生物合成1,3丁二烯的方法

生物合成1,3丁二烯的方法
【专利说明】生物合成1，3 丁二烯的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年11月30日提交的国际申请号PCT/US2012/067463(该申请要 求了 2011年12月2日提交的美国申请号61/566, 085和2012年10月17日提交的美国申 请号61/714, 883的优先权）的优先权；以及要求2012年6月15提交的国际申请号PCT/ 旧2012/042757(该申请要求了2012年10月17日提交的美国临时申请号61/714,883;2011 年12月2日提交的美国临时申请号61/566, 085和2011年6月17日提交的美国临时申请 号61/498, 408的优先权）的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
技术领域
[0003] 本发明涉及生物合成1，3-丁二烯的方法，更具体地涉及使用一种或多种分离的 酶如脱氢酶、单加氧酶、去饱和酶、脱水酶和脱羧酶，或者使用表达一种或多种此类酶的重 组宿主细胞合成1，3-丁二烯。
[0004] 背景
[0005] 1，3_ 丁二烯（下文称丁二烯）是用于产生包括苯乙烯-丁二烯-橡胶（SBR)、聚丁 二烯（PB)、苯乙烯-丁二烯乳胶（SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂（ABS)的合成橡胶、 腈橡胶和己二腈的重要单体，所述己二腈用于生产尼龙-66 (White,Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。
[0006] 丁二烯通常作为蒸汽裂解工艺的副产物而产生，其被蒸馏为粗丁二烯流并通 过萃取蒸馈纯化（White,Chemico-BiologicalInteractions, 2007, 166, 10-14)。已 专门采用其他方法制备丁二烯，通过n-丁烷和n-丁烯的脱氢反应（胡得利工艺）； 和n_ 丁稀的氧化脱氢反应（Ox〇-D或 0-X-D工艺）（White,Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。
[0007] 工业上，全球95 %的丁二烯生产是通过使用石化基原料如石脑油的蒸汽裂解 工艺进行的。考虑到较高的生产成本和较低的工艺收率，专门生产丁二烯是没有意义的 (White,Chemico-BiologicalInteractions, 2007, 166, 10-14)。鉴于对石化原料的依赖以 及对于专门生产丁二烯的高能耗催化步骤而言；生物技术通过生物催化提供了一种替代方 法。生物催化是使用生物催化剂如酶对有机化合物进行生物化学转化。
[0008] 因此，在这一背景下，很明显需要生产中间体特别是丁二烯的适宜方 法，其中所述方法是基于生物催化剂的（Jang等，Biotechnology&Bioengineeri ng，2012, 109(10)，2437 - 2459)。
[0009] 生物来源的原料和石化原料均是生物催化工艺可行的初始原料。
[0010] 在中碳链长度的酶底物中生成两个乙烯基是通过生物催化工艺合成丁二烯的关 键考虑因素。
[0011] 尚无任何已知的在原核生物或真核生物中合成丁二烯的酶途径。已提出的 由生物质-糖生产1，3-丁二烯的三个潜在的途径为：（1)由乙酰基-CoA通过巴豆 酰基-C〇A;(2)由赤藓糖-4-磷酸；和（3)通过丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合 反应。然而，尚无使用这些策略的信息报道（Jang等，Biotechnology&Bioengineeri ng，2012, 109(10)，2437 - 2459)。
