20g/L，酵母粉10g/L，115°C灭菌 30min得到酿酒酵母种子培养基。
[0032] 2、配制木薯发酵培养基：将木薯干粉碎，过40目筛，加水调浆至木薯含量75g/L， 麸皮5g/L，121°C灭菌120min得到木薯发酵培养基。
[0033] 3、发酵工艺
[0034] (1)丙酮丁醇梭菌种子培养：将丙酮丁醇梭菌孢子悬液100°C热激90s，迅速冷却 至室温，以5%接种量接种于5% (m/V)玉米醪培养基中，37°C静置培养24h后，转接至5% (m/V)玉米醪培养基37°C静置培养12h，接种量5%。
[0035] (2)酿酒酵母种子培养：挑取一环Yro斜面保藏的酿酒酵母菌种，接种于50mL YPD 培养基中，30°C培养24h，转速160rpm。
[0036] (3)将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液同时接种于200mL木薯 发酵培养基中，接种量为5%，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，发酵温度为37°C， 发酵时间为l〇8h。
[0037] (4)采用气相色谱法测定发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇含量，色谱柱型号 DB-FFAP(30mX2. 5mm IDXO. 25uM)，载气为氦气，检测器为火焰离子化检测器，进样口和检 测器温度均为250°C，进样量为0. 5uL，分流比3 : 1，氢气流速30mL/min，空气流速为400mL/ min，柱温：初温60°C，停留0. 5min，终温170°C，升温速率20°C /min。发酵时间108h后，发 酵液中各溶剂浓度分别为丙酮5. 28g/L，丁醇11. 77g/L，乙醇5. 26g/L，总溶剂为22. 31g/L， 总溶剂得率为0. 338g/g。
[0038] 对比例1 :
[0039] 参考实施例1，不同之处在于采用不同的接种方式，发酵结果如表1所示。
[0040] 表1不同接种方式发酵结果比较
[0041]
[0042] 注：本实施例中所用木薯淀粉含量为80% ;单独接种培养基与混菌发酵培养基相 同，接种量均为5%。
[0043] 实施例2 :
[0044] 1、配制种子培养基：同实施例1。
[0045] 2、配制木薯发酵培养基：同实施例1。
[0046] 3、发酵工艺：
[0047] (1)丙酮丁醇梭菌种子培养：同实施例1。
[0048] (2)酿酒酵母种子培养：同实施例1。
[0049] (3)将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液接种至200mL木薯发酵培养基中，进行厌 氧发酵，培养温度为37°C，接种量为5%，发酵时间为24h。丙酮丁醇梭菌接种后24h，将培养 成熟的酿酒酵母种子液接种至丙酮丁醇梭菌木薯发酵培养基中，混合均匀，进行混菌发酵， 接种量为5%，发酵温度为30°C，发酵时间为108h。
[0050] (4)采用气相色谱法测定发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇含量，色谱柱型号 DB-FFAP(30mX2. 5mm IDXO. 25uM)，载气为氦气，检测器为火焰离子化检测器，进样口和检 测器温度均为250°C，进样量为0. 5uL，分流比3 : 1，氢气流速30mL/min，空气流速为400mL/ min，柱温：初温60°C，停留0. 5min，终温170°C，升温速率20°C /min。发酵时间108h后，发 酵液中各溶剂浓度分别为丙酮4. 66g/L，丁醇10. 71g/L，乙醇7. 65g/L，总溶剂为23. 02g/L， 总溶剂得率为0. 349g/g。
[0051] 对比例2:
[0052] 参考实施例2,不同之处在于采用不同的接种方式，发酵结果如表2所示。
[0053] 表2不同接种方式发酵结果比较
[0054]
[0055] 注：本实施例中所用木薯淀粉含量为80% ;单独接种培养基与混菌发酵培养基相 同，接种量均为5%。
【主权项】
1. 一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： a、 以木薯为碳源，将木薯原料粉碎，添加氮源、磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵 培养基； b、 将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于步骤a得到的木 薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇；丙酮丁醇梭菌种子液接种后第 〇_48h再接种酿酒酵母种子液，接种量为5% -10% ;厌氧发酵温度为30-37°C，厌氧发酵时 间为 24-108h。2. 根据权利要求1所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，木 薯发酵培养基中木薯浓度为75-275g/L。3. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，木薯发酵培养基补加的氮源或磷源选自以下之一或者其混合：玉米浆、玉米粉、麸皮、 米糠、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸 氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钠；氮源和磷源的添加量为木薯用量的 0% _20%〇4. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，所述培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液，是将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处理后， 迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37°C，培养时 间为 12-36h。5. 根据权利要求4所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，丙 酮丁醇梭菌种子培养基为玉米醪。6. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，所述培养成熟的酿酒酵母种子液，是将酿酒酵母菌种接种于酿酒酵母种子培养基中， 进行种子培养，培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h。7. 根据权利要求6所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，酿 酒酵母种子培养基为YH)培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，以木薯为碳源，添加氮磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵培养基；然后利用丙酮丁醇梭菌产生淀粉酶和糖化酶，对木薯发酵培养基糖化得到酿酒酵母可发酵性糖，从而避免商业淀粉酶和糖化酶带来的高昂成本；同时利用酿酒酵母发酵木薯糖化制得的酿酒酵母可发酵性糖生产丙酮、丁醇和乙醇，实现丙酮丁醇梭菌和酿酒酵母协作的混菌发酵，溶剂的得率有明显提高。本发明使用木薯原料进行丙酮、丁醇和乙醇的发酵法生产，实现非粮作物发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，对非粮作物液体生物燃料生产研究有重要意义。
【IPC分类】C12P7/16, C12P7/28, C12P39/00, C12R1/145, C12R1/865, C12P7/06
【公开号】CN104894207
【申请号】CN201510366702
【发明人】陈新德, 齐高相, 熊莲, 林晓清, 陈雪芳, 黄超, 程镜蓉
【申请人】中国科学院广州能源研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日