一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及再生医学领域，特别涉及一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化 模型的方法。
【背景技术】
[0002] 嗜酸性粒细胞（Eosinophils，Eos)是一种颗粒性白细胞，起源于骨髓造血干细 胞，在骨髓内分化成熟后进入外周血。虽然Eos仅占外周血白细胞的0. 4% -8 %，但却是极 重要的炎症介质细胞，在介导过敏反应、寄生虫感染和调节免疫系统中具有重要功能，是多 种临床疾病的重要研宄点和突破口。因此，建立一种高效的嗜酸性粒细胞体外定向诱导分 化模型可为研宄其分化和成熟机理以及相关疾病的病理和治疗研宄奠定基础。
[0003] 但目前无论是对嗜酸性粒细胞发育分化的研宄还是对其特异性疾病治疗的探宄 都很少。虽然早期有部分研宄将人类脐带血造血干细胞、外周血和骨髓的⑶34+细胞诱导 出嗜酸性粒细胞，但由于嗜酸性粒细胞纯度不高，缺乏特异性表型分子的鉴定等，始终停留 在方法学阶段。此外，前期研宄的细胞来源于人体内，细胞资源有限，限制了临床的大规模 石开宄和应用 ° J. Owen 等（Differentiation in vitro of hybrid eosinophil/basophil granulocytes:autocrine function of an eosinophil developmental intermediate. J Experimental Med, 1995, 182(1) :49-57.)曾在体外用 Matrigel 覆盖的培养皿，添加适 量的rhIL-3和rhIL-5成功将脐带血造血祖细胞培养出含有嗜酸性和嗜碱性粒细胞特征 的前体细胞，再进一步的悬浮培养可得到嗜酸性粒细胞。H. Saito等（Gene expression accompanied by differentiation of cord blood-derived CD34+cells to eosinophils. International Archives of Allergy and Immunol, 2001，125 (suppl 1):2-6.)将脐带血 ⑶34+的细胞用SCF、IL-3、IL-5和GM-SCF培养3周获得嗜酸性粒细胞。以上研宄均是从 脐带血和外周血着手，研宄的都是成体造血的范围，尚无从hESCs特异性定向分化诱导嗜 酸性粒细胞来研宄胚胎造血的相关工作报道。况且这些研宄得到的嗜酸性粒细胞纯度不是 很高，而且由于缺乏特异性表型分子的鉴定，无法确定嗜酸性粒细胞的发育途径。
[0004] 近几年有研宄发现Siglec-8是成熟嗜酸性粒细胞唯一特异性的表面抗原，能 作为特异性的标记分子对成熟嗜酸性粒细胞进行筛选和鉴定（Floyd H, Ni J, Cornish AL, et al. Siglec_8A novel eosinophil-specific member of the immunoglobulin superfamily· J Biolog Chem, 2000, 275(2) :861-866.)。0)88是主要表达在嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的表面的特定谱系分子。CD34是胚胎造血干细胞特异性标 志，⑶45是髓系细胞特异性标志，⑶43是髓系细胞发育标志，⑶14主要分布在单核细胞、巨 噬细胞和树突细胞的细胞表面，c-Kit主要表达在肥大细胞表面，Fc ε Rl主要表达在肥大 和嗜碱性粒细胞表面。2D7主要在嗜碱性粒细胞表达。EPO是成熟嗜酸性粒细胞胞内特异 性表达的颗粒蛋白，可作为功能特定分子用于鉴定成熟嗜酸性粒细胞。LPS(脂多糖）作为 革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，能够被天然免疫细胞表面重要模式识别受体之一 TLR4 所识别，通过招募接头蛋白分子MyD88 (或TRIF)，激活下游的NF- κ B等信号通路，产生一系 列的促炎因子或干扰素，从而启动天然免疫防御机制，保护宿主细胞免受病原微生物的侵 入。因此，本实验采用LPS刺激试验来验证本体系得到的细胞是否具有免疫功能。综合以 上表面分子标志和特异性颗粒蛋白以及功能实验来确证本体系从hESCs定向诱导分化出 的细胞是否是成熟嗜酸性粒细胞。
[0005] 人类胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能，是体外研宄的理想种子细胞， 能克服细胞来源有限的缺点。体外诱导人类胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞的分化，能更好模 拟体内嗜酸性粒细胞的发育途径，揭示嗜酸性粒细胞的早期发育过程和相关的分子调控机 制。我们的研宄有望利用hESCs培养出的大量高纯度的成熟嗜酸性粒细胞作为分子药物筛 选的模型而应用于新药的开发并为组织再生医学工程和转化医学治疗提供良好的模型。
【发明内容】
[0006] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种建立人胚胎干细胞 向成熟嗜酸性粒细胞高效定向诱导分化模型的方法。且利用本方法能显著提高嗜酸性粒细 胞体外诱导分化的效率。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0008] -种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法，将未分化的hESCs (Hl) 细胞与经13. 3Gray X射线辐照处理后的mAGM-S3细胞共培养一段时间后，加入造血诱导分 化液经一定条件培养得到造血干/祖细胞，将造血干/祖细胞扩增后，利用细胞因子培养液 使造血干/祖细胞进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段，持续培养后更换细胞因子培养液使嗜 酸性粒细胞趋于成熟，之后检测确定成熟嗜酸性粒细胞纯度和功能。
[0009] 进一步的，一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法，包括如下步 骤：
[0010] 步骤一 ：hESCs维持未分化培养
[0011] hESCs (Hl)维持未分化培养采用无基质细胞培养方法，将未分化hESCs克隆接种 于包被有基质蛋白matrigel的培养皿上，用商品化的mTeSRl培养基进行培养，每天去除 分化细胞，更换培养基，培养条件为37°C，5% CO2。每隔5- 7天用浓度为0. 5mM的EDTA在 37°C，5% CO2条件下消化3 - 4min，以1:4一 1:6的比例传代细胞；
