34)。生物活性文库内的化 合物以1yM和0. 1yM检测。其它文库的化合物以10yM和1yM检测。在第二种基 于候选物的筛选方法中，包含了靶向胰发育所涉及的主要信号传导途径的小分子。
[0117]NKX6. 1/PDX1 筛诜 文库化合物在用于制备PE的基于bFGF的培养基配方（Ameri等2010) (RPMI1640Gibco#61870U2%K0SRGibco#10828,0. 1%PESTGibco#15140,64ng/mLbFGFPeprotech #100_18B)中进行筛选。
[0118] 文库PE筛选方法分为前期和后期（图1)。
[0119] 在前期，在PE培养基中检测化合物，持续PE分化的第一个7天，然后使用无化合 物的PE培养基继续分化另外6天。
[0120] 在后期，将DE细胞在PE培养基中分化，持续第一个7天。随后的6天，在PE培养 基中检测化合物。每个96孔板中包含12个阳性对照孔（PE培养基）和12个阴性对照孔 (无bFGF的PE培养基）。每天进行培养基更换。前期筛选中鉴定的命中在图2中说明并 在表1中列出。后期筛选中鉴定的命中在图3中说明并在表2中列出。
[0121] 候选物方法的化合物在未添加bFGF的基础培养基（RPMI1640Gibco#61870、 12%K0SRGibco#10828、0. 1%PESTGibco#15140)中筛选。该候选物方法筛选分为两部分 (图4)。在第一部分，PE分化的第一个8天，化合物以2天增量的时间间隔进行检测（暴 露于化合物中2天接着6天基础培养基或暴露于化合物中4天接着4天基础培养基或暴露 于化合物中6天随后2天基础培养基或暴露于化合物中8天）。
[0122] 这8天后将一个板固定并分析roxi和NKX6. 1表达。第二个板使用已发表的PE 方案（Ameri等（2010))进一步分化另外6天。
[0123] 在第二部分，DE细胞根据第一部分的命中化合物分化，接下来的6-10天在基础培 养基中检测化合物。
[0124] 基准方案（Ameri等（2010))用作对照。
[0125] 第一和第二部分实验中均每天进行培养基更换。
[0126] 候选物筛选方法中鉴定的命中在图5中说明，并且也包含在表1和2中。
[0127] 实施例2 -组合诱导NKX6. 1 /H)X1共表达的小分子命中 将候诜物筛诜方法的命中与f库方法的命中组合 将DE细胞暴露于 50nMLDN-193189 中 4 天，接着AM580 (AHDiagnostics,BMLGF104 0025)、JNK抑制剂II(Calbiochem, 420119)、50nMLDN-193189 和 64ng/mlFGF2,或 AM580、JNK抑制剂II、50nMLDN-193189、64ng/mlFGF2 和IWP2,或AM580、JNK抑制剂II、 50nMLDN-193189、64ng/mlFGF2和环巴胺中8天（图6)。每天进行培养基更换。
[0128] 实施例3 -在人诱导多能干细胞中诱导NKX6. 1/H)X1共表达的小分子的确认 命中化合物（表1和2)在用于制备PE的基于bFGF的培养基配方（Ameri等2010) (RPMI1640Gibco#61870、12%K0SRGibco#10828、0.1%PESTGibco#15140、64ng/mLbFGF Peprotech#100_18B)中进行筛选。
[0129] 筛选分为前期和后期（图1)。在前期，在PE培养基中检测化合物，持续PE分化的 第一个7天，然后使用无化合物的PE培养基继续额外的6天。在后期，将DE细胞在PE培 养基中分化，持续第一个7天。随后的6天，化合物在PE培养基中检测。每个96孔板中包 含12个阳性对照孔（PE培养基）和12个阴性对照孔（无bFGF的PE培养基）。每天进行 培养基更换。
[0130] 超过200%效果的值归类为命中（图2和图3)。
[0131] 表1显示前期命中化合物 与PE培养基相比，提高NKX6. 1/H)X1双阳性细胞分数超过200%的化合物。列出了文 库、化合物在文库内的位置、靶标、化学结构、命中浓度和TOX1/NKX6. 1双阳性细胞的百分 数。
[0132] 表1前期命中
表2显示后期命中化合物。与PE培养基相比，提高NKX6. 1/roXl双阳性细胞分数超过200%的化合物。列出了文库、化合物在文库内的位置、靶标、化学结构、命中浓度和roxi/ NKX6. 1双阳性细胞的百分数。
[0133]表2.后期命中
表2(续）后期命中
佟営不友明的呆些特祉已经在不又中说明和描还，但现在不领项晋通扠木人员将想到许多修饰、取代、变更和等价物。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落在本发明真 实精神内的所有这些修饰和变更。
