用于制备安丝菌素的方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2005年12月12日和发明名称为"用于制备安丝菌素的方法" 的200580046871. 6号发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于制备安丝菌素的工艺。安丝菌素是指具有不同的C-3酯侧链的安 丝菌素的混合物。安丝菌素能转变成C-3美登木醇（maytansinol)。
【背景技术】
[0003] 安丝菌素是微生物比如珍贵橙色束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum)发 酵产生的高细胞毒性的化合物。安丝菌素已被化学转变成含硫醇的美登木素生物碱 (maytansinoids)，该生物碱以细胞结合剂-美登木素生物碱偶联物的形式体现出的医疗 用途已经被报道（美国专利Nos. 5, 208, 020、5, 416, 064、6, 333, 410、以及6, 441，163)。
[0004] 用束丝放线菌（Actinosynnemaspp)菌株如珍贵橙色束丝放线菌的发酵工艺制备 多个在C-3处具有不同的酯取代基的安丝菌素品种（图1)。制备的各种C-3酯包括P-3 (异 丁酰）、P_3'（正丁酰）、P_2(丙酰）、P-4(异戊酰）、P-4'（正戊酰）。所有这些酯均可以 被还原分解成C-3美登木醇（P-0)，该醇是用于合成含硫醇美登木素生物碱的前体。此外， 还生成了少量的不希望有的安丝菌素，该安丝菌素在其他位置例如N-脱甲基、20-0-脱甲 基以及19-脱氯处被修饰。在还原性脱酰作用下，这些安丝菌素不生成美登木醇。
[0005] 通过发酵束丝放线菌制备安丝菌素的工艺已经被报道（美国专利 Nos. 4, 162, 940、4, 450, 234、4, 228, 239、4, 331，598 以及 4, 356, 265)。安丝菌素的产量一般 在12mg/L~100mg/L范围内随滴度而变化。典型地，通过多步骤工艺来回收并提纯安丝菌 素，该工艺包括向整个发酵培养液中添加助滤剂和有机溶剂，接着用石油醚浓缩有机层和 沉淀物。用硅层析和析晶进一步提纯沉淀物，接着通过重结晶或层析进一步纯化。
[0006] 因此，该工艺是繁琐的，并且包括多个其中剧毒材料必须被处理的步骤。于是，采 用这种工艺进行大规模生产非常困难。此外，在各个工艺步骤中还必须确保操作人员的安 全。
[0007] 最近的申请（US2002/0015984A1)要求保护用于安丝菌素制备工艺中的改进技 术。据报道，在发酵培养液中的安丝菌素的滴度是65~86mg/L。要求保护的改进技术包括 使培养液在75°C下热灭活、萃取到芳香烃溶剂比如甲苯中、通过开口硅柱层析、以及析晶。 为降低制备安丝菌素的成本，已经培养了新的束丝放线菌菌株，其比先前描述的那些菌株 具有显著提高的滴度（在发酵器中高达400mg/L)。先前描述的用于制备安丝菌素的工艺有 几个缺点，从而不适用于新开发的高产菌株。例如，培养液在75°C下热灭活导致安丝菌素发 生部分降解，从而损失10%~20%的产量。用芳香烃萃取包含较高含量安丝菌素的发酵培 养液效率低且不完全，这是因为安丝菌素在这种溶剂中的溶解度不高。在开口的自填充硅 柱（self-packedsilicacolumn)上纯化安丝菌素有两个缺点：1)在纯化和回收中的批次 变化，以及2)较高的人员暴露风险所产生的安全问题。因此，目前需要高产量地制备安丝 菌素，并提供一种用于高效率分离和纯化安丝菌素的工艺，同时最小化工人暴露于高毒性 药物的几率。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一是提供一种用于大规模发酵产安丝菌素的微生物的工艺，该工 艺尤其适用于新的能高产安丝菌素的菌株。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种用于分离粗安丝菌素和用于制备精制安丝菌素的 方法，包括如下步骤：
[0010] 1)任选的使培养液失活，例如将培养液加热到约50~55°C或添加1 %体积的氯 仿，2)用非芳香族有机溶剂萃取，3)浓缩萃取物，4)在硅柱或氧化铝柱上，优选在预填充硅 筒柱柱（pre-packedsilicacartridgecolumn)上纯化浓缩物，以及5)产物的析晶。 [0011] 本发明的其他目的包括如下内容：
[0012] 一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0013] 1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
[0014] 2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
[0015] 3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
[0016]4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
[0017]a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
[0018] b)析晶，
[0019]c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及 [0020] d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[0021] 一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0022] 1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
[0023] 2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
[0024]3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
[0025] 4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
[0026]a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
[0027]b)析晶，
[0028]c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
[0029]d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[0030] 一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0031]1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
[0032] 2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
[0033] 3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
[0034] 4)通过先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶来纯化安丝菌素。
[0035] 一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0036]1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
[0037]2)用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
[0038] 3)过滤以除去固体，从而允许有机相分离；
[0039] 4)从有机相中浓缩安丝菌素；以及
[0040]5)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
[0041] a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
[0042] b)析晶，
[0043] c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及 [0044] d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[0045] 一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0046] 1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
[0047] 2)采用各种离心技术，用不相溶于水的非芳香族溶剂从培养基中萃取安丝菌素；
[0048] 3)浓缩萃取的安丝菌素；以及
[0049]4)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
[0050] a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
[0051] b)析晶，
[0052] c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
[0053] d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[0054] 一种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0055] 1)在液体培养基中产制备安丝菌素的微生物；
[0056] 2)在有一种或多种水溶性有机溶剂存在的情况下，将培养液离心以除去固体，同 时在溶液中保留安丝菌素。
[0057]3)添加不相溶于水的非芳香族溶剂，从而允许将安丝菌素萃取至有机层中。在萃 取过程中，还可以视需要任选地向有机相中添加各种盐或其他组分。
[0058]4)浓缩萃取的安丝菌素；以及
[0059]5)通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来纯化安丝菌素：
[0060]a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
[0061]b)析晶，
[0062]c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
[0063]d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[0064] -种用于制备精制安丝菌素的工艺，其包括如下步骤：
[0065]1)在液体培养基中培养产安丝菌素的微生物；
[0066]2)任选地处理培养基以促进安丝菌素的萃取；
[0067]3)从培养基中将安丝菌素固相萃取到树脂上；
[0068]4)使用一种或多种有机溶剂，或者使用一种或多种含水的有机溶剂，从树脂中等 度洗脱或梯度洗脱安丝菌素；
[0069]5)浓缩萃取的安丝菌素；以及
[0070]6)任选地通过a)、b)、c)和d)中的任何一个来进一步纯化安丝菌素：
[0071]a)在硅胶或氧化铝上吸附层析，
[0072]b)析晶，
[0073]c)先在硅胶或氧化铝上吸附层析，然后析晶，以及
[0074]d)先析晶，然后在硅胶或氧化铝上吸附层析。
[0075] 在这些实施方式中，本发明可以任选地包括如下步骤：
[0076] (i)化学灭活或热灭活发酵培养液中的微生物；
[0077] (ii)在步骤2之前，处理培养基以促进溶剂萃取安丝菌素；或者
[0078] (iii)在沉淀前或沉淀后，进行洗绦步骤，其中用水、盐的水溶液、酸水溶液或碱水 溶液以任何顺序组合方式洗涤有机溶剂中的粗安丝菌素溶液。该步骤可以在各个纯化阶段 中进行。
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