胞中。"异源的"核酸构建 体可以含有控制序列/DNA编码序列的组合，与天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列 的组合相同或不同。
[0061] 如本文中使用的，术语"载体"指设计用于在不同的宿主细胞之间转移的核酸构建 体。"表达载体"指具有在外来细胞中掺入和表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和 真核表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
[0062]因此，"表达盒"或"表达载体"是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列特殊 化的核酸元件，所述元件允许特定核酸在靶细胞中的转录。重组表达盒可以被掺入到质粒、 染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列外，表达载体的重组 表达盒部分还包括待转录的核酸序列和启动子。
[0063] 如本文中使用的，术语"质粒"指用作克隆载体的环状双链（ds)DNA构建体，其在 许多细菌和一些真核生物中形成染色体外自我复制的遗传元件。
[0064] 如本文中使用的，术语"编码可选择的标志物的核苷酸序列"指这样的核苷酸序 列，所述核苷酸序列能够在细胞中表达，并且可选择的标志物的表达赋予含有表达基因的 细胞在存在对应的选择剂或对应的选择性生长条件下生长的能力。
[0065] 如本文中使用的，术语"启动子"指发挥指导下游基因转录的功能的核酸序列。启 动子通常对表达靶基因的宿主细胞是合适的。启动子和其它转录和翻译调控核酸序列一起 (也称为"控制序列"），对表达给定基因是必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限 于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，以及增强子 或激活子序列。
[0066] 如本文中定义的，"嵌合基因"或"异源核酸构建体"指由不同基因的部分组成的非 天然基因（即，已经导入宿主中的基因），所述部分包括调控元件。用于宿主细胞转化的嵌 合基因构建体通常包括转录调控区（启动子），其与异源蛋白质编码序列有效连接，或者在 可选择的标志物嵌合基因中，与可选择的标志物基因有效连接，所述标志物基因编码赋予 转化细胞例如抗生素抗性的蛋白质。本发明的用于转化宿主细胞的典型的嵌合基因包括转 录调控区（组成型的或可诱导的），蛋白质编码序列和终止子序列。如果需要分泌靶蛋白， 则嵌合基因构建体还可以包括编码信号肽的第二DNA序列。
[0067] 当核酸被放置于与另一种核酸序列功能性的关系中时，核酸是有效连接的。例如， 如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则编码分泌前导子的DNA与多肽的DNA是有效连 接的；如果影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列是有效连接的；或者如果其位 置有利于翻译，则核糖体结合位点与编码序列是有效连接的。通常，"有效连接"意指DNA序 列的连接是连续的，并且在分泌前导子的情况下，是连续的且符合读框的。然而，增强子不 必是连续的。通过在常规的限制性位点连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常 规实践使用合成的寡核苷酸衔接头（adaptor)、接头或用于PCR的引物。
[0068] 如本文中使用的，术语"基因"意指在生产多肽链中涉及的DNA片段，可以或可以 不包括在编码区前后的区域，例如5'非翻译（5' UTR)或"前导"序列，和3' UTR或"非转录 尾区"序列，以及在单个编码片段（外显子）之间的间插序列（内含子）。
[0069] 通常，在中等至高严谨条件下，编码变体纤维素酶（例如CBH2)的核酸分子可以与 如本文中提供的野生型序列杂交，如SEQ ID N0:1。然而，在一些情况下，使用具有基本不 同的密码子选择的CBH2-编码核苷酸序列，而由CBH2-编码核苷酸序列编码的蛋白质则与 天然蛋白质具有相同或基本相同的氨基酸序列。例如，根据宿主使用的特定密码子的频率， 可以修饰编码序列有利于CBH2在特定的原核或真核表达系统中更快的表达（Te' 〇等人， FEMS Microbiology Letters, 190:13-19, 2000;例如，描述了用于在丝状真菌中表达的基 因优化）。