[0134] 参考文献 Ameri等（2010)StemCells, 28:45-56 CaiJ?等（2010).JMolCellBiol.，Feb;2(l):50-60 ChungY?等（2006).Nature,Jan12;439(7073):216-9 D，AmourK.A?等（2006).NatBiotechnol, 24: 1392-401 HeinsN?等（2004).StemCells, 22 (3):367-76 JiangJ?等（2007).StemCells, 25:1940-53 KroonE?等（2008).NatBiotechnol, 26:443-452 KlimanskayaI?等（2006).Nature,Nov23;444(7118):481_5 KunisadaY?等（2012).StemCellRes, 8(2):274-84 SchulzTC?寧（2012).PLoSOne, 7(5):e37004 TakahashiK?等（2007).Cell, 131:861-72 TakahashiK?和YamanakaS. (2006).Cell, 126(4):663-76 ThomsonJA?等（1998).Science,Nov6;282(5391):1145-7 Wernig,M?等（2007).Nature, 448:318-24 ZhangD?等（2009).CellResearch, 19:429 - 438
【主权项】
1. 产生表达至少5%PDX1/NKX6. 1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形 内胚层细胞暴露于有效量的下列各组化合物的至少一种： a. BMP抑制剂，和 b. 激酶抑制剂，和 c. 视黄酸受体激动剂， 以使定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。2. 权利要求1的方法，其中所述BMP抑制剂为LDN-193189。3. 权利要求1的方法，其中所述视黄酸受体激动剂为AM580。4. 权利要求1的方法，其中所述视黄酸受体激动剂为视黄酸衍生物。5. 权利要求1的方法，其中所述激酶抑制剂为具有或不具有N-烷基化的1，9-吡唑并 蒽酮的异构体。6. 权利要求1的方法，其中所述激酶抑制剂为JNK抑制剂II并且与AM580组合。7. 权利要求1的方法，其中所述激酶抑制剂和视黄酸受体激动剂与bFGF组合。8. 权利要求1的方法，其中所述激酶抑制剂和视黄酸受体激动剂与FGF7或FGFlO组 合。9. 权利要求1-3的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的无bFGF的 LDN-193189的第一步骤，和在bFGF存在下暴露于JNK抑制剂II与AM580组合的第二步骤。10. 权利要求1-3的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的LDN-193189,随后 暴露于由以下组成的组中的至少一种化合物： wnt抑制剂，例如IWP2,和/或hedgehog抑制剂，例如环巴胺。11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为至少5%、至少 10%、10-30%、10-40%、5-70%、10-80%或5-100%?0父1/^?6.1双阳性。12. 胰细胞或胰细胞前体，其可通过体外使用权利要求1-11的方法获得。13. 胰细胞或胰细胞前体，其通过将定形内胚层细胞体外暴露于靶向JNK1、2或3、或 Syc或Src或GSK-3或P38MAPK或P38激酶或Rho激酶或MEK或Chk2或VEGFRl、2或3或 I3DGFRb或KDR/Flk-1的激酶抑制剂而产生。14. 通过权利要求13的方法产生的胰细胞或胰细胞前体，其中激酶抑制剂为JNK抑制 剂II，且其中定形内胚层细胞还暴露于下列化合物的至少一种： LDN-193189， Wnt抑制剂，hedgehog抑制剂， 视黄酸受体激动剂。15. 权利要求13的胰细胞或胰细胞前体，其中将定形内胚层细胞暴露于JNK抑制剂II 与表2中所列视黄酸受体激动剂的组合。16. 表1或2的激酶抑制剂化合物从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。 17. JNK抑制剂II和LDN-193189组合从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用 途。 18. JNK抑制剂II与视黄酸受体激动剂组合从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前
【专利摘要】产生表达至少5%PDX1/NKX6.1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的一种或多种小分子，以使人定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。本发明还涉及通过所述方法产生的胰内胚层细胞和所述胰内胚层细胞的用途。
【IPC分类】C12N5/074
【公开号】CN104903440
【申请号】CN201380045948
【发明人】J.埃克伯格, M.汉斯森, U.多恩, K.赫斯, N.富纳
【申请人】诺和诺德股份有限公司, 宝生物工程欧洲股份公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月3日
【公告号】EP2893000A1, US20150247123, WO2014033322A1