鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温 式RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭肝炎是鸭肝炎病毒（DHV)引起的一种传播迅速并对雏鸭具有高度致死性的病 毒病，以肝脏肿大及出血为主要发病症状。DHV根据血清型曾被分为I型DHV (DHV-1)、II 型DHV (DHV-2)和III型DHV (DHV-3)，但后来又发现，血清I型鸭肝炎病毒还存在两个变种， 分别是"台湾NDHV"变异株和"韩国NDHV"变异株，且这两个变异株均不与血清I型DHV产 生交叉中和反应。最新分类将血清I型DHV及其变异株重新更名为鸭甲肝病毒（DHAV)， 而原来的血清II型和III型DHV则被更名为鸭星状病毒1型（DAstV-I)和鸭星状病毒2型 (DAstV-2)，归属为星状病毒科。传统的血清I型DHV和"台湾NDHV"、"韩国NDHV"则被分 类为 DHAV-1、DHAV-2 和 DHAV-3。
[0003] 目前，我国流行的DHAV主要为DHAV-I和DHAV-3,由于DHAV-I和DHAV-3所导致的 鸭病毒性肝炎临床症状和病理变化非常相似，常常不能正确诊断和有效防控而给养殖业造 成巨大经济损失。虽然对DHAV-I和DHAV-3传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、 琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限 性，更不能有效鉴别是何种DHAV所造成的感染。
[0004] PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反 应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣 势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。二温式PCR是根 据经典PCR技术原理，对标准PCR进行改进，把退火和延伸合并为一个温度，比标准PCR退 火温度高，不仅提高了反应的特异性，更大大缩短了检测时间。然而，建立二重PCR方法比 单重要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好的 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒 1型和3型两种病原体。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭甲肝病毒1型和3型二重二温 式RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有 序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 4的碱基序列。
[0007] 引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1 : 0.5-1 : 1 : 1。
[0008] 引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为I : I : 1 : 1。
[0009] 上述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的非 诊断应用，PCR扩增的退火温度为60. 0-70. (TC。
[0010] PCR扩增的退火温度为65°C。
[0011] 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：
[0012] A液：PCR反应液，含2XTaq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、DHAV-1上下游引 物、0祖￥-3上下游引物、(1(1!120,0祖￥-1上下游引物分别是引物1和2,0祖￥-3上下游引物分 别是引物3和4,引物1至4分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 4的碱基序列；
[0013] B液：DHAV-1+DHAV-3模板，作为阳性对照；
[0014] C液：ddH20,作为阴性对照。
[0015] PCR 反应液含 2XTaq PCR Mix 12. 5 μ L、DHAV-I 上下游引物各 0· 5 μ 1、 DHAV-3上下游引物各0. 5 μ 1、CldH2O 7. 5 μ L，其中各引物浓度均为25 μ mol/mL ;Β液含 DHAV-1+DHAV-3 模板共 3 μ L，C 液为 2 μ L ddH20。
[0016] 上述鸭甲肝病毒I型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的非 诊断应用，PCR扩增的退火温度为60. 0-70. (TC。
[0017] PCR扩增的退火温度为65°C。
[0018] 针对目前缺乏对鸭甲肝病毒1型和3型同时进行检测和诊断的有效可靠的技术， 发明人研宄设计了两对特异性引物，据此建立了鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR 检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复 性好等优点，应用本发明可同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约 时间的成本，又可以减少污染。
【附图说明】
[0019] 图1是二重PCR敏感性试验结果电泳图，图中：M. IOObp DNA ladder， I. DHAV-lcDNA+DHAV-3cDNA (等体积混合），2. DHAV-lcDNA，3. DHAV-3cDNA，4. H5AIV 的 cDNA， 5. H9AIV的cDNA，6.番鸭呼肠孤病毒的cDNA，7.番鸭细小病毒的DNA，8.鸭圆环病毒DNA， 9.鸭副粘病毒的cDNA，10.鸭瘟病毒的DNA，11.阴性对照（CldH2O)。
[0020] 图2是二重PCR特异性试验结果电泳图，图中：M. IOObp DNA ladder，1.49ng DHAV-lcDNA 和 75ng DHAV-3cDNA，2.4.9ng DHAV-lcDNA 和 7.5ng DHAV-3cDNA，3.490pg DHAV-lcDNA 和 750pg DHAV-3cDNA，4.49pg DHAV-lcDNA 和 75pg DHAV-3cDNA，5.4.9pg DHAV-lcDNA 和 7. 5pg DHAV-3cDNA，6. 0· 49pg DHAV-lcDNA 和 0· 75pg DHAV-3cDNA。
[0021] 图3是二重PCR部分临床样品检测结果电泳图，图中：M. IOObp DNA ladder，I阳 性对照（DHAV-lcDNA+DHAV-3CDNA)，2-17分别为部分有目的条带的鸭病料检测结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
