场景辨别受损。这种行为缺陷在AAV4 葡糖醛酸糖苷酶治疗MPS VII小鼠 中在基因转移后6周逆转。数据表明室管膜细胞可用作酶分泌进入周围脑实质和CSF的来 源。
[0151] 然而，出人意料的是，当这些研究延伸到大型哺乳动物（即狗和非人灵长类动物） 时，AAV4载体在这些动物中在靶向室管膜时是无效的。取而代之的是，需要使用AAV2载体。 简单地说，产生编码TPP1的rAAV2 (AAV2-CLN2)，脑室内注射以转导室管膜（Liu等，J Afeuroscieflce，25(41) :9321-9327，2005)。TPP1 是 LINCL 中的酶缺陷型。数据表明，NHP 脑中的室管膜转导引起CSF中酶的显著增加。结果表明不同脑区中TPP1活性的水平升高， 其中垂直轴表示活性的％对照（图7)。
[0152] 在治疗的第一只狗中，载体的递送是亚最佳的，但在脑中仍显示CLN2活性。随后， 用立体定位手术对狗进行了 ICV递送。发现相对于未治疗的狗，经治疗的狗的认知能力显 著改善，如通过T型迷津行为测量的（图8)。此外，在LINCL狗模型中AAV2-CLN2的ICV递 送的作用非常明显。在未治疗的（-/_)动物中，存在大的脑室，而未治疗对照和受治疗动物 的脑中不显示脑室。在将AAV.TPP1递送至LINCL狗的脑室后，在不同脑区（包括小脑和上 段脊髓）注意到可检测的酶活性。在两只其它活的受累狗中，脑萎缩显著减轻，寿命延长， 认知功能改善。最后，在NHP中，我们表明该方法可实现野生型的2-5倍高的TPP1活性水 平。
[0153] 产生了几种AAV载体，并测试以确定ITR和衣壳的最佳组合。产生了 5种不同组 合，经测定，AAV2 ITR 是最有效的：AAV2/1 (即 AAV2 ITR 和 AAV1 衣壳）、AAV2/2、AAV2/4、 AAV2/5和AAV2/8。发现AAV2/2在大型哺乳动物（狗和NHP)中运行好得多，接着是AAV2/8、 AAV2/5、AAV2/1和AAV2/4。这是相当出乎意料的，因为病毒载体功效的顺序与在小鼠中观 察的相反。
[0154] 因此，本研究显示，脑室内衬细胞可能是用于分布在整个脑中的CSF中的重组酶 的来源，且AAV2/2是在狗和非人灵长类动物给予治疗剂（例如编码CLN2 (TPP1)的基因） 的有效载体。
[0155] 实施例3 通过基因转移递送的人AP0E同种型通过影响淀粉状蛋白沉积、清除和神经毒性差异 性地调节阿尔茨海默病 阿尔茨海默病（AD)是最常见的年龄相关性神经变性病症，已成为主要的公共健康顾 虑。在与AD的晚期发作性偶发性形式有关的易感性基因中，载脂蛋白E e4 (AP0E -基 因；ApoE -蛋白质）等位基因迄今是最重要的遗传风险因子。与最普通的APOE e3等位 基因相比，1个APOE e 4拷贝的存在相当大地增加发生疾病的风险达3倍，而2拷贝导致 12倍增加。令人感兴趣的是，APOE e 2具有相反的影响，并且是保护因子，使得这种特定等 位基因的遗传降低AD的年龄调节的风险为与AP0E3/3相比的大约一半。痴呆的平均发病 年龄还与这些风险概况一致，其中AP0E4/4携带者在其六十来岁中期发作，AP0E2/3携带者 在其九十来岁早期发作，变化几乎三十年，而AP0E3/3个体的发病年龄介于期间，在七十来 岁中期。
[0156] ApoE影响AD的机制是有争议的。含AP的老年斑在患者的海马和皮质中的蓄积 被认为在AD中起重要作用，因为负责该病的稀有常染色体显性形式的所有已知基因都参 与AP肽的产生。引人关注的是，显示了也观基因型极强地影响AD患者中淀粉状蛋白沉 积的程度以及尸检样品中检检到的神经毒性可溶性寡聚AP的量。已表明ApoE同种型差 异性地影响脑血管的完整性，并影响AP肽通过血脑屏障的流出，因此调节血管周围淀粉 状蛋白聚集体的集结（脑淀粉状蛋白血管病或CAA)。另外，ApoE还直接涉及神经变性和神 经元可塑性。在这些情况中Ap 〇E2的作用的研究不足。
