专利名称：一种培养胰腺干/祖细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞的培养方法，尤其是一种高效诱导胰腺干/祖细胞分化为内分泌细胞的培养方法。
背景技术：
组织细胞培养是生物学中最为重要的实验技术，应用极为广泛，促进着众多前沿科学如分子生物学、基因工程、蛋白质工程等的发展。组织细胞培养的方式主要分为三类 悬滴培养、单层培养和立体培养。悬滴培养法20世纪初由Harrison和Carrel创立单盖片悬滴培养法，1924年 Maximow改良为双盖片悬滴培养法。悬滴培养的优点是细胞生长在近似于立体的环境中，缺陷是细胞生长的空间狭小、气体不足和营养成分少，限制细胞的生长。单层培养法从20世纪40年代末期开始，由Dulbecco为首的学者们，改用人工合成培养基加胎牛血清作为培养液和把细胞接种在培养瓶中培养，能使细胞生长为单层，而成为单层培养。单层培养具有传代方便、易于应用各种方法观察和进行研究，以至成为世界至今仍普遍应用的经典培养方法。单层培养的细胞只有长和宽二维结构，失去了原体内时的立体形态，致使细胞不能充分表达相应基因产物和发生分化。立体培养法目前，立体培养尚在完善和发展中。这种方法的优点为将细胞培养在特殊容器中，能随时更新培养液、提供营养物质和排除代谢产物；为培养细胞提供有与体内相似的支架系统，建成与原体内相似的生存环境；为培养细胞提供特定促细胞增殖生长和分化因子。2007年，我国糖尿病的发病率已增加至5%，糖尿病及其并发症的死亡率已上升至第三位。随着胰岛移植技术的发展，胰岛移植成为彻底治疗糖尿病最有希望的方法。但是，供体胰腺的不足限制了胰岛移植的广泛开展，因此，迫切需要寻找β细胞的新来源。胰腺干/祖细胞可分化为β细胞，因此胰腺干/祖细胞的分离、培养和诱导分化将为细胞治疗糖尿病提供了基础。目前，胰腺干/祖细胞仍缺乏特异的表面标志，研究者正在尝试寻找。应用特异的表面标志，流式细胞仪或免疫磁珠分选可以简单，有效地分离胰腺干/祖细胞。但是，分离胰腺干/祖细胞后面临的最大困难是得到的细胞数比较少，大部分研究者采用常规的培养方法如单层培养或三维培养，诱导其分化为β细胞的效率低，而且需要大量细胞因子的诱导。
发明内容
为了解决现有胰腺干/祖细胞培养技术中存在的效率低、细胞因子诱导剂量大、 诱导后的β细胞数量少功能低下等缺陷，本发明提供了一种解决方案，将悬滴培养法和立体培养法相结合并改进，建立了一种培养胰腺干/祖细胞的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种培养胰腺干/祖细胞的方法，包括以下步骤
(1)将胰腺干/祖细胞接种于微孔培养板中，接种结束后，立即快速将接种板翻转，使接种的细胞悬液和培养液的混合物在接种板表面形成吸附于接种板的向下的悬滴， 而不至于导致液体滴落或溅出；(2)在悬滴状态下培养至细胞形成细胞球之后，将细胞球转移至漂浮的培养膜上继续培养至形成具有生理学功能的结构。具体地说，包括以下步骤(1)解剖显微镜下分离孕12. 5-17. 5天胚胎小鼠的胰腺，加入终浓度为250U/ml的胶原酶IV 200μ 1，37°C孵育30min，加入PRMI-1640完全培养基终止消化，用Iml注射器反复吹打胚胎胰腺直至无明显沉淀，100目的滤网过滤后，制备胰腺细胞的单细胞悬液；(2)调整细胞悬液的浓度为(1-5)Χ103/μ1，取细胞悬液接种于底面积为 0. 013cm2的微孔培养板中，20-30 μ 1/孔，接种结束后，快速把培养板反转，细胞间相互紧密接触形成一个细胞球；(3)在倒置的微孔培养板培养18_24h后，在解剖显微镜下把细胞球转移至漂浮的直径为25mm的LCR膜上，直径为35mm的小培养皿中加入anlPRMI-1640完全培养基，LCR膜漂浮于培养基中，细胞球体在漂浮的LCR膜上培养六天，胚胎胰腺干细胞逐渐分化为内、外分泌细胞，细胞中含大量的分泌颗粒，培养7天后，进行免疫组织化学检测成熟胰腺细胞。所述PRMI-1640完全培养基中按体积比加入10 %胎牛血清，100U/ml青霉素， 100ug/ml链霉素，非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。本发明的有益效果是本发明中的悬滴培养技术，不仅适合少量细胞的培养，能在体外诱导胰腺干细胞高效分化为内分泌细胞，而且不需要诱导因子，可以使胰腺细胞之间的接触更加紧密，为胰腺细胞的生长、增殖提供良好的三维环境。对比组织材料提供的三维培养技术，悬滴培养法简单方便，不需要特定的生物材料，而且细胞间的接触更为紧密，能够更好地模拟体内生长环境。由于不同种类干细胞之间具备了生物学特性和生长方式的相似性，故而此培养方法不仅可以用于胰腺细胞的培养，也适用于其它种类干细胞的培养。
图1悬滴培养的示意图；图加细胞刚接种于培养板的照片；图2b细胞接种于培养板后在悬滴中培养1天后的照片；图3细胞球于漂浮的膜上培养的示意图；图4细胞球于漂浮的膜上培养过程中形态的变化；图5细胞球于漂浮的膜上培养过程中胰腺细胞标志表达的变化。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明本发明的具体实施方式
