具有抗肿瘤活性的厚壳贻贝多糖类化合物的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的厚壳贻贝中所含的多糖类化合物的制备方法，同时，还涉及该糖苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]贻贝是海产双壳贝类，俗称青口、海红，其干制品统称淡菜，除含有丰富的氨基酸、糖类、蛋白质及维生素外，还含有丰富的微量元素一硒。贝类提取物具有抗肿瘤，增加机体免疫功能，降血脂，抗衰老及抗病毒和抗菌功能；新近报道贻贝具有较高的修复DNA损伤的作用，故有望研制出抗肿瘤药物新成分；贻贝足腺细胞分泌的粘液蛋白含有的贻贝粘着蛋白(属糖蛋白类)为超强度粘液的研发等。贻贝不仅有很高的营养价值，还具有很好的药用和食疗功效，又是补肾良药，药效明显。我国沿海所产的食用贻贝主要有紫贻贝、厚壳贻贝和翡翠贻贝等。目前国内外研究对贻贝蛋白质如过氧化物歧化酶、凝集素等的分离提纯及功能进行了一定研究，但对于贻贝多糖的研究不多。
[0003]从东海厚壳贻贝中分离纯化而来的贻贝多糖具有有明显的增强机体免疫力作用及体内抗肿瘤等作用。对肿瘤细胞H0-8910、MCF-7、K562及SMMC-7721均有显著抑制增殖作用。徐红丽等采用热水提取我国东海厚壳贻贝粗多糖，DEAE-Sepharose、Sepharose CL-6B柱层析进一步分离纯化得到贻贝多糖纯品MP-1。用MTT法进行体外抗肿瘤活性的研究。结果表明贻贝多糖纯品MP-1主要由葡萄糖组成，对体外多种肿瘤细胞均有不同程度抑制作用(参见文献:徐红丽，郭婷婷，郭一峰，张建鹏，冯伟华，焦炳华。贻贝水溶性多糖MP-1的分离纯化及体外抗肿瘤活性研究[J].第二军医大学学报，2006，27 (9) =998-1001.)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有多糖提取方法脂类干扰以及最终多糖得率不高的缺点，提供一种新的我国东海厚壳贻贝所含的多糖类化合物的制备方法；本发明的第二目的是提供依据上述方法制备得到的厚壳贻贝多糖类化合物；本发明的第三目的是提供该多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0006]本发明的第一方面，本发明提供了厚壳贻贝多糖类化合物的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0007]A.粗制品制备
[0008]新鲜贻贝软体组织匀浆，1%甲醇间歇搅拌浸泡24h去脂，离心取沉淀。加水煮沸5h，抽滤，残渣重复加水煮沸3h，抽滤，合并滤液。旋转蒸发50°C减压浓缩滤液。0.5%活性炭脱色，离心去沉淀。加乙醇至终浓度75%，4°C静置醇沉过夜。离心收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于水，Sevage法除蛋白，混合液磁力搅拌，分液漏斗静置分层，弃下层有机溶剂相。反复8次，至界面无白色沉淀。旋转蒸发50°C减压浓缩上层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻干燥得粗多糖。
[0009]B.精制品制备
[0010]将粗多糖溶于蒸馏水，离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml。上DEAE-S印harose F.F XK-50离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液。苯酚-硫酸法(1:5)跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止(480nm处测定OD值，绘制洗脱曲线)。真空冷冻干燥浓缩多糖洗脱液，得到多糖提取物半纯品。多糖提取物复溶于蒸懼水，离心弃沉淀，浓度约0.2g/ml,上SepharoseCL-6B凝胶制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止。重复上Sepharose CL-6B凝胶制备柱,至HPLC检测呈单一对称峰。真空冷冻干燥得到多糖精制品。
[0011 ] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
[0012]本发明的第二方面，是提供了依据上述方法制备得到的厚壳贻贝多糖类化合物。
[0013]本发明的第三方面，是提供了上述的多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014]所述的抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞NF-κ B p65基因表达而起作用的。
[0015]本发明对所述的贻贝多糖进行了体内外抗肿瘤活性的检测，证明本发明化合物具有良好的抗肿瘤活性。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
[0017]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0018]下述实施例中的生物材料和主要试剂购自国药集团上海分公司。
[0019]实施例1:从厚壳贻贝中分离纯化多糖类化合物
[0020]厚壳贻贝由浙江省嵊泗县翔远水产有限公司提供，采自浙江省嵊泗县贻贝养殖水域。
[0021]取新鲜贻贝软体组织700g，组织捣碎机匀浆，加1L1%甲醇间歇搅拌浸泡24h去脂，5000rpmX 1min离心取沉淀。加水5L,搅拌、煮沸5h,抽滤,残洛重复加水煮沸3h,抽滤,合并两次滤液。旋转蒸发50°C减压浓缩滤液。0.5%活性炭脱色，5000rpmX 1min离心去沉淀。加乙醇至终浓度75%，4°C静置醇沉过夜。8000rpmX 1min离心收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于250ml水，Sevage法除蛋白(V样品:V氯仿:V正丁醇=20:4:1)，混合液磁力搅拌0.5h，分液漏斗静置分层，弃下层有机溶剂相(含大量蛋白)。反复4次，至界面无白色沉淀。旋转蒸发50°C减压浓缩上层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻干燥得粗多糖。
[0022]将粗多糖溶于蒸馏水，8000rpmX 1min离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml。上DEAE-S印harose F.F XK-50离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液。苯酚-硫酸法(1:5)跟踪检测收集多糖组分