[0157] 表达人么-於和-份的基因工程改造的动物具有与人类似的淀粉状蛋白负荷 的等级顺序，与不同ApoE同种型影响斑块启动和/或生长的假设一致。然而，需要其它研 究以仔细分析ApoE介导的对已有淀粉状蛋白沉积和对现存神经变性的作用的机制。为了 克服这种在知识上的缺口，我们采用了基因转移方法，其中将表达各种等位基因（或 GFP对照）的腺伴随病毒载体注射到侧脑室中以主要转导室管膜，其然后作为生物工厂起 作用，以在脑脊液和间质液内递送ApoE。我们然后采用活体内多光子显微术追踪不同的 ApoE同种型对斑块形成、生长和在ApoE2的情况下对溶解的作用，以及采用体内微透析方 法监测ISF中的ApoE和AP生化变量，并采用阵列断层扫描术评价AP相关神经毒性的变 化。我们发现，ApoE同种型影响ISF中可溶性寡聚A 0的水平、A 0原纤化和沉积的步伐、 曾经形成的淀粉状蛋白沉积的稳定性、其清除和斑块周围神经毒性作用的程度。实际上，用 ApoE4治疗的AD小鼠显示可溶性A 0的量提高、原纤维状斑块的密度较高、突触成分丢失加 剧和各个沉积周围神经突营养不良的数目增加，而用Ap〇E2观察到相对的保护作用。这些 数据支持这样的假设，即也幻/等位基因主要通过A 0介导其对AD的作用，并强调ApoE为 治疗靶。
[0158] 结果 脑室内注射AAV4-AP0E引起脑中稳定的APOE表达和人ApoE的持续产生载脂蛋白E是一种天然分泌的蛋白质，主要通过星形细胞和小神经胶质细胞产生，可 在整个脑实质中扩散。我们利用这种性质将编码位^ (对照）或各个等位基因的AAV 血清型4注射入7月龄APP/PS1小鼠的侧脑室。考虑到受AD的特征性病变影响的大的脑 区，与多次实质内注射相比，该策略提供大的优势。
[0159] 在注射后2个月，在内衬脑室的脉络丛和室管膜中检出转导细胞，因此证实了 AAV4载体的功能性。使用对各物种有特异性的抗体，通过ELISA (图9A、9B和15A)和蛋白 质印迹还检出人和鼠ApoE蛋白两者。我们发现，人载脂蛋白E的浓度达到平均20 yg/mg 总蛋白质（图9A)，代表了约10%的内源性鼠apoE (图9B)。这种适中的额外量的人ApoE 的存在不会可检出地改变内源性鼠ApoE蛋白的水平（图15A)。在AAV4注射后2和5个月 之间观察到小但统计学上显著的降低（图15B)。虽然如此，与对照组相比，人蛋白质的水平 保持可检出，表明了 AAV4介导的转导提供在整个实质中持续产生分泌的重组蛋白的平台。 实际上，在整个皮质中在APP/PS1小鼠的淀粉状蛋白沉积周围可检出人ApoE蛋白，已知内 源性鼠ApoE蛋白在皮质中蓄积。
[0160] 接下来，我们评价了间质液（ISF)(-种还含有高生物活性的A0可溶性物类的 胞外区室）中人ApoE的存在情况。因为在整个脑裂解物中检出相对少量的ApoE，我们给几 种雄7〇万K0小鼠注射各AAV4-AP0E载体，并使用高灵敏度但非物种特异性抗体追踪人蛋白 质的存在。采用微透析技术，我们证实了雄7〇万K0注射动物的ISF中ApoE的存在。
[0161] 总的来说，这些数据证实，单次AAV4脑室内注射足以导致目标蛋白质在整个脑实 质中和在ISF内的持续产生，且室管膜/脉络丛可用作"生物泵"以将潜在治疗性的蛋白质 递送到脑中。
[0162] ApoE同种型的输注差异性地影响淀粉状蛋白肽和斑块沉积 在安乐死前，APP/PS1小鼠用表达GFP或各种ApoE同种型的载体转导5个月。淀粉状 蛋白斑负荷的分析显示，5个月后，与表达AP0E2的相比，在注射AAV4-AP0E4的动物的皮质 中观察到淀粉状蛋白沉积的密度显著增加。AAV4-GFP和AAV4-AP0E3治疗小鼠中的斑块密 度在中间水平上彼此无不同（图16A)。
[0163] 从甲酸提取物测量的AP 4(|和AP 42肽的浓度酷似淀粉状蛋白斑含量中观察到的变 化，使得5个月后表达也似5￥等位基因的小鼠中发现淀粉状蛋白肽的浓度提高（图16B)， 用检出相反的作用。TBS-可溶性级分中AP 4(|和AP 42肽的含量类似地受注射各种 AAV-AP0E影响（图16C)。另外，聚集的AP肽和可溶性AP肽间的比率在ApoE暴露时保 持不变，因此表明各种不同的人ApoE同种型的过量表达同时调节原纤维状淀粉状蛋白和 可溶性淀粉状蛋白物类两者。
[0164] 持续仅2个月的各个ApoE同种型过量表达，导致比5个月研究中观察到的小的作 用。然而，观察到与其它实验组相比，AAV4-AP0E4注射小鼠皮质区内淀粉状蛋白斑密度的 显著增加（图16A)。这与甲酸级分所含A 0的量是相似的（图16C)，证实了该特定变体的 支配作用。TBS-可溶性A 0 4(|/42物类仅显示当AAV4-AP0E2或AAV4-AP0E4分别表达2个月 时趋于较低或较高的趋势（数据未显示）。