[0012] 利用原核生物或真核生物合成的最为类似的化合物是2-甲基-1，3- 丁二烯（异 戊二烯），其具有短的5碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可以通过产生前体二甲基乙烯 基-PP的两条路线，即甲轻戊酸（mevalonate)和非甲轻戊酸途径合成〇(1^115^11^，13;[08(3；[. Biotechnol.Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)0
[0013] 甲羟戊酸途径引入了脱羧酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（下文称MDD)，其在 形成异戊二稀的前体中生成第一个乙烯基（Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Bioch em.，2002, 66(8)，1619-1627)〇
[0014] 因此，可以将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（EC4. 1. 1. 33)标记为在由非天然底物合成 丁二烯中的候选酶。
[0015] 在对与天然底物甲羟戊酸二磷酸相关联的3-甲基的作用的阐述中，已证实如 图12(a)所示的3-羟基-5-二磷酸戊酸的周转（turn-over)数KcatS〇. 23±0. (^[s-1]， 其与天然底物的名义8. 33 ±Us-1]相比显著降低（Dhe-Paganon等，Biochemist ry，1994, 33, 13355 - 13362)。此外，与底物的反应仅进行得远到3-羟基的磷酸化，即无 可检测的脱羧产物，这意味着与天然底物相比脱羧率降低了至少300倍。总而言之， 认为3-甲基在稳定碳阳离子过渡态中是不可或缺的（Dhe-Paganon等，Biochemist ry,1994, 33, 13355 - 13362)。
[0016] 已证实来自酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)的MDD酶接受3_羟基_3_甲 基-丁酸（图12(b))，其包括稳定碳阳离子过渡态的3-甲基，其是将所述底物转化为 异丁烯的底物。然而，与天然底物活性6. 4[ym0V(min?mg)]相比，该比活性显著降低 为 4. 8 ? 1CT6[ymol/(min?mg) ] (Gogerty&Bobik，Applied&EnvironmentalMicrobiolo gy,2010, 76(24), 8004 - 8010) 〇
[0017] 在催化裂隙周围的丝氨酸和精氨酸残基与天然底物甲羟戊酸二磷酸的磷酸基之 间关键的底物结合相互作用已被阐明。因此，在催化裂隙中正确的底物方向对酶活性是重 要的，这就合理地解释了当接受3-羟基-3-甲基-丁酸（图14 (b))作为底物时MDD具有 低活性（Barta等，Biochemistry, 2012, 51，5611-5621)〇
[0018] 与天然底物结合的3-甲基和焦磷酸基对于支撑MDD活性作用的重要性反对在由 不含这些关键基团的非天然前体合成丁二烯中使用MDD。
[0019] 异戊二烯合酶（下文称ISPS)在异戊二烯合成的最终前体二甲基乙烯基-PP中生 成第二个乙烯基。
[0020] 因此，可以将异戊二烯合酶（EC4. 2. 3. 27)标记为由非天然底物合成丁二烯的候 选酶。
[0021] 与MDD类似，与天然底物二甲基乙烯基-PP结合的3-甲基 在稳定碳阳离子中起重要作用，假定所述碳正离子是过渡态中间体 (Silver&Fal1，J.Biol.Chem.，1995, 270 (22)，13010 - 13016;Kuzma等，Current Microbiology, 1995, 30, 97 - 103)〇
[0022] 3-甲基对于支撑ISPS活性作用的重要性反对在由不含3-甲基的非天然前体合成 丁二烯中使用ISPS。