[0070] 如果在中等至高严谨的杂交和洗涤条件下，两条序列特异性的彼此杂交，则认为 核酸序列与参照核酸序列是"可选择性杂交的"。杂交条件基于核酸结合复合体或探针的解 链温度（Tm)。例如，"最高严谨度"通常发生在约Tm-5°C (低于探针的Tm 5°C)高严谨 度"发生在低于Tm约5-10°C ;"中等"或"中间严谨度"发生在低于探针的Tm约10-20°C ; 而"低严谨度"发生在低于Tm约20-25°C。功能上，最高严谨度条件可用于鉴别与杂交探针 具有严格同一性或近似严格同一性的序列，而高严谨度条件可用于鉴别与探针具有约80% 或更高序列同一性的序列。
[0071] 中等或高严谨度杂交条件是本领域普遍已知的（参见例如，Sambrook等人，1989， 第9和11章；以及Ausubel，F.M.等人，1993 ;通过引用明确的整合到本文中）。高严谨度条 件的实例包括在约42°〇下，在50%甲酰胺、5155(：、5倍06111^1肚'8液、0.5%503和10(^ 8/ ml变性载体DNA中杂交，然后在室温下，在2倍SSC和0. 5% SDS中洗涤2次，和在42°C下， 在0· lx SSC和0· 5% SDS中再洗涤2次。
[0072] 当对于例如细胞或核酸、蛋白质或者载体使用时，术语"重组"表示通过导入异源 的核酸或蛋白质，或者改变天然的核酸或蛋白质，来修饰细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所 述细胞是源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然（非重组）形式的细胞中 不可见的基因，或者表达另外异常表达的、低表达的或完全不表达的天然基因。
[0073] 如本文中使用的，涉及细胞的术语"转化的"、"稳定转化的"或"转基因的"意指细 胞具有整合到其基因组或作为在多个世代中维持的附加型质粒的非天然（异源的）核酸序 列。
[0074] 如本文中使用的，术语"表达"指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。过程包括 转录和翻译。
[0075] 在涉及向细胞中插入核酸序列时，术语"导入"意指"转染"或"转化"或"转导"， 并包括指代核酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可以被掺入到细胞的基因组 中（例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子或被瞬时表达（例如，转染 的 mRNA)〇
[0076] 因而术语"CBH2表达"指cbh2基因或其变体的转录和翻译，其产物包括前体RNA、 mRNA、多肽、翻译后加工的多肽及其衍生物，包括来自相关物种的CBH2,所述物种例如康 宁木霉（Trichoderma koningii)、红褐肉座菌（也称为长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉 (Trichoderma viride))和 Hypocrea schweini tzii。通过不例，CBH2 表达的测定包括用 于CBH2蛋白的Western印迹、用于cbh2mRNA的Northern印迹分析和反转录酶聚合酶链式 反应（RT-PCR)测定，以及磷酸膨胀纤维素 （Phosphoric Acid Swollen Cellulose, PASC) 和对-羟基苯甲酰肼（PAHBAH)测定，如下列中所述：(a) PASC : (Karlsson, J.等人， (2001)，Eur.J. Biochem, 268,6498-6507 ;Wood，T. (1988)在 Methods in Enzymology， 第 160 卷，Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose (Wood, W.& Kellog，S.编 著）中，第 19-25 页，Academic Press，San Diego, Calif. ,USA)和（b)PAHBAH:(Lever，M. (1972)Analytical Biochemistry, 47, 273 ；Blakeney, A. B. & Mutton, L. L. (1980)Journal of Science of Food and Agriculture, 31, 889 ；Henry, R. J. (1984)Journal of the Institute of Brewing, 90, 37)〇