[0023] 鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所。
[0024] 鸭肝炎病毒（DHAV-I)记载在"鸭I型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立"， 中国预防兽医学报，2012,34(2): 112-115,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0025] 鸭肝炎病毒（DHAV-3)记载在"新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定"，广西畜牧兽 医，2003,19 (5) : 198-199,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0026] 番鸭细小病毒记载在"广西番鸭细小病毒的分离和鉴定"，广西畜牧兽医，2002， 18 (6) : 5-7,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0027] 鸭圆环病毒记载在"广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查"，中国畜牧兽医， 2010, 37 (11) : 156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0028] 鸭副粘病毒（鸭新城疫）记载在"鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法 的建立"，中国动物检疫，2012, 29 (5) :34-37,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0029] 番鸭呼肠孤病毒记载在"番鸭花肝病病原的研宄"，中国兽医科技，2003, 5(33): 7-8,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0030] H5亚型禽流感病毒记载在"H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立"， 南方农业学报，2013, 02:323-327,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。
[0031] H9亚型禽流感病毒记载在"多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流 感病毒方法的建立"，中国人兽共患病学报，2006,（09) : 858-860,公众可从广西壮族自治区 兽医研宄所获得。
[0032] 试剂：100bp Marker ladder、2XTaq PCR Mix、DNA/RNA 提取试剂盒、反转录试 剂均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司； pMD18T vector试剂盒购自大连宝生物公司。
[0033] 实施例1、引物的设计与合成
[0034] 根据GenBank中DHAV-13C基因与DHAV-3的VPO基因的保守序列，利用DNAStar 软件进行多序列比对，在保守区用primer 5.0设计引物。引物（见表1)由北京六合华大 基因科技股份有限公司合成。
[0035] 表1引物信息
[0036]
【主权项】
1. 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异 性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 4 的碱基序列。
2. 根据权利要求1所述的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，其特 征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1 : 0.5-1 : 1 : 1。
3. 根据权利要求2所述的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，其特 征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为I : I : 1 : 1。
4. 权利要求1所述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组在PCR扩增 方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为60. 0-70. (TC。
5. 根据权利要求4所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65°C。
6. -种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含 有以下试剂： A液：PCR反应液，含2XTaq PCR Mix、DHAV_l上下游引物、DHAV-3上下游引物、ddH20， DHAV-I上下游引物分别是引物1和2，DHAV-3上下游引物分别是引物3和4,引物1至4分 别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 4的碱基序列； B液：DHAV-1+DHAV-3模板，作为阳性对照； C液：ddH20,作为阴性对照。
7. 根据权利要求6所述的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，其 特征在于：所述PCR反应液含2XTaq PCR Mix 12. 5 y UDHAV-I上下游引物各0.5 yl、 DHAV-3上下游引物各0. 5 y 1、CldH2O 7. 5 y L，其中各引物浓度均为25 y mol/mL ;所述B液 含 DHAV-1+DHAV-3 模板共 3 y L，所述 C 液为 2 y L ddH20。
8. 权利要求7所述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增 方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为50. 0-60. 1°C。
9. 根据权利要求8所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65°C。
【专利摘要】本发明公开了一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测方法，实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-68, C12N15-11, C12Q1-70
【公开号】CN104862425
【申请号】CN201510322869
【发明人】谢芝勋, 赵虹, 谢丽基, 刘加波, 罗思思, 谢志勤, 邓显文, 黄莉, 黄娇玲, 曾婷婷
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月12日