[0023]除了MDD和ISPS以外，微生物通常能够通过脱水酶、解氨酶（ammonialyase)、去 饱和酶或脱羧酶的活性在代谢物中生成乙烯基。然而，这些酶的活性很少能够催化末端乙 烯基的形成。脱水酶和解氨酶通常接受具有活化的氢原子的脂肪酸类似物或芳香族化合 物，其中芳香环作为吸电子基团。去饱和酶在脂肪酸合成中占支配地位，其在沿着长链脂肪 酸的固定的非末端位置产生不饱和键。继而，脱羧酶作用于末端的羧基，其在催化后通常留 下末端位置上结合的a官能团。因此，这些酶的相关酶促活性反对其在导致丁二烯合成的 短链或中链碳代谢物中产生末端乙烯基的用途。
[0024] 发明概述
[0025] 本申请至少部分地基于这样一个发现，有可能构建用于生产中链碳代谢物的生化 途径，在所述代谢物中能够形成两个乙烯基，从而导致丁二烯的合成。本申请所描述的这些 途径依赖于用于最终的酶促步骤的酶诸如MDD、ISPS和脱水酶。
[0026] 在本发明人的这个令人吃惊的发现之前，尚不知晓存在能够在中链碳代谢物中形 成两个末端乙烯基的酶或者其可以被生成以合成丁二烯。
[0027] 因此，在一方面，本申请提供了能够将丁二烯合成底物转化成丁二烯的酶。在 本申请中使用的术语"丁二烯合成底物"指如下的底物，所述底物的酶能够催化直接产生 1，3- 丁二烯或在经过一个或多个酶催化的反应后转化为1，3- 丁二烯的产物的反应。
[0028] 在一些实施方式中，导致合成丁二烯的第一个乙烯基是在4-草酰巴豆酸 (4_oxalocrotonate)、2-羟基粘康酸半酸（2-hydroxymuconatesemialdehyde)或 2_ 轻 基-6-氧代壬 _2, 4_ 二稀-1，9_ 二醋（2-hydroxy-6-〇xonona-2, 4-diene-l，9-dioate)中 酶促形成的，以生产2-氧代戊-4-稀酸（2-〇xopent-4_enoate)。见图2。
[0029] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在丙 酰基-CoA(propanoyl-CoA)、乳酰基-CoA(lactoyl-CoA)或 3-羟基丙 酰基-CoA(3-hydroxypropionyl_CoA)中酶促形成的，以生产丙稀酰 基-CoA(propenoyl-CoA)。见图 3〇
[0030] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在（R) 3-羟 基-戊酸（(R) 3-hydroxy-pentanoate)中酶促形成的，以生产3-羟基戊-4-稀酸 (3_hydroxypent-4-enoate)。见图 4。
[0031] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在戊-2-烯酰 基[acp] (pent-2_enoyl[acp])中酶促形成的，以生产2, 4-戊二稀酰基-[acp] (2, 4-pentadienoyl_[acp])。见图 5。
[0032] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在5-羟基戊酰 基-CoA(5-hydroxypentanoyl-CoA)(通过 5_ 羟基-戊 _2_ 稀酰基-CoA(5-hydroxy-pent-2-enoyl-CoAasintermediate)作为中间体）或戊 _3_ 稀酰基-CoA(pent-3-enoyl_CoA) 中酶促形成的，生产2, 4-戊二稀酰基-CoA(2, 4-pentadienoyl-CoA)。见图6。
[0033] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在4-羟基丁酰 基-CoA(4-hydroxybutyryl-CoA)、（R) 3_ 羟基丁酰基-CoA((R) 3-hydroxybutanoyl-CoA)或 戊稀二酰基-(>^&11^3(3〇1171-(>^)中酶促形成的，以生产巴豆酰基-(>^((^〇1:〇1171-(]〇八）。 见图7。
