一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的根瘤菌菌株及其筛选方法，具体地说是一种高效固氮紫花苜蓿根瘤 菌菌株及其分子标记筛选方法。
【背景技术】
[0002] 紫花苜猜，原名：紫苜猜，又名：苜猜，拉丁文名jet/icago saUra,豆科、属多年 生草木植物，根粗壮，深入土层，根颈发达，是一种适口性好、营养价值和开发价值很高的牧 草，业内有"牧草之王"的称号。紫花苜蓿的生长主要依靠根瘤菌与其建立共生关系共生固 氮完成的。研究表明，根瘤菌与紫花苜蓿共生关系的建立是细菌、植物及环境三方相互作用 的结果，所以无论是在紫花苜蓿的原产地还是引种地，只有接种适应于当地环境的根瘤菌 并与紫花苜蓿建立良好的共生关系，才能有效保证紫花苜蓿的高产。目前，为提高紫花苜蓿 产量,行业内主要通过以下两种方法来筛选菌株并接种生产的：第一、对分离紫花苜蓿的根 瘤菌进行接种生产，一般以所结根瘤数较多的菌株作为筛选的菌株；该方法对分离的菌株 未进行分类及剔除，所以筛选的菌株中部分可能不是根瘤菌菌株，而且从我们研究的结果 也显示了部分所结根瘤数多的植株其干重并不一定高，也就是固氮效果并不一定好；第二、 进行田间接种试验，仅依靠所结根瘤数和植物生长干重等来确定高效苜蓿根瘤菌菌株；这 种方法虽在适应当地土壤环境较第一种方法有些许改善，但是仍然存在筛选菌株不纯的问 题。可见，以上两种方法均依靠经验判断来筛选菌株，其方法欠科学、精准性差、所接种的根 瘤菌杂菌多、纯度低、固氮效率低，更主要的是应用于某些特定土壤环境(如中度和中低度 盐碱地土壤、滨海盐碱地、内陆盐碱地、南方酸性土壤，稻田土壤或山地土壤）等，难以与紫 花苜蓿建立良好的共生关系以实现紫花苜蓿的高产目标。因此，能够研发出一种高效固氮 根瘤菌菌株精准有效的筛选方法，并培育出适合于当地气候、土壤环境并与紫花苜蓿有效 匹配共生固氮的高效新菌株，是当前行业内积极探索的课题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是提供一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方 法，以解决现有筛选方法得到的根瘤菌菌株类型混杂、固氮效率低、应用于紫花苜蓿生产中 无法实现高产的问题。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株， 所述菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（SiflorAizoAiwa? ?6^700') 729-2-4,保藏单位 CGMCC，保藏号是CGMCC No. 9755,保藏日期2014年10月10日。保藏单位地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0005] 本发明所提供的高产紫花苜蓿根瘤菌菌株，其生物学特征如下：生长最适温度为 28°C，好氧性培养物，在YMA培养基上菌落呈半透明，乳白色，圆形，边缘薄，中间厚，稀薄， 生长时间48-72小时，菌落大小为3-5mm ;细菌菌体杆状，具有折光性强的羟脂酸颗粒，占细 胞的1/3体积，两端略圆，大小为2-3 ii mX 3-5 ii m，革兰氏阴性菌，革兰氏染色为红色。
[0006] -种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，包括以下步骤： (a) 对土壤种植的紫花苜蓿的根瘤进行取样，每颗根瘤经过分离和纯化获得一个菌株， 得若干菌株； (b) 将所述若干菌株进行16S rDNA序列测定，将所测菌株的序列与GENEBANK数据库中 根瘤菌类群的标准序列进行比对，将不属于根瘤菌类群的菌株剔除，将归属于根瘤菌类群 的菌株保留； (c) 将保留的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE的电泳图谱指纹测定，得原接种菌株图谱 类型； (d) 将保留的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，得菌体混悬 液； (e) 在花盆中盛放由所述土壤、蛭石和沙子组成的混合培养基，播种紫花苜蓿种子，待 种子发芽后，消毒，催芽至胚根为0. 