[0077] 术语"可变剪接"指从单个基因产生多个多肽同种型的过程，涉及在一部分而并非 全部基因转录物的加工过程中，将不连续的外显子剪接到一起。因此，特定的外显子可以 与一些选择性外显子的任一个连接，形成信使RNA。可变剪接的mRNA产生多肽（"剪接变 体"），其中一些部分是相同的，而其它部分是不同的。
[0078] 术语"信号序列"指在蛋白质N末端部分的氨基酸序列，其有利于成熟形态的蛋白 质分泌到细胞外。成熟形态的胞外蛋白质缺少在分泌过程中切割掉的信号序列。
[0079] 术语"宿主细胞"意指含有载体，并支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻 译（表达）的细胞。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞， 例如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。通常，宿主细胞是丝状真菌。
[0080] 术语"丝状真菌"意指本领域技术人员认识的任何和所有的丝状真菌。优选的真菌 选自曲霉属（Aspergillus)、木霉属、镰孢属（Fusarium)、金小孢子属（Chrysosporium)、青 霉属（Penicillium)、腐质霉属（Humicola)、脉孢菌属（Neurospora)、或其可选的有性型如 裸孢壳属（Emericella)、肉座菌属（Hypocrea)。已证明无性的工业真菌里氏木霉是子囊菌 纲（ascomycete)红褐肉座菌的克隆衍生物（参见，Kuhls等人，PNAS, 93:7755-7760, 1996)。
[0081] 术语"纤维寡糖"指含有2-8个葡萄糖单元并具有β -1，4连接的寡糖基，例如纤 维二糖。
[0082] 术语"纤维素酶"、"纤维素分解酶"或"纤维素酶"指能够水解纤维素多聚物为较 短的纤维寡糖寡聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。已从纤维分解生物中，特别包括 真菌、植物和细菌中，获得了纤维素酶的多个实例，例如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解 酶、内切葡聚糖酶和葡糖苷酶。这类微生物制造的酶是这样的蛋白质的混合物，所述蛋白 质具有在将纤维素转化为葡萄糖中有效的三类作用：内切葡聚糖酶（EG)、纤维二糖水解酶 (CBH)和β -葡糖苷酶。这三类不同的纤维素酶协同作用，将纤维素及其衍生物转化为葡萄 糖。
[0083] 许多微生物制造水解纤维素的酶，包括木腐真菌木霉属、堆肥细菌高温单孢菌属 (Thermomonospora)、芽抱杆菌属（Bacillus)和纤维单胞菌属（Cellulomonas);链霉菌属 (Streptomyces);以及真菌腐质霉属、曲霉属和镰孢属。
[0084] 来自红褐肉座菌的CBH2是糖基水解酶家族6 (因而，Cel6)的成员，特别的是在红 褐肉座菌中鉴别的该家族的第一个成员（因而，Cel6)。糖基水解酶家族6既含有内切葡聚 糖酶，也含有纤维二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH2是后者。因此，词组CBH2、CBH2型蛋白 和Cel6纤维二糖水解酶在本文中可互换的使用。
[0085] 如本文中使用的，术语"纤维素结合结构域"指在纤维素酶或其衍生物的纤维素结 合活性中涉及的纤维素酶的部分氨基酸序列或酶的区域。纤维素结合结构域通常通过将纤 维素酶与纤维素、纤维素衍生物或其其它的多糖等价物非共价结合来发挥作用。纤维素结 合结构域通过结构迥异的催化核心区允许或有利于纤维素纤维的水解，而且通常独立于催 化核心发挥作用。因此，纤维素结合结构域可以不具有归因于催化核心的显著的水解活性。 换言之，纤维素结合结构域是纤维素酶蛋白质三级结构的结构元件，其不同于具有催化活 性的结构元件。纤维素结合结构域和纤维素结合组件在本文中可互换的使用。