[0012] 步骤二：mAGM-S3基质细胞的准备
[0013] 接种mAGM-S3细胞株于明胶包被的6孔板中，培养基为α-ΜΕΜ、5%胎牛血清， 每天更换培养基，培养条件为37°C，5% CO2。待mAGM-S3细胞融合度不低于90%时，采用 13. 3Gray X射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用，得到约2 X IO5细胞/孔；
[0014] 步骤三：hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞
[0015] 在显微镜下用200 μ L枪头枪尖将hESCs未分化集落划分成数个小集落，每个集落 约0. 5-1 X IO3细胞，以50-70个集落/6孔板每孔，接种集落于准备好的mAGM-S3细胞上， 加 hESCs未分化细胞维持液2-3mL，轻柔摇勾，37°C，5 % CO2培养3天，得到约2 X 10 5hESCs/ 孔，用造血诱导分化液再培养14天，产生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用；培养过程中 每天换液；第6天以后根据细胞培养情况可一天换液2次；
[0016] 步骤四：液体悬浮培养
[0017] 液体悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第 二阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞成熟，三个阶段 分别各7天，共21天；
[0018] 1)将步骤三中共培养14天的细胞，PBS洗涤2遍，经0· 25% Trypsin/EDTA37°C处 理5-7min后，冰PBS或者含血清培养液终止胰酶作用，用ImL枪头反复吹打直至无大细胞 团块凝集，收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，将细胞因子培养液I分为A、B 两组，重悬，培养于低粘6孔板中，记为悬浮培养第0天，进入造血干/祖细胞扩增阶段，细 胞置于37°C，5% C02孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2-4天更换培养液，将细胞收集到 离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液重悬，转移至低粘6孔板或24 孔板中继续培养；
[0019] 2)7天以后，用ImL枪头轻柔吹散细胞团块，100 μπι滤膜过滤后收集到离心管中， 1500rpm室温离心5min，弃上清，加入细胞因子培养液II，培养于低粘24孔板中，记为悬浮 培养第7天，进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段；细胞置于37°C，5% CO2孵育箱中孵育，根据 细胞培养条件2- 4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上 清，更换新鲜培养液；
[0020] 3)7天以后，用11^枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500印111室温离心51^11，弃 上清，加入细胞因子培养液III，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第14天，进入嗜酸性粒 细胞成熟阶段；细胞置于37°C，5% CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2- 4天更换培养 液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液。
[0021] 进一步的，对所得细胞采用以下方法进行检测：
[0022] 步骤一：共培养及悬浮培养细胞流式细胞学表面分子检测分别收集悬浮培养 第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约IX IO5细胞，1800rpm室温 离心5min，弃上清，（2 - 5% )FBS/PBS重悬，加入普通兔血清5 - IOuL混匀，置于冰上封 闭20分钟，阻断抗原非特异性结合，再用70 μ m滤膜过滤，加入特异性抗体（⑶88-FITC、 Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、Fc ε R1-PE、2D7-APC 各5uL)，混匀，常温避光反应20-30min，（2 - 5% )FBS/PBS液ImL洗涤1一2次，1800rpm室 温离心5min，弃上清，（2 - 5%)FBS/PBS液200uL重悬于流式上样管中，用BD CantoII/ Calibur流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo7. 2. 5软件进行分析。
[0023] 步骤二：制备细胞甩片
[0024] 分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，分别取 约1父10 4细胞，1500印111室温离心51^11，弃上清，10011^^5重悬，加样到甩片离心机中，以 550rpm室温离心5min，制备细胞甩片；
[0025] 步骤三：麦格氏-姬姆萨（May-Giemsa)染色
[0026] 将制备的细胞甩片置于染色台上，以麦格氏液固定10分钟，Giemsa B液染色3分 钟，自来水冲洗后，Giemsa A液染色20分钟，自来水冲洗后，自然瞭干，封片，显微镜下观 察；
[0027] 步骤四：间接免疫荧光染色
[0028] 将制备的细胞片置于湿盒中，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，0. 1% Triton-100/5%脱脂奶粉/PBS破膜30min，添加一抗为1:100稀释的羊抗人EPO抗体，4°C 孵育过夜，5% SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG (H+L) -Cy?3,室温摇晃 孵育30分钟，0. 1% Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1 一5min，PBS 洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照；
[0029] 步骤五：功能实验
[0030] 用ImL枪