[116，3敵）溶液，再加纯净水6.95 KL使总体积达到20 μL，在37 °C条件下消化16~18 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像 拍照。
[0020] 1.5 PCR产物测序、序列比对与酶切位点确定 PCR产物通过凝胶电泳后，检出阳性结果的PCR扩增产物委托上海生工生物技术有限 公司进行克隆、测序。
[0021] 应用DNAMAN 5. 2. 2版软件对各个样品PCR产物序列进行整理分析，结果以MASED Document/DNAMANl格式输出，同时在GenBank中进行BLAST分析。应用NEBcutter 2. 0软 件进行限制性内切酶III酶切位点分析。
[0022] 5.结果分析 5. 1河豚鱼成分PCR检测结果 应用河豚鱼成分PCR检测引物（HT-I)对13个河豚鱼样品与5个非河豚鱼样品提取 的DNA进行河豚鱼线粒体特异性基因（分i WPCR扩增，结果表明，18个样品中3个样品无 PCR扩增产物，判为阴性结果，15个样品初步判为疑似阳性。图1中13个河豚鱼样品与2 个非河豚鱼样品（金枪鱼与鲈鱼）共15个样品检出PCR产物，为疑似阳性结果。另外3种 非河豚鱼类的大黄鱼、鳗鱼、带鱼与空白对照（CldH 2O)均未扩增出DNA条带，判为阴性结果。
[0023] 5. 2 PCR产物酶切图谱分析 15个检出河豚鱼成分疑似阳性结果的样品PCR产物及其经酶切消化后的产物电泳图 谱见图2。其中奇数号泳道为酶切消化后的产物电泳图谱，偶数号泳道为未经酶切的PCR产 物电泳图谱。图2Α与图2Β中9个已知学名与4个未知学名的的河豚鱼样品，在奇数号泳 道均检出酶切产物，各样品图谱相同，均有2条新的片段较小的条带，分别在300 bp与200 bp的下方。图2B可知，23、24号泳道分别为鲈鱼酶切与未经酶切的PCR产物，前者无新的 条带出现，29、30号泳道为金枪鱼的酶切与未经酶切的PCR产物，酶切的电泳图谱出现4条 新的条带，图谱与河豚鱼明显不同。可见，应用限制性内切酶MwA III酶切可以区别河豚鱼 与非河豚鱼，进而排除2个非河豚鱼的假阳性结果。
[0024] 从电泳图片2A与2B来看，所有疑似阳性样品的PCR产物酶切后残留PCR产物片 段条带位置都高于未经酶切处理的原PCR产物条带，出现该现象的原因是加入的限制性内 切酶(蛋白）与DNA结合，使得分子质量比原来纯DNA片段更大。毛细管电泳结果(本文略） 表明，经内切酶消化酶切后切断的与未切断残留的DNA片段，因结合了内切酶，其大小都比 实际的DNA片段大。
[0025] 产物的DNA序列与酶切位点分析 应用NEB cutter 2.0软件对13种河豚鱼与2种非河豚鱼(J卢鱼及金枪鱼）样品 的PCR产物碱基序列进行限制性内切酶酶切位点分析，结果表明，III酶切位点为 5'... GCCGAG (N)19 & NN'..3'。河豚鱼样品的PCR产物均为423个碱基(仅出示兔头飩 序列，其他种类河豚鱼DNA序列资料略III酶切位点都只有1个（图3)，在5'端起的 第256/254碱基位置，被切成2段，即电泳图出现的2条新带（图2)，大小为256/254 bp 与167/169 bp。金枪鱼PCR产物为422个碱基，III酶切位点有2个（图4)，分别在 5'.端起的第339/337碱基与252/250碱基的位置，被切成4段，大小为339/337 bp、83/85 bp与252/250 bp、170/172 bp (图2B第29泳道)。鲈鱼PCR产物为423个碱基，其序列 无 III限制性内切酶酶切位点（图5)，NEB cutter 2. 0软件无法生成酶切分析图，电泳 结果无新条带出现（图2B)，二者结果吻合。2个非河豚鱼样品中也能扩增出与河豚鱼相似 的PCR产物，出现假阳性现象，原因是，河豚鱼成分PCR检测所用的正向引物25个碱基，反 向互补20个碱基(表2)，结果正向引物有20个连续碱基、反向互补有10个连续碱基与7 个连续碱基分别与金枪鱼分? △部分片段序列两端互补，鲈鱼中也存在类似情况。
[0026] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，其特征在于：所述引物为HT-IF: 5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R:5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。2. -种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述方法包括如下：以优化后确立的DNA提 取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平 电泳与凝胶成像。3. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述的PCR产物 凝胶水平电泳与凝胶成像方法为在10ML的PCR产物中，加入2.OMLIOXCutsmart Buffer、1.0ML限制性内切酶肠eAIII、0. 05ML义腺苷甲硫胺酸溶液，再加纯净水6. 95 ML使总体积达到20ML，在37 °C条件下消化16~18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像 拍照。4. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：所述的DNA提取 CTAB方法为：称取100mg样品各两管于2. 0mL离心管中，加入600yL2 %CTAB溶液和 蛋白酶K15yL，经超声波处理5min;加入600yL三氯甲烷，13400I-Inirr1条件下离心 15min，取上清，加入2倍体积的0. 5 %CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约I. 5h;在13400 r.miiT1条件下离心25min，取沉淀，加入约400yLNaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yLRnase酶37 °C条件下温浴约1.5h;加入等体积的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇混合液， 三者的体积比为25 :24 :1，颠倒数次充分混合后，在13400r.HiirT1条件下离心15min，重 复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30s，充分混合 后，在13400r.HiirT1下离心15min;取沉淀，加入400yL70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬 于溶液中，在13400r^mirT1条件下离心洗绦沉淀10min;经DNA浓缩仪干燥10min，加 pH8.0、100yLTE在65 °C条件下溶解15min，放入4 °C冰箱保存待用。5. 根据权利要求2所述的一种河豚鱼物种鉴别方法，其特征在于：PCR扩增反应体系 为：2父131?〇?1&18七6-1叉10 1^，上下游引物（10 11]\〇各0.8 1^，0嫩模板量250叩， H2O为7.2yL，扩增程序为：94 °C预变性5min，94 °C变性30s，64 °C退火30s，72 °C延 伸30s，反应循环40次，最后72 °C延伸5min。
【专利摘要】本发明涉及一种河豚鱼物种鉴别方法，以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像；在10μL的PCR产物中，加入2.0μL 10× Cut smart Buffer、1.0μL限制性内切酶NmeA Ⅲ、0.05μL S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SMA）溶液，再加纯净水6.95μL使总体积达到20μL，在37℃条件下消化16～18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像拍照。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894254
【申请号】CN201510286313
【发明人】陈文炳, 翁国柱, 邵碧英, 缪婷玉, 江树勋, 彭娟
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月30日