[0086] 如本文中使用的，术语"表面活性剂"指本领域常规已知的具有表面活性性质的任 何化合物。因此例如，表面活性剂包括阴离子、阳离子和非离子型表面活性剂，例如常见于 去垢剂中的那些。阴离子表面活性剂包括线性的或分支的烷基苯磺酸盐；具有线性的或分 支的烷基或烯基的烷基醚硫酸盐或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯属磺酸酯；和烷 基磺酸盐。两性表面活性剂包括季铵盐磺酸盐和甜菜碱型两性表面活性剂。此类两性表面 活性剂在同一个分子中同时具有正和负电荷基团。非离子表面活性剂可以包括聚氧化烯醚 以及较高脂肪酸的链烷醇酰胺或其烯化氧的加合物、脂肪酸甘油单酯等。
[0087] 如本文中使用的，术语"含纤维素的织物"指由含棉或非棉的纤维素或含棉或非棉 的纤维素混合物制成的任何缝制的或非缝制合的织物、纱或纤维，包括天然纤维素制品和 人造纤维素制品（例如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和Iyocell)。
[0088] 如本文中使用的，术语"含棉的织物"指由纯棉或棉混合物制成的缝制的或非缝制 的植物、纱或纤维，包括棉机织织物、棉编织物、棉劳动布、棉纱、原棉等。
[0089] 如本文中使用的，术语"石洗（stonewashing)组合物"指用于含石洗纤维素的织 物的制剂。石洗组合物用于在销售前修饰含纤维素的织物，例如在生产过程中。相反，去垢 剂组合物意在用于清洁污损的衣物，不在生产过程中使用。
[0090] 如本文中使用的，术语"去垢剂组合物"指意图在用于清洗污损的含纤维素织物的 洗涤基质中使用的混合物。在本发明的上下文中，此类组合物除纤维素酶和表面活性剂以 外，可以包括其它的水解酶、增效剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和焚光染料、抗结块剂、掩 蔽剂、纤维素酶激活剂、抗氧化剂和加溶剂。
[0091] 如本文中使用的，术语"降低或消除cbh2基因的表达"意指已从基因组中缺失了 cbh2基因从而重组宿主微生物不能表达cbh2基因；或者cbh2基因或转录物已经被修饰使 宿主微生物不生产功能性CBH2酶或以显著低于未修饰的cbh2基因或转录物的水平生产。
[0092] 术语"变体cbh2基因"意指通过去除、添加和/或操纵编码序列，改变了来自红褐 肉座菌的cbh2基因的核酸序列。
[0093] 如本文中使用的，术语"纯化"通常指将含转基因核酸或蛋白质的细胞进行生物化 学纯化和/或柱层析。
[0094] 如本文中使用的，术语"活性"和"生物学活性"指与特定蛋白质相关的生物学活 性，在本文中可互换的使用。例如，与蛋白酶相关的酶活性是蛋白酶解，因而有活性的蛋白 酶具有蛋白水解活性。因而，给定蛋白质的生物学活性指本领域技术人员通常归因于蛋白 质的任何生物学活性。
[0095] 如本文中使用的，术语"富集的"意指相对于在野生型或天然存在的真菌纤维素酶 组合物中发现的CBH2浓度，发现纤维素酶（例如CBH2)的浓度更大。术语富集的、升高的 和增强的在本文中可互换的使用。
[0096] 野生型真菌纤维素酶组合物是由天然存在的真菌来源生产的组合物，包括一种或 多种BGL、CBH和EG组分，其中发现每种组分都是真菌来源生产的比例。因此，富集的CBH 组合物可以具有改变比例的CBH，其中CBH与其它纤维素酶组分（例如，EG、β -葡糖苷酶 和其它内切葡聚糖酶）的比例是升高的。可以通过本领域已知的任何方法增加 CBH或降低 (或消除）至少一种其它组分，来增加该比例。
[0097] 如本文中使用的，术语"分离的"或"纯化的"指核酸或氨基酸是从其天然相关的 至少一种组分中移出的。
[0098] 因此，作为示例，通过文献中已充分公开的已知分离技术，可以将天然存在的纤维 素酶系统纯化为基本纯的组分，所述技术包括在合适PH下的离子交换层析、亲和层析、大 小排阻等。例如，在离子交换层析（通常是阴离子交换层析）中，能够通过用PH梯度或盐 梯度或PH与盐梯度洗脱，分离纤维素酶组分。然后，可以将纯化的CBH添加到酶溶液中，获 得富集的CBH溶液。还可以使用分子遗传学方法过表达编码CBH的基因（可能组合缺失一 个或多个编码其它纤维素酶的基因），来提高微生物生产的CBH的量。
[0099] 真菌纤维素酶可以含有一种以上的CBH组分。不同的组分通常具有不同的等电 点，使得可以通过离子交换层析等将它们分离。在酶溶液中可以使用单个CBH组分，或CBH 组分