去颈部周围毛发，再用碘酒酒精消毒颈部皮肤，并以消毒剪刀剪开颈部皮肤及皮下肌肉，暴 露喉管。另换二把消毒镊子翻动喉管下部组织，直至找到颁下腺（乳白色，左右各一），再换 一把消毒弯头镊子和剪刀将颁下腺分离出，置于灭菌组织研磨器内，在无菌条件下冰浴研 磨颁下腺制成KT 1病毒悬液，研磨液为含20%胎牛血清，2%双抗的PBS溶液；4°C下2000r/ min离心20min，取上清接种单层BHK-21细胞扩增病毒。取细胞扩增的病毒液以上述同法 在豚鼠颁下腺传3代，同时将第三代收获的病毒定名为CTN-181-SG株。
[0029] 三、空斑纯化
[0030] 将CTN-181-SG株在BHK-21细胞上空斑纯化，具体技术如下，将CTN-181-SG株做 KT1-KT5系列稀释接种于6孔板单层BHK-21细胞，每个稀释度做两孔，每孔接种0. 2ml， 同时加两孔稀释液做空白对照，轻轻摇匀，置于37°C、5% CO2培养箱中吸附1小时，取出六 孔板，每孔加入4ml中性红第一层覆盖物，置于35°C、5 % CO2培养箱中培养7天，7天后每 孔加入4ml中性红第二层覆盖物，置于35°C、5% CO2培养1天。挑出在细胞上形成的明显 可见的单个病毒空斑，共挑取20个空斑克隆，分别转移到单层BHK-21细胞，置于35°C、5% CO2培养箱中培养7天传一代，待细胞出现明显病变时收集病毒。将最后收集的病毒命名为 CTN-I-(1-20)，置-70°C冻存，见附图 1。
[0031] 实施例2、低残余神经毒力克隆株的筛选
[0032] -、方法
[0033] 1. 3周龄小鼠脑内神经毒力筛选
[0034] 将上述制备的CTN-l-(l-20)流水下快速融化，用2%胎牛血清的PBS从原液（10°) 做10'10'10'10'10'10、个10倍系列稀释，取10°-1(Γ 34组稀释剂量脑内途径分别 接种6只3周龄昆明种小鼠，0. 03ml/只，另取6只小鼠脑内接种PBS作为空白对照，第四 天观察有无非特异性死亡，观察14天，记录小鼠发病和死亡情况，并以四个稀释度的累计 死亡率计算克隆株的LD 5tl。取KT4-KT6稀释度病毒液及空白稀释液做同步空斑滴定，计算 PFU 值。
[0035] 2. 5日龄、10日龄、14日龄乳鼠脑内神经毒力筛选
[0036] 取3周龄小鼠脑内接种不致病克隆株。5日龄昆明种小鼠按窝随机分组，每窝5日 龄乳鼠组内随机分为2组（其中一组以剪尾区别），每组4-6只。从原液10°开始连续接种 4个稀释度（1〇°-1(Γ 3)，每个剂量脑内途径接种一组乳鼠，乳鼠攻击后逐日观察21天，并记 录死亡情况，统计第2天后死亡和呈典型脑症状的乳鼠。计算累计死亡率和相应的LD 5tl值， 同步进行空斑滴定。10日龄、14日龄小鼠脑内致病力实验同法进行。
[0037] 二、结果
[0038] 1. 3周龄小鼠脑内残余神经毒力
[0039] 3周龄小鼠脑内感染狂犬病毒后5-7天发病，发病小鼠呈麻痹型，出现弓背、毛发 竖立、后肢瘫痪、运动失衡等症状，10天左右达到死亡高峰，发病小鼠100%死亡，至14天 观察结束时有个别小鼠体重偏低，其余小鼠健存。19个克隆毒株对3周龄小鼠的脑内半数 致死剂量从0-3. 16Log(LD5tlA). 03ml)不等，有6个克隆毒株显示不致病，分别是CTN-1-2、 CTN-1-3、CTN-1-8、CTN-1-16、CTN-1-17 和 CTN-1-19,见下表 1。
[0040] 表I CTN-l-(l-20)号克隆株对3周龄小鼠的脑内神经毒力
[0041]
【主权项】
1. 一种狂犬病病毒减毒株的选育方法，其特征在于：选用与我国人用狂犬病疫苗生产 用毒种CTN-I-V株同源的CTN-181毒株作为亲本株，培育步骤至少包含： (1) CTN-181毒株在体外细胞系培养和动物体内组织的交替传代以及运用空斑纯化技 术进行克隆筛选； (2) 利用不同日龄小鼠脑内残余神经毒力筛选获得两株减毒株，分别命名为CTN-1-3 和 CTN-1-19 ; (3) CTN-l-3和CTN-1-19减毒株的扩增、滴定及检定； (4) 对减毒株CTN-1-3和CTN-1-19的全基因组序列测定，获得CTN-1-3全基因组序列 如SEQ ID NO :1所示，CTN-1-19株全基因组序列如SEQ ID NO :2所示。
2. 根据权利要求1所述的狂犬病病毒减毒株的选育方法，其特征在于：步骤（1) CTN-181毒株在体外细胞系培养和动物体内组织的交替传代以及运用空斑纯化技术进行克 隆筛选的具体操作方法为：亲本株CTN-181株在豚鼠颁下腺、叙利亚仓鼠肾细胞BHK-21交 替连续传3代，最后在叙利亚仓鼠肾细胞BHK-21细胞上挑取20个空斑，空斑呈针尖状，大 小直径在1mm，编号依次为CTN-I-(1-20)。
3. 权利要求1或2所述的选育方法获得的狂犬病病毒减毒株CTN-1-3,其特征在于： CTN-1-3全基因组序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 权利要求1或2所述的选育方法获得的狂犬病病毒减毒株CTN-1-19,其特征在于： CTN-1-19全基因组序列如SEQ ID NO :2所示。
5. 权利要求3所述的狂犬病病毒减毒株CTN-1-3在制备狂犬病口服活疫苗中的应用。
6. 权利要求4所述的狂犬病病毒减毒株CTN-1-19在制备狂犬病口服活疫苗中的应用。
【专利摘要】一种狂犬病病毒减毒株的选育方法，选用与我国人用狂犬病疫苗生产用毒种CTN-1-V株同源的CTN-181毒株作为亲本株，通过在体外细胞系培养和动物体内组织的交替传代以及运用空斑纯化技术进行克隆筛选；利用不同日龄小鼠脑内残余神经毒力筛选获得两株减毒株，分别命名为CTN-1-3和CTN-1-19；对减毒株的扩增、滴定及检定和全基因组序列测定，获得CTN-1-3全基因组序列如SEQ？ID？NO：1所示，CTN-1-19株全基因组序列如SEQ？ID？NO：2所示。本发明减毒株毒种残余毒力低、免疫原性良好和遗传稳定，已经达到或者超过了WHO关于候选毒株安全性和有效性的要求，适合作为狂犬病口服活疫苗的生产用毒种。
【IPC分类】C12N7-04, A61K39-245, A61P31-22
【公开号】CN104560897
【申请号】CN201510026449
【发明人】俞永新, 石磊泰, 邹剑
【申请人】中国食品药品检定研究院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月20日