一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及核苷酸类辅酶方法，尤其涉及一种β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法。
【背景技术】
[0002]β -烟酰胺单核苷酸(NMN)是辅酶I的合成底物，在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即变成辅酶I (NAD)。在生物体内NMN的水平和烟酰胺核苷酸腺苷转移酶(NAMPT)的活性直接影响到NAD的浓度，同时NMN直接参与体内腺苷转移，是体内重要的一种合成底物和功能调节物质。在治疗应用方面，NMN可以用于抗衰老、治疗慢性病等，同时研宄表明NMN还对胰岛素的分泌起到调节作用，对mRNA表达水平也有影响。因此，NMN在医药治疗方面有着广泛的应用前景，同时也作为一种反应底物在化工方面有着广泛的市场前景。
[0003]NMN 一般应用离子交换树脂进行纯化，由于其与多种类似物如NAD带电荷和极性极为相近，分离纯化有很大困难，无法将其中的类似物杂质完全去除，所以离子交换法获得的产品纯度只有60%左右，收率只有40%，生产效率低下，不适合规模化生产。
[0004]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0005]鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法，旨在解决烟酰胺单核苷酸的纯化过程中其他电荷和极性相近的类似物难以除尽，且产品纯度低、收率低的问题。
[0006]为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案:
一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，包括以下步骤:
a、将经过预处理的β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，收集浓缩的粗品溶液；
b、将获得的粗品溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的样品溶液；
C、将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸。
[0007]所述的β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中用于微滤的微滤膜孔径为 0.2-1 μπι。
[0008]所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中用于纳滤的纳滤膜，其截留分子量为200。
[0009]所述的β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中用于纳滤的纳滤膜为中空纤维膜。
[0010]所述的β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤a中浓缩的粗品溶液的浓度为 20-30g/Lo
[0011]所述的β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤c中纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后的浓度为100~150g/L。
[0012]所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤b中按体积比计，流动相A:流动相B为2:98-1: I之间。
[0013]所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤c中用于纳滤的纳滤膜为截留分子量为200的中空纤维膜。
[0014]所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其中，所述步骤b中，梯度洗脱时的洗脱时间为40min。
[0015]有益效果:本发明应用十八烷基硅烷键合硅胶进行高效液相制备，对烟酰胺单核苷酸进行纯化，使β -烟酰胺单核苷酸的纯度可以达到98%，收率可以到达80%以上，生产效率也比其他工艺提高了2倍以上。有效解决了烟酰胺单核苷酸的纯化过程中其他电荷和极性相近的类似物难以除尽的问题。
【具体实施方式】
[0016]本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0017]本发明一种β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法的较佳实施例，其包括以下步骤: S100、将经过预处理的β -烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，
收集浓缩的粗品溶液；
S200、将获得的粗品溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的样品溶液；
S300、将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。