如下，但本发明的实施并不局限于以下实施例解剖显微镜下分离胚胎小鼠(孕12. 5-17. 5天)的胰腺，加入终浓度为250U/ml的胶原酶IV 200 μ 1，37°C孵育30min，加入PRMI-1640完全培养基(添加10%胎牛血清，IOOU/ ml青霉素，100ug/ml链霉素，1 %非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺)终止消化，用Iml注射器反复吹打胚胎胰腺直至无明显沉淀，100目的滤网过滤后，制备胰腺细胞的单细胞悬液。调整细胞悬液的浓度为1-5 X IO3/μ 1，取细胞悬液接种于底面积为0. 013cm2的微孔培养板中 (Nunclon Microwell Terasaki-Style Plates)，20-30 μ 1/孔，接种结束后，快速把培养板反转，由于表面张力的作用，培养液不会流下来。由于重力作用，细胞间相互紧密接触形成一个细胞球(图1，幻。在倒置的微孔培养板培养18_24h后，在解剖显微镜下把细胞球转移至漂浮的直径为25mm的LCR膜上。直径为35mm的小培养皿中加入^il PRMI-1640完全培养基，LCR膜漂浮于培养基中(图3)。细胞球体在漂浮的LCR膜上培养六天，培养过程中细胞球的变化如图4。尽管在培养过程中细胞球体的体积变化不大，但随着培养天数的增加， 其密度逐渐增加。因为随着培养天数的增加，胚胎胰腺干细胞逐渐分化为内、外分泌细胞， 细胞中含大量的分泌颗粒。培养7天后，免疫组织化学检测成熟胰腺细胞的标志发现细胞球高表达胰岛素、胰高血糖素以及羧肽酶，而且胰岛素阳性细胞和胰高血糖素阳性细胞聚集在一起形成类似胰岛的结构。细胞球培养过程胰岛素的表达逐渐升高，而胰高血糖素的表达先下降后升高。因为胰高血糖素被认为表达于胰腺干细胞。随着胰腺干细胞分化胰高血糖素表达逐渐下降，第3天时表达最低。但是，随着成熟α细胞出现，胰高血糖素表达逐渐增加。细胞球培养过程中胰岛素和胰高血糖素的表达模式与体内胚胎胰腺发育过程中相一致(图5)。 综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种培养胰腺干/祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将胰腺干/祖细胞接种于微孔培养板中，接种结束后，立即快速将接种板翻转，使接种的细胞悬液和培养液的混合物在接种板表面形成吸附于接种板的向下的悬滴，而不至于导致液体滴落或溅出；(2)在悬滴状态下培养至细胞形成细胞球之后，将细胞球转移至漂浮的培养膜上继续培养至形成具有生理学功能的结构。
2.根据权利要求1所述的培养胰腺干/祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)解剖显微镜下分离孕12.5-17. 5天胚胎小鼠的胰腺，加入终浓度为250U/ml的胶原酶IV 200μ 1，37°C孵育30min，加入PRMI-1640完全培养基终止消化，用Iml注射器反复吹打胚胎胰腺直至无明显沉淀，100目的滤网过滤后，制备胰腺细胞的单细胞悬液；(2)调整细胞悬液的浓度为(1-5)X IO3/μ 1，取细胞悬液接种于底面积为0.013cm2的微孔培养板中，20-30 μ 1/孔，接种结束后，快速把培养板反转，细胞间相互紧密接触形成一个细胞球；(3)在倒置的微孔培养板培养18-24h后，在解剖显微镜下把细胞球转移至漂浮的直径为25mm的LCR膜上，直径为35mm的小培养皿中加入anlPRMI-1640完全培养基，LCR膜漂浮于培养基中，细胞球体在漂浮的LCR膜上培养六天，胚胎胰腺干细胞逐渐分化为内、外分泌细胞，细胞中含大量的分泌颗粒，培养7天后，进行免疫组织化学检测成熟胰腺细胞。
3.根据权利要求1所述的培养胰腺干/祖细胞的方法，其特征在于，所述PRMI-1640完全培养基中按体积比加入10%胎牛血清，100U/ml青霉素，lOOug/ml链霉素，非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。
全文摘要
本发明公开了一种培养胰腺干/祖细胞的方法，包括以下步骤将胰腺干/祖细胞接种于微孔培养板中，接种结束后，立即快速将接种板翻转，使接种的细胞悬液和培养液的混合物在接种板表面形成吸附于接种板的向下的悬滴，而不至于导致液体滴落或溅出；在悬滴状态下培养至细胞形成细胞球之后，将细胞球转移至漂浮的培养膜上继续培养至形成具有生理学功能的结构。本发明的悬滴培养法简单方便，不需要特定的生物材料，而且细胞间的接触更为紧密，能够更好地模拟体内生长环境。
文档编号C12N5/071GK102363764SQ20111034455
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者韩忠朝, 马凤霞 申请人:中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)