[0034] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在2-丁醇中酶促形成的， 以生产3-丁烯-2-醇。见图8。
[0035] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用分类为EC4. 1. 1.33 的酶甲轻戊酸二磷酸脱羧酶（mevalonatediphosphatedecarboxylase，MDD)形成的（图 9)。例如，利用两种或更多种酶连续转化2-羟基戊-4-烯酸；在通过脱羧的最后酶促转化 中直接产生丁二烯（图1，反应X)。
[0036] 在一些实施方式中，导致合成丁二烯的第二个乙烯基是利用分类为EC4. 2. 3. 27 的酶异戊二稀合酶（isoprenesynthase,ISPS)形成的（图10)。例如，可以利用一种或多 种酶由丁烯醇生成活化的丁烯醇（二磷酸酯）（图1，反应II);在通过脱磷酸化的最后酶促 转化中直接产生丁二烯（图1，反应III)。
[0037] 在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用分类为EC 4. 2. 1.-的酶脱水酶形成的，如芳樟醇脱水酶（linalooldehydratase)(EC4. 2. 1. 127)、奇 维酮水合酶（kievitonehydratase)(EC4.2. 1.95)、油酸水合酶（oleatehydratase)(EC 4. 2. 1. 53)或类胡萝卜素 1，2_ 水合酶（carotenoid1，2-hydratase)(EC4. 2. 1. 131)(图 11)。此类脱水酶接受羟基化的底物如丁烯醇。例如，可以在一个或多个酶促步骤中利用脱 水酶、水合酶、去饱和酶、脱氢酶或脱羧酶的活性由丁二醇、丁醇、丁烯、丁烯醛或C5烯醇生 成丁烯醇（图1，反应IV、V、VI、VII、IX);通过脱水在最后的酶促转化中直接生产丁二烯 (图1，反应I)。丁烯醇包括例如1- 丁烯-1-醇、2- 丁烯-1-醇和3- 丁烯-2-醇（见图 1)〇
[0038]例如，本申请提供了将丁烯醇转化为丁二烯的酶。这种转化可以利用单一的酶进 行，或者可以利用两种或更多种酶顺序作用进行（也就是说，例如第一种酶作用于四碳分 子以生产第一丁烯醇，然后该第一丁烯醇在第二个酶的作用下生产丁二烯）（参见例如图 1，反应I)。
[0039] 本申请还提供了由不饱和的羟基化四碳分子生产丁二烯的方法，所述方法包括至 少一个生物催化步骤。例如，在转化为丁二烯之前可以将丁烯醇活化为相应的丁烯醇二磷 酸酯（参见例如图1，反应II&III)。在一些实施方式中，所述丁烯醇选自由以下组成的组： 1 丁烯2醇、1 丁烯3醇、1 丁烯4醇、2 丁烯1醇、2 丁烯2醇、2 丁烯3醇或2 丁烯4醇。对 于丁烯醇如1- 丁烯-1醇、1- 丁烯-2醇、2- 丁烯-2-醇和2- 丁烯-3-醇而言，可以利用相 应的酮或醛如1- 丁醛或2- 丁酮在原位生成丁烯醇。
[0040] 在一些实施方式中，丁烯醇由选自由以下组成的组的四碳分子通过酶的作用生 产：丁二醇（1，4_丁二醇、1，3_ 丁二醇、2,3_ 丁二醇）（图1，反应IV)或丁醇（1-丁醇或 2_ 丁醇）（图1，反应V)或丁烯（1-丁烯或2-丁烯）（图1，反应VI)或丁醛如1-丁醛或 2-丁醛或者2-酮-丁-1-烯（图1，反应VII)。
[0041] 利用酶进行的反应可以是净脱水（即利用具有脱水酶活性的酶从分子中除去4〇， 反应IV)，利用具有去饱和酶活性的酶或酶的复合物的脱氢（即从分子中除去氢，这在由酶 催化的反应中导致所述分子的碳骨架去饱和）（反应V)，利用具有羟化酶活性的酶的羟基 化（即使用羟基取代氢），如烯烃单加氧酶或细胞色素P450或《 -羟化酶（反应VI)或利 用氧化还原酶/酮还原酶的还原，以便将丁醛或C4不饱和酮转化为丁烯醇。对于脱水步骤 而言，所述酶可以是与在用于将丁烯醇脱水成丁二烯的酶类别相同的酶类别，或者可以是 其他酶类的。在所述丁烯醇中的双键迀移可以由异构酶催化。