[0018]本发明是采用反相高效液相色谱法对辅酶I的合成底物烟酰胺单核苷酸进行纯化，通过以固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为盐酸配制而成的溶液和乙醇的色谱柱进行纯化，再进一步浓缩及冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。本发明所述的β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法操作简单，且能有效除去其他带电荷和极性及其相似的类似物，使所制备出的烟酰胺单核苷酸纯度高、收率大、产量大，适用于大规模工业化生产。
[0019]优选地，所述步骤SlOO中用于微滤的微滤膜孔径为0.2-1 μ mo具体而言，本发明步骤SlOO中用于微滤的微滤膜孔径为0.5 μπι.微滤的基本原理是筛分过程，在静压差作用下滤除大于10 μπι的微粒，操作压力为
0.7-7bar,原料液在压差作用下，其中溶剂透过膜上的微孔流到膜的低压侧，大于膜孔的微粒被截留，从而实现原料液中的微粒与溶剂的分离。微滤过程对微粒的截留机理是筛分作用，决定膜的分离效果是膜的物理结构、孔的形状和大小。
[0020]本发明实施例中微滤时采用的微滤膜孔径为0.5 μπι，能初步清除β -烟酰胺单核苷酸粗品溶液中较大的微生物及大颗粒分子，微滤膜允许大分子和溶解性固体(无机盐)等通过，但会截留住悬浮物、细菌及大分子量胶体等物质，对β-烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行初步纯化。微滤膜的孔径过大，会使较大微生物和大颗粒分子透过微滤膜，影响初步过滤的效果；孔径过小，会导致β-烟酰胺单核苷酸也无法透过微滤膜，造成产品的损失。
[0021]另外，本发明所述步骤SlOO中用于纳滤的纳滤膜，其截留分子量为200。进一步地，本发明较佳实施例中采用的纳滤膜孔径为1.5nm,能够截留分子量为200的物质。
[0022]更优选地，所述步骤SlOO中用于纳滤的纳滤膜为中空纤维膜。
[0023]纳滤是一种允许溶剂分子或某些低分子量溶质或低价离子透过的过滤方法，其特点在于能在很低的压力下具有较高的除盐性能和截留分子量为数百的物质。本发明采用孔径为1.5nm的滤膜，其截留分子量为200，可以将分子量大于200的物质过滤出来，初步过滤掉烟酰胺单核苷酸中的杂质。并且，将中空纤维膜作为纳滤膜，中空纤维膜外表为纤维状，其具有自支撑作用，可以有效清除烟酰胺单核苷酸制备工艺中所产生的磷酸根残留和其他小分子杂质，使β-烟酰胺单核苷酸得到进一步纯化。
[0024]经过微滤和纳滤后，收集浓缩的粗品溶液，其浓度为20_30g/L。
[0025]本发明较佳实施例中，所述步骤S200中磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度为2%~5%，乙醇溶液的质量浓度为5%~30%.更优选地，所述步骤S200中磷酸溶液或盐酸溶液的体积用量为每毫升样品溶液加5-20毫升磷酸溶液或盐酸溶液，乙醇溶液的体积用量为每升流动相加100~400毫升乙醇溶液。
[0026]具体而言，磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度过高，会导致在梯度洗脱时洗出，若质量浓度过低，会影响物质的分离纯化效果，本发明中采用质量浓度为2%~5%的磷酸溶液或盐酸溶液，可以保证其在梯度洗脱时不被析出的情况下达到高度纯化β-烟酰胺单核苷酸的效果。
[0027]另外，改变酸的用量会影响峰形，从而影响到检测效果。本发明实施例中采用体积用量为每毫升样品溶液加5~20毫升的磷酸溶液或盐酸溶液，体积用量为每升流动相加100-400毫升的乙醇溶液，可以使峰形对称，减少拖尾现象。
[0028]本发明较佳实施例中，所述步骤S200用磷酸溶液或盐酸溶液将上一步骤所初步纯化的β -烟酰胺单核苷酸粗品溶液的pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，其流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇。
[0029]具体而言，反相高效液相色谱法中一般用非极性固定相(如C18、CS);而其流动相常为水或缓冲液，常加入甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间，其适用于分离非极性和极性较弱的化合物，并且PH会影响样品存在的状态，因而影响样品的保留时间。本发明实施例中采用盐酸配成的PH3-7的溶液和乙醇作为流动相，可以有效调节样品的保留时间，使样品从进入色谱柱到流出色谱柱的时间达到最优化，能使样品的分离效果良好。样品的保留时间过长，会使检测的灵敏度降低；样品的保留时间过短，会使烟酰胺单核苷酸与杂质的分离效果降低，影响烟酰胺单核苷酸的纯化。
[0030]流动相的pH值应该控制在2-8之间，pH值大于8时，可使载体硅胶即固定相溶解，pH小于2时，与硅胶化学键合相易水解脱落。本发明实施例中，pH值为3-7，此时β-烟酰胺单核苷酸能稳定存在，其内部结构不会被破坏，在此条件下，可以使样品的分离效果达到最优化。更优选地，本发明中的流动相的PH值为5，此时样品的纯化效果最佳。<