40 mmol) KOH颗粒和58 mL氨水（29. 3%, 50 mmol)，常温下避光搅拌25 h。过滤收集灰白色 固体，并用乙醇洗涤三次，每次10 mL。再以氯仿-甲醇溶剂重结晶，得到白色固体。产量 4.2 g，产率 61 %/H NMR (300 MHz, DMS0) δ = 8.73 (d，/= 4.2 Hz, 2H)，8.66 (s， 2H), 8.64 (d, /= 9.0 Hz, 2H), 7.99 (t, J= 11.4 Hz, 2H), 7.80 (d, / = 6.0 Hz, 2H)，7. 54 - 7. 46 (m, 2H)，7. 37 (d, / = 7. 8 Hz, 2H)，2. 39 (s, 3H) 〇
[0034] 2、配合物[Ir(ttpy) (dfppy)Cl]PFj^合成方法：环金属铱（III)配合物的合成途 径如附图4所示。
[0035] (1)制备 Ir (ttpy) 3 按照参考文献U ▲?·泛￡麗5bc·，1999，121，5009 - 5016)合成方法，取配体 phtpy (91. 6 mg, 0. 28 mmol)和 IrCl3^H2O (112 mg, 0· 32 mmol)溶于 5 mL 脱气乙二醇 中加热至180°C，避光，通氩气。搅拌12分钟后，可观察到红色沉淀产生。冷却至室温，真空 过滤，依次用乙醇、水和乙醚洗绦，得到橙红色固体，即为[Ir (phtpy)C13]。产量180 mg，产 率 90 %。
[0036] (2)制备[Ir (ttpy) (dfppy)C1]PF6 按照参考文献（/florg 泛￡麗 2014，53，1487-1499)合成方法。取[Ir(phtpy)Cl3] 93. 6 mg (0. 15 mmol)以及2-苯基P比啶108. 5 mg(0. 70 mmol)置于充满氩气的试管中，再 加入5 mL乙二醇。所得混合物避光下加热至180°C，过夜。避光冷却到室温后，将反应混 合物加进20 mL饱和NH4PF6溶液，混合物在室温下搅拌I h。真空过滤得到黄色沉淀，用 水和二乙醚洗涤得到黄色固体。产量114. 5 mg，产率53 %。ES-MS (CH3OH): 723. 3
[M-PF6-ClT. 1H NMR (300 MHz, 4-DMS0) δ = 9.87 (d，/= 5.9 Hz, 1Η)，9.24 (s， 2H), 8.96 (d, /= 6.8 Hz, 2H), 8.49 (d, / = 7. 3 Hz, 1H), 8.34 - 8.17 (m, 5H), 7.93 (d, /= 7. 8 Hz, 1H), 7.80 (t, / = 6. 7 Hz, 1H), 7.68 (d, / = 5. 2 Hz, 2H), 7.54 (m, 4H), 6.91 (t, / = 7. 5 Hz, 1H), 6.74 (t, / = 7. 5 Hz, 1H), 6.07 (d, J = 7. 6 Hz, 1H), 2. 29 (s, 3H) 0
[0037] 3、制备得到的环金属铱（III)配合物的分子结构如附图2所示。
[0038] 环金属铱（III)配合物的紫外吸收光谱图如附图5所示，在750nm激发下的荧光 光谱图入附图6所示。
[0039] 上述方法获得的配合物进一步进行以下实验。
[0040] 实施例2激光共聚焦实验 1、实验方法 对数期生长的Hela细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，细胞接种在共聚 焦显微镜专用玻底培养皿中，培养皿直径35 mm，其中盖玻片厚度0.085~0.13 mm，皿中 心微孔直径10 mm，5% 0)2和95%空气条件下，37°C培养，贴壁生长24小时。用5 μΜ配合 物培育I h，再和线粒体红色荧光染料Mitotracker-Red FM (50 ηΜ)共染30 min，吸出培 养液，然后用PBS缓冲液洗涤3~4次，在Zeiss双光子激光扫描共聚焦显微镜上成像， 使用63'油镜，用750 nm光作为激发光源，收集500~630 nm范围内的荧光。
[0041] 2、结果 (1)环金属铱（III)配合物对HeLa贴壁细胞荧光成像图如附图7所示。本发明的环金 属铱（III)配合物在双光子光源（Iex = 750 nm)激发下，能够对活细胞进行染色，而且染色 过后并没有影响到细胞的生理活动，细胞没有表现出任何受损或凋亡的现象，说明该配合 物是良好的活细胞双光子染料。