5-1. Ocm时，即可将所述菌体混悬液中的菌株接种到种 子上；生长45天后，检测其单株的根瘤数和干重，以其所结根瘤数多和单株干重高为综合 选择目标，筛选出综合排名前5-10名的菌株； (f) 对步骤（e)筛选出的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，将 菌体离心收集,并悬浮于生理盐水中； (g) 在小区试验地点的土壤环境中播种紫花苜蓿种子，接种步骤（f)所获得的悬浮于生 理盐水中的菌株，待紫花苜蓿生长至开花初期，对植物单株干重、结瘤率以及氮含量进行检 测，以单株干重、结瘤率以及氮含量高为综合指标，筛选3-4株备选菌株； (h) 同时对步骤（g)小区试验地点种植的紫花苜蓿开花初期的根瘤取样，将所采集的菌 株进行全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记检测，将检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株 图谱类型比对，选出检测到的接种菌株图谱类型与原接种菌株图谱类型一致性最高的菌株 为高效固氮紫花苜蓿根瘤菌的预定菌株； (i) 通过检测的指标值验证判断步骤（h)的预定菌株与步骤（g)的备选菌株的对应性， 如果预定菌株为检测指标最理想的备选菌株，则为阳性，步骤（g)所筛选到的预定菌株即为 高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株；反之，若为假阳性，剔除，则选综合指标值次之的菌株与预 定菌株进行对应，以此类推，得到高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株。
[0007] 本发明中步骤（a)、步骤（e)和步骤（g)所述的土壤为普通土壤、酸性土壤、水稻土 壤、山地土壤或盐碱地中的一种。
[0008] 本发明中步骤（a)和步骤（g)所述的取样采用5点取样法，每个植株选择大颗的根 瘤3-5个。
[0009] 本发明中步骤（d)和步骤（f)所述的菌株斜面培养到对数生长期，所用的培养基 为YMA，培养基的pH值为6. 8 - 7. 2,培养温度为28°C，所述YM每升中含有：甘露醇10. 00g、 酵母粉 0? 80g、K2HPO4 0? 25g、KH2PO4 0? 25g、MgSO4 0? 12g、NaCl 0? IOg 以及琼脂粉 15. 00g。
[0010] 本发明中步骤（e)所述土壤、蛭石和沙子的比例为5:3:2。
[0011] 本发明中步骤（h)中通过检测的指标值验证判断步骤（g)筛选到的预定菌株是否 为阳性的评判方法是观察所检测到的紫花苜蓿的植物干重、结瘤率以及植物氮含量的值是 否出现明显偏低及异常的情况，如果明显偏低及异常则为假阳性。
[0012] 建议保藏方法：（1)盛有YM的试管斜面加质量浓度为0. 2%的CaCO3，室温保藏2 个月为限，4°C冷藏可保存6个月，（2)甘油管保藏：将YM培养的斜面菌体刮下，置于质量 浓度为20%甘油，-80°C可保藏2年。
[0013] 本发明以土壤中种植的紫花苜蓿的根瘤菌为取样前提，采用分子标记技术进行菌 株的剔除和选择，最终筛选出适合当地土壤环境及紫花苜蓿的高效固氮根瘤菌菌株；其方 法科学合理、简单易操作、能够较为快速和精准地筛选出适合于当地气候、土壤以及与紫 花苜蓿建立良好共生关系的高效固氮根瘤菌菌株。本发明所筛选到的中华草木犀根瘤菌 729-2-4,是一株能够与紫花苜猜建立良好的共生关系、固氮能 力强、适应性好的根瘤菌菌株，该菌株与紫花苜蓿匹配亲和性好，在接种于紫花苜蓿的生产 实践中，接种该菌株可使紫花苜蓿的种植产量得到显著提高。
【具体实施方式】
[0014] 下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0015] 实施例1 (1)采样及分离纯化：对河北沧州黄骅周边地区种植的紫花苜蓿，选择了长势较好且 健壮的植株，在紫花苜蓿开花初期进行根瘤的采样，每