[0165] 为了测定人ApoE同种型的存在是否可反映AP原纤化程度的早期变化，在注射后 2个月，我们还测量了使用BamlO (标记所有淀粉状蛋白沉积）和Thio-S (只染色致密中 心）针对AP的稳固免疫染色之间的比率。在3个同种型中未检出变化，这就表明在这个 时限内在实验组间，对致密和弥散性淀粉状蛋白沉积群的分布没有差异性作用（图16B)。 这些数据表明，较长暴露于ApoE变体比较短暴露对淀粉状蛋白沉积具有较强的作用。
[0166] 已表明，ApoE在A0跨越血脑屏障的转运中起作用。为了测试暴露于ApoE同种 型是否可调节A 0肽通过血脑屏障的流出，测量了每只经注射的动物血浆中A 0 4(|的浓度。 我们观察到与AAV4-AP0E2和AAV4-GFP相比，脑室内注射AAV4-AP0E3和AAV4-AP0E4小鼠 两者中人A 0的血浆含量较低（图10D)。这表明了 E3和E4变体两者有助于保留A 0在中 枢神经系统区室中，与所观察到的脑实质中AP的浓度相对增加和表明因ApoE所致A3的 半寿期延长的之前数据一致。
[0167] 也似^带者更易感神经血管功能障碍，且最近表明血脑屏障损坏甚至在淀粉 状蛋白沉积不存在时都偏好于AP0E4转基因小鼠。为了评价APP/PS中脑室内注射的 AAV4-AP0E是否会损害BBB的完整性，进行了用普鲁士蓝进行的死后染色。尽管在所有组中 存在稀疏分布在脑中的少量含铁血黄素阳性局灶区，但在任何的动物实验组间未观察到明 显差异。
[0168] ApoE同种型的表达调节淀粉样变进展的动力学 Ap〇E4与淀粉状蛋白沉积密度增加有关，而在5个月后用Ap〇E2观察到相反的作用。这 可能反映出淀粉状蛋白0沉积、清除的速率或两者的变化。为了评价ApoE变体如何影响 淀粉样变的动态进展，我们采用体内双光子成像，并跟踪淀粉状蛋白斑形成和清除的动力 学。小鼠在7月龄时接受AAV4载体的脑室内注射，注射后一周植入颅窗以进行第一成像时 段（T0)。在1 (T1)和2个月（T2)后，在相同视场中使淀粉状蛋白沉积成像。对小鼠处予 安乐死，用于第二成像时段后的死后分析。
[0169] 绝大部分的淀粉状蛋白沉积保持稳定，尽管在2个月时间内在小的观察体积内可 检测到偶尔的新斑块。此外，在极少情况下，在1或2个月后，可能无法检出在实验开始时成 像的甲氧基阳性斑块，表明了一些斑块可能被清除。随着时间推移，我们观察到淀粉状蛋白 沉积的体积密度总体增加，在T2时的密度平均起来大于T1的密度23%。淀粉状蛋白进展的 速率在ApoE4治疗的APP/PS1小鼠中较快，而2个月后，相对于GFP (0. 66)、ApoE3 (0. 67) 和Ap〇E4 (0. 74)，Ap〇E2暴露的动物的淀粉状蛋白沉积密度显著降低（图11A，11B)。重要 的是，Ap 〇E2变化反映了自基线降低，首次直接表明斑块的非免疫介导的活性清除。与获自 AP0E转基因动物的数据形成对比，这些结果证实，甚至在已开始淀粉状蛋白沉积后，ApoE 的量的适度增加的诱导可影响进行中的促淀粉状蛋白生成过程。
[0170] 我们接下来通过测量T1/T0和T2/T1间各个沉积的横截面积的比率，评价了单个 淀粉状蛋白斑生长。在T1 (比率T1/T0)时，但未在T2 (比率T2/T1，图12)时在组间检出 差异，表明了人ApoE变体的存在主要影响在暴露后头个月期间的斑块生长，但是该参数之 后没有不同。具体地讲，与Ap 〇E2和Ap〇E3两者相比，在Ap〇E4治疗小鼠中淀粉状蛋白沉积 的大小长得显著更大，表明了不仅斑块的数目还有其大小都被该等位基因加剧。因此Ap 〇E4 影响A0肽的孕育以及预存斑块的大小。
[0171] 与Ap〇E2相比，Ap〇E3mAp〇E4同种型使淀粉状蛋白沉积周围的突触密度变差 突触丢失是与认知缺损最佳相关的参数。我们最近表明，Ap〇E4的存在与人AD患者 脑中较高水平的突触寡聚A0有关，并且与Ap〇E3相比，导致淀粉状蛋白斑周围的突触密 度显著降低（R. M. Koffie 等，Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer's disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-beta (突角生毒性寡聚淀粉状蛋 白介导阿尔茨海默病中的载脂蛋白E4作用）.5rai/?135，2155 (Jul，2012);T. Hashimoto 等，Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases the Oligomerization of Amyloid beta Peptide (载脂蛋白E,尤其载脂蛋白E4增加淀粉状蛋