一种牵牛子及其炮制品多糖提取物的制备方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种牵牛子及其炮制品多糖提取物的制备方法及用途，从属中药及天然药物领域。该多糖提取物具有抗氧化活性，可制备成天然抗氧化剂，用于预防治疗由氧化自由基引起的各种疾病，例如常见的癌症、糖尿病、动脉硬化、心血管系统疾病、免疫功能的降低、老年痴呆、关节炎、白内障等。
【背景技术】
[0002]牵牛子(黑丑，白丑,二丑)，系旋花科植物裂叶牵牛(Pharbitis nil)或圆叶牵牛(Pharbitis purpurea)的种子,味苦性寒有毒,归肺、肾、大肠经。生牵牛子偏于逐水消肿和杀虫。炒牵牛子(炮制品)可使毒性大大降低，使泻下作用缓和，功效偏于消痰涤饮和消食导滞，同时易于粉碎和煎出。现代研究发现牵牛子中的化学成分以牵牛子苷(树脂苷类)、有机酸、脂肪油为主，尚有少量的蒽醌、二萜类成分。近几年来的研究大都集中于牵牛子苷、有机酸类成分上，普遍认为牵牛子苷(树脂苷类)为牵牛子的重要药效物质基础，而对牵牛子及其炮制品多糖的研究未见报道。本发明通过深入的化学、体外药效学研究，发明了一种制备牵牛子及其炮制品多糖的方法，该方法操作简便，经济环保，且能得到较高纯度和含量的多糖组分；同时首次发现牵牛子及其炮制品多糖具有抗氧化活性，可制备成天然抗氧化剂，用于预防治疗由氧化自由基引起的各种疾病，如常见的癌症、糖尿病、动脉硬化、心血管系统疾病、免疫功能的降低、老年痴呆、关节炎、白内障等。这与牵牛子以往研究中牵牛子苷(树脂苷类)、有机酸类药效物质基础的研究是完全不同的。
【发明内容】
[0003]本发明主要目的是提供一种具有抗氧化活性的牵牛子及其炮制品多糖提取物。
[0004]本发明另一个目的是提供一种上述牵牛子及其炮制品多糖提取物的制备方法，牵牛子及其炮制品多糖提取物中总多糖的含量占各自提取物重量的百分比不低于70%，糖醛酸含量不低于9%。
[0005]本发明另一个目的是将上述牵牛子及其炮制品多糖提取物制成各种剂型的天然抗氧化剂，用于预防治疗由氧化自由基引起的各种疾病，如常见的癌症、糖尿病、动脉硬化、心血管系统疾病、免疫功能的降低、老年痴呆、关节炎、白内障等。
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]—种牵牛子及其炮制品多糖提取物的制备方法，其特征在于:牵牛子药材及其炮制品粉碎后，经过热水回流或超声水提取、醇沉、离子交换层析去除蛋白和色素，透析、冻干后制成较高纯度的牵牛子多糖提取物。
[0008]一种制备上述牵牛子及其炮制品多糖提取物的方法，其包括以下具体步骤:
[0009](I)将牵牛子及其炮制品粉碎；(2)用热水回流或超声水提取，过滤，收集滤液，浓缩；(3)在搅拌下向浓缩液中缓慢加入乙醇进行醇沉，静置，离心得沉淀；(4)沉淀分别用95%乙醇、丙酮和无水乙醇依次洗涤；(5)洗涤后的多糖沉淀加蒸馏水溶解透析，上弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂柱，去除多糖中的色素和蛋白质；(6)所得洗脱溶液经透析、冻干后制成牵牛子及其炮制品多糖提取物。
[0010]为了达到更好的提取效果，步骤(I)中将牵牛子及其炮制品粉碎，过20目筛；步骤
(2)中用3?10倍重量的蒸馏水热回流提取或超声辅助水提取，提取次数为2?4次，每次提取时间为2?4h，过滤合并滤液，后将滤液浓缩至药材0.2?1.0体积；步骤(3)中在搅拌下向浓缩液中缓慢加入90?95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，离心得沉淀；步骤(4)中将沉淀依次用2?4倍重量的95%乙醇、丙酮和无水乙醇分别洗涤；步骤(5)中的沉淀以2?5倍重量的蒸馏水复溶透析；步骤(5) (6)中用3.5 X 13Da?1.2 X 14Da的透析袋透析脱盐，透析时间为24?72h。
[0011]将从牵牛子及其炮制品中制备得到的多糖，用蒸馏水溶解后，经离子交换色谱柱DEAE-Cellulose (DE-52) DEAE-Sepharose F.F 进行分离，分别用 O ?Imol / L NaCl 溶液梯度洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，经苯酚硫酸法检测合并，选择以下葡聚糖凝胶柱进行进一步纯化:Sephadex G50> Sephacryl S100、Sephacryl S200> Sephacryl S300 和Sephacryl S400等(采用去离子水洗脱)。本发明牵牛子及其炮制品多糖提取物中总多糖的含量占各自提取物重量的百分比不低于70%，糖醛酸含量不低于9%，经以上步骤进一步纯化可以得到牵牛子及其炮制品多糖单体。
[0012]所述的牵牛子及其炮制品，经回流提取或超声提取，所得到的多糖提取物，对ABTS和DPPH自由基均具有较强的清除作用，提示其具有明显的体外抗氧化活性。牵牛子及其炮制品多糖提取物可制备成天然抗氧化剂，用于预防治疗由氧化自由基引起的各种疾病，例如常见的癌症、糖尿病、动脉硬化、心血管系统疾病、免疫功能的降低、老年痴呆、关节炎、白内障等。
[0013]本发明牵牛子及其炮制品多糖提取物可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、口服制剂(片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸)等。
【附图说明】
[0014]图1:苯酚硫酸法标准曲线(以葡萄糖为标准品)