[0042] 本申请还提供了来自酶类4. 2. 1.-.的酶，其将丁二醇转化为丁烯醇（图1，反应 VIII)〇
[0043] 在一些实施方式中，丁烯醇如1-丁烯-4-醇由五碳分子如2-羟基戊-4-烯酸通 过脱羧酶（如来自EC4. 1.L-的脱羧酶）的作用生产（图1，反应IX)。还可以利用脱羧 酶或GHMP激酶将2-羟基戊-4-烯酸直接转化为丁二烯而不形成中间体丁烯醇（图1，反应 X) 〇
[0044] 在一些实施方式中，所述丁烯醇选自由以下组成的组：1 丁烯2醇、1 丁烯3醇、1 丁 烯4醇、2 丁烯1醇、2 丁烯2醇、2 丁烯3醇或2 丁烯4醇。对于丁烯醇如1- 丁烯-2醇、 2- 丁烯-2-醇和2- 丁烯-3-醇而言，可以利用相应的酮或醛如1- 丁醛或2- 丁酮在原位生 成所述丁烯醇。
[0045] 在一方面，本申请的特征在于一种生物合成丁二烯的方法。所述方法包括在丁二 烯合成底物中形成两个末端乙烯基。可以在丁二烯合成底物中酶促形成第一个乙烯基以生 产选自由以下组成的组的化合物：2-氧代戊-4-烯酸、丙烯基-CoA、（R) 3-羟基戊-4-烯酸、 2, 4_戊二條醜基-[acp]、2, 4_戊二條醜基-CoA、巴醜基-CoA和3_ 丁條_2_醇。
[0046] 在一方面，可以通过（i)使用分类为EC4. 1. 1. 77的4-草酰巴豆酸脱羧酶在4-草 酰巴豆酸中，（ii)使用分类为EC3.7. 1.9的2-羟基粘康酸半醛水解酶在2-羟基粘康酸 半醛中，或（iii)使用分类为EC3.7. 1.14的2-羟基-6-氧代壬-2, 4-二烯二酯水解酶 在2-羟基-6-氧代壬-2, 4-二烯-1，9-二酯中形成第一个乙烯基来生产2-氧代戊-4-烯 酸。可以通过使用分类为EC1.2.1.32的2氨基粘康酸半醛脱氢酶（2&111；[1101]111〇〇11&七6 semialdehydedehydrogenase)将2-羟基粘康酸半醛转化为2-羟基粘康酸，使用分 类为EC5. 3. 2. 6的2_羟基粘康酸互变异构酶（2-hydroxymuconatetautomerase)将 2_羟基粘康酸转化为4-草酰巴豆酸和使用分类为EC4. 1. 1. 77的4-草酰巴豆酸脱羧酶 (4-oxalocrotonatedecarboxylase)将4_草酰巴豆酸转化为2_氧代戊_4_稀酸来生产 2_氧代戊-4-稀酸。可以通过使用分类为EC1. 13. 11. 2的儿茶酷2, 3-双加氧酶（catechol 2, 3-dioxygenase)将儿茶酷转化为2-羟基粘康酸半醛来生产2-羟基粘康酸半醛。通过使 用分类为EC1. 14. 12. 1的邻氨基苯甲酸1，2_双加氧酶（anthranilate1，2-dioxygenase) 转化邻氨基苯甲酸或使用分类为EC4. 1. 1. 63的原儿茶酸脱羧酶（protocatechuate decarboxylase)转化原儿茶酸（Protocatechuate)生产儿茶酸。可以通过使用分类为 EC4. 1. 3. 27的邻氨基苯甲酸合酶（anthranilatesynthase)转化分支酸生产邻氨基苯甲 酸。可以通过使用分类为EC4. 2. 1. 118的3-脱氢莽草酸脱水酶（3-dehydroshikimate dehydratase)转化3_脱氢莽草酸（3-dehydroshikimate)生产原儿茶酸。