[0042] (2)环金属铱（III)配合物与商用线粒体染料MitoTracker? Red FM焚光共定位 图如附图8所示。环金属铱（III)配合物与商用线粒体染料MitoTracker? Red FM焚光共 定位系数达到R= 0. 92,说明该配合物在细胞内的革El点是线粒体。
[0043] (3)环金属铱（III)配合物对HeLa 3D细胞球不同深度荧光成像图如附图9所示。 HeLa 3D细胞球具有不同深度的三维结构，很方便地用于研宄染料的染色深度以及进细胞 能力，如图9所示，在双光子激发光源的激发下，染料的荧光能够透过将近100 mm的细胞球 内部结构，表明该配合物不仅具有良好的进细胞能力，同时还能够穿透到较深的组织内部， 是良好的双光子活细胞染料。
【主权项】
1. 一种新型环金属铱（III)配合物，其特征在于，其结构式如式I所示：2. 权利要求1所述新型环金属铱（III)配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤：将对甲基苯甲醛和2-乙酰吡啶在乙醇中反应获得甲基苯三联吡啶（ttpy)，由甲基苯三 联P比啶（ttpy)和IrCl3 ?&0 先反应制得Ir(ttpy)Cl3前体，再由Ir(ttpy)Cl3和 2-(2, 4-二 氟苯基）吡啶反应制得； 所述的对甲基苯甲醛、2-乙酰吡啶、甲基苯三联吡啶（ttpy)、2-(2, 4-二氟苯基）吡啶 的结构式分别为：3. 根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，包括以下步骤：51. 将对甲基苯甲醛和2-乙酰吡啶在乙醇中搅拌回流反应获得甲基苯三联吡啶 (ttpy)；52. 将S1得到的甲基苯三联吡啶（ttpy)与IrCl3 ?H20在乙二醇中回流反应获得前体 Ir(ttpy)Cl3；53. 由前体Ir(ttpy) (：13和2-(2, 4-二氟苯基）吡啶在乙二醇中回流反应，反应结束后， 利用饱和NH4PF6水溶液，析出橙黄色固体，即为目标化合物[Ir(ttpy) (dfppy)Cl]PF6。4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述回流反应的时间为12~ 24小时，反应温度为室温；步骤S2所述回流反应的时间为10~30小时，反应温度为150~ 190。。。5. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述回流反应的时间为24小 时；步骤S2所述回流反应的时间为15分钟，反应温度为180°C。6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述回流反应的时间为12~ 24小时；反应温度为150~190 °C。7. 根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述回流反应的时间为24小 时，反应温度为180 °C。8. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3得到的橙黄色固体进一步干燥 获得粗产品，再经氧化铝柱分离提纯，干燥后得到目标产物[Ir(ttpy) (dfppy)Cl]PF6。9. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述饱和NH4PF6水溶液的质量 分数为42. 8%。10.权利要求1所述环金属铱（III)配合物在活细胞双光子线粒体荧光成像中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新型环金属铱（III）配合物及其制备方法和在活细胞线粒体染色中的应用。所述新型环金属铱（III）配合物的阳离子部分的结构式如式I所示。本发明合成得到的环金属的铱（III）配合物结构稳定，具有良好的光物理光化学性质，细胞毒性低，并表现出良好的线粒体靶向功能，是新型的活细胞线粒体双光子荧光探针。经研究表明，该配合物的光稳定性和双光子吸收截面明显优于商用线粒体染料，是潜在的优秀双光子线粒体染料。
【IPC分类】C12Q1/02, G01N21/64, C09B57/10, C09K11/06, C07F15/00
【公开号】CN104910211
【申请号】CN201510228445
【发明人】巢晖, 黄怀义, 张平玉, 计亮年
【申请人】中山大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月7日