[0015]图2:硫酸咔唑法标准曲线(以半乳糖醛酸为标准品)
[0016]图3:牵牛子多糖B1-B6过离子交换柱层析苯酚硫酸法描点图
[0017]图4:牵牛子多糖B2的红外光谱图
[0018]图5:牵牛子多糖B3的红外光谱图
[0019]图6:牵牛子多糖B4的红外光谱图
[0020]图7:牵牛子多糖B5的红外光谱图
[0021]图8:牵牛子多糖B6的红外光谱图
[0022]图9:经回流或超声水提取，牵牛子及其炮制品多糖对ABTS自由基的清除作用
[0023]图10:经回流或超声水提取，牵牛子及其炮制品多糖对DPPH自由基的清除作用
[0024]图11:牵牛子多糖提取物及各组分对ABTS自由基的清除作用
[0025]图12:牵牛子多糖提取物及各组分对DPPH自由基的清除作用
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0027]实施例1
[0028]取牵牛子原药材3kg，粉碎后，过20目筛，加蒸馏水8倍量，回流提取2次，每次提取时间为2h，过滤合并滤液，后将滤液浓缩至药材I倍体积，在搅拌下向浓缩液中缓慢加入95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，静置过夜，3000rpm / min离心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和无水乙醇分别洗涤，洗涤后的多糖沉淀加蒸馏水溶解装入截留量为3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberIiteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白质，用截留量为3.5X103Da的透析袋透析48h，冷冻干燥，得牵牛子多糖提取物。
[0029]实施例2
[0030]取牵牛子原药材3kg，粉碎后，过20目筛，加蒸馏水8倍量，超声提取2次，每次提取时间为2h，过滤合并滤液，后将滤液浓缩至药材I倍体积，在搅拌下向浓缩液中缓慢加入95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，静置过夜，3000rpm / min离心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和无水乙醇分别洗涤，洗涤后的多糖沉淀加蒸馏水溶解装入截留量为3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberliteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白质，用截留量为3.5 X 13Da的透析袋透析48h，冷冻干燥，得牵牛子多糖提取物。
[0031]实施例3
[0032]取牵牛子炮制品3kg，粉碎后，过20目筛，加蒸馏水8倍量，回流提取2次，每次提取时间为2h，过滤合并滤液，后将滤液浓缩至药材I倍体积，在搅拌下向浓缩液中缓慢加入95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，静置过夜，3000rpm / min离心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和无水乙醇分别洗涤，洗涤后的多糖沉淀加蒸馏水溶解装入截留量为3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberliteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白质，用截留量为3.5 X 13Da的透析袋透析48h，冷冻干燥，得牵牛子多糖提取物。
[0033]实施例4
[0034]取牵牛子炮制品3kg，粉碎后，过20目筛，加蒸馏水8倍量，超声提取2次，每次提取时间为2h，过滤合并滤液，后将滤液浓缩至药材I倍体积，在搅拌下向浓缩液中缓慢加入95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，静置过夜，3000rpm / min离心，沉淀依次用4倍量95%乙醇、丙酮和无水乙醇分别洗涤，洗涤后的多糖沉淀加蒸馏水溶解装入截留量为3.0X 13Da的透析袋中透析48h,上弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂柱(Amberlite FPA90C1+AmberliteIRC84)，去除多糖中的色素和蛋白质，用截留量为3.5 X 13Da的透析袋透析48h，冷冻干燥，得牵牛子多糖提取物。
[0035]实施例5:多糖含量的测定
[0036]精密称取葡萄糖标准品10mg，用蒸馏水配制葡萄糖标准溶液，浓度分别为0，0.00625,0.0125，0.025，0.05 和 0.1mg / mL。分别取上述溶液 1.0mL,加入 5 % 苯酚溶液1.0mL,摇匀后迅速加入5.0mL浓硫酸，充分混匀，置70°C水浴15min，室温放置1min后，于分光光度计490nm处，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对应的葡萄糖浓度值(mg / mL)为横坐标制作标准曲线(见附图1)，建立葡萄糖浓度与吸光度的线性回归方程:y=7.7578x+0.0316 (R2=0.9979)。每个样品溶液取1.0mL,按上述方法测定吸光度，由回归方程计算供试液中葡萄