[0047] 在一方面，可以通过使用5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶，如由praH 编码的5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶转化5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛 生产2-羟基粘康酸半醛。可以通过使用原儿茶酸2, 3-双加氧酶，如由praA编码的原 儿茶酸2, 3-双加氧酶转化原儿茶酸生产5-羧基-2-羟基粘抗酸-6-半醛。可以通过 使用分类为EC1. 13. 11. 16的3-羧乙基儿茶酚2, 3-双加氧酶转化2, 3-二羟基苯基丙 酸生产2-羟基-6-氧代壬-2, 4-二烯-1,9-二酯。可以通过使用分类为EC1.3. 1.87 的3-(顺式-5, 6-二羟基环己-1，3-二烯-1-基）丙酸脱氢酶转化顺式_3_(羧基-乙 基）-3, 5-环-己二烯-1，2-二醇生产2, 3-二羟基苯基丙酸。可以通过使用分类为 EC1. 14. 12. 19的3-苯基丙酸双加氧酶转化3-苯基-丙酸生产顺式-3-(羧基-乙 基）-3, 5-环-己二烯-1,2-二醇。可以通过使用分类为EC1.3. 1.31的2-烯酸还原酶转 化E-肉桂酸生产3-苯基-丙酸。可以通过使用分类为EC4.3. 1.24的苯丙氨酸解氨酶转 化L-苯丙氨酸生产E-肉桂酸。
[0048] 在一方面，所述丁二烯合成底物可以是丙酰基-CoA。可以通过（i)使用分类为 EC1. 3. 8. 1的丁酰基-CoA脱氢酶或分类为EC1. 3. 8. 7的中链酰基-CoA脱氢酶在丙烯酰 基-CoA中，（ii)使用分类为EC4. 2. 1. 54的乳酰基-CoA脱氢酶在乳酰基-CoA或（iii) 使用分类为EC4. 2. 1. 116的3-羟基丙酰基-CoA脱氢酶在3-羟基丙酰基-CoA中形成第 一个乙烯基来生产丙烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC2. 1. 3. 1的甲基丙二酰基-CoA 羧基转移酶或分类为EC4. 1. 1.41的甲基丙二酰基-CoA脱羧酶转化（2S)-甲基丙二酰 基-CoA生产丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC5. 1.99. 1的甲基丙二酰基-CoA表异构 酶转化（2R)-甲基丙二酰基-CoA生产（2S)-甲基丙二酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 5. 4. 99. 2的甲基丙二酰基-CoA变位酶生产（2R)-甲基丙二酰基-CoA。
[0049] 可以通过使用分类为EC2.3. 1.-的2-酮丁酸甲酸裂解酶，如由tdcE编码的2-酮 丁酸甲酸裂解酶转化2-氧代-丁酸生产丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC4. 3. 1. 19 的苏氨酸解氨酶转化L-苏氨酸生产2-氧代-丁酸。
[0050] 可以通过使用丙醛脱氢酶，如由pduP编码的丙醛脱氢酶转化丙醇生产丙酰 基-CoA。可以通过使用分类为EC4. 2. 1. 28的丙二醇脱水酶转化1，2-丙二醇生产丙醇。
[0051] 可以通过使用分类为EC2. 3. 1.-的转移酶转化乙酰丙酰 基-CoA(levulinyl-CoA)由乙酰丙酸（levulinicacid)生产丙酰基-CoA。可以通过使用 分类为EC6. 2. 1.-的酰基-CoA合成酶或连接酶转化乙酰丙酸生产丙酰基-CoA。
[0052] 可以通过使用分类为EC2.8. 3. 1的丙酸CoA转移酶转化L-乳酸生产乳酰 基-CoA。可以通过使用分类为EC1. 1. 1. 27的L-乳酸脱氢酶转化丙酮酸生产L-乳酸。
[0053] 可以通过使用分类为EC3. 1. 2. 4的3-羟基异丁酰基-CoA水解酶转化3-羟基丙 酸或者通过使用分类为EC1. 1. 1. 59的3-羟基丙酸脱氢酶转化丙二酸半醛来生产3-羟基 丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC1. 2. 1. 75的丙二酸单酰基-CoA还原酶转化丙二酸 单酰基-CoA来生产丙二酸半醛。