天换液；第6天以后根据细胞培养情况可一天换液2次； 培养结果如图1所示：其中A:hESCs未分化集落；B :mAGM-S3 ;C :共培养Day4hESCs集落开 始分化（4乂）；0:共培养0&79分化集落和类血管结构（4\)出 ：共培养0&7141^5(^分化集 落（4X) ;F:共培养DayH "铺路石样"造血干/祖细胞（40X)。
[0174] 步骤四：液体悬浮培养
[0175] 如图2所示，为是hESCs与mAGM-S3共培养获得的细胞进行悬浮培养流程图，液体 悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第二阶段主要是 诱导嗜酸性粒细胞分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞成熟，三个阶段分别各7天，共 21天；
[0176] 1)将步骤三中共培养14天的细胞，PBS洗涤2遍，经0. 25% Trypsin/EDTA37°C处 理5-7min后，冰PBS或者含血清培养液终止胰酶作用，用ImL枪头反复吹打直至无大细胞 团块凝集，收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，将细胞因子培养液I分为A B 两组，重悬，培养于低粘6孔板或24孔板中，记为悬浮培养第0天，进入造血干/祖细胞扩 增阶段，细胞置于37°C，5% CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2-4天更换培养液，将细 胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液重悬，转移至低粘6孔 板或24孔板中继续培养；
[0177] 2)7天以后，用ImL枪头轻柔吹散细胞团块，100 μπι滤膜过滤后收集到离心管中， 1500rpm室温离心5min，弃上清，加入细胞因子培养液II，培养于低粘24孔板中，记为悬浮 培养第7天，进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段；细胞置于37°C，5% CO2孵育箱中孵育，根据 细胞培养条件2- 4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上 清，更换新鲜培养液；
[0178] 3)7天以后，用11^枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500印111室温离心51^11，弃 上清，加入细胞因子培养液III，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第14天，进入嗜酸性粒 细胞成熟阶段；细胞置于37°C，5% CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2- 4天更换培养 液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液；
[0179] 步骤五：共培养及悬浮培养细胞流式细胞学表面分子检测
[0180] 分别收集悬浮培养第〇、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约 I X IO5细胞，1800rpm室温离心5min，弃上清，（2-5% ) FBS/PBS重悬，加入普通兔血清5- IOuL混匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗原非特异性结合，再用70 μ m滤膜过滤，加入特异 性抗体（CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-PE、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、 Fe ε R1-PE、2D7-APC 各 5ul)，混匀，常温避光反应 20-30 分钟，（2-5%)FBS/PBS 液 ImL 洗 涤1一2次，1800rpm室温离心5min，弃上清，（2 - 5% )FBS/PBS液200uL重悬于流式上样 管中，用BD Canto II /Calibur流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo7. 2. 5软件进行 分析。
[0181] 步骤六：制备细胞甩片
[0182] 分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约 IX IO4细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，PBSlOOuL重悬，加样到甩片离心机中，以 550rpm室温离心5min，制备细胞甩片。
[0183] 步骤七：麦格氏-姬姆萨（May-Giemsa)染色
[0184] 将制备的细胞甩片置于染色台上，以麦格氏液固定10min，Giemsa B液染色3min， 自来水冲洗后，Giemsa A液染色20min，自来水冲洗后，自然瞭干，封片，显微镜下观察。
[0185] 步骤八：间接免疫荧光染色
[0186] 将制备的细胞甩片置于湿盒中，4%多聚甲醛（PFA)固定30min，PBS洗涤3次， 0· 1 % Triton-100/5%脱脂奶粉（ski_ed milk，SM)/PBS 破膜 30min，添加一抗为 1:100 稀 释的羊抗人EPO抗体，4°C孵育过夜（8 - 20小时），5% SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100 稀释的鼠抗羊IgG (H+L) -Cy?3，室温摇晃孵育30分钟，0. 1 % Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS 稀释的DAPI复染细胞核1 一5min，PBS洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照。
[0187] 如图5所示，是悬浮培养第0 - 21天，成熟嗜酸性粒细胞胞内特异性颗粒蛋白EPO 的间接免疫焚光染色表达情况（A组）和麦格氏-姬姆萨（May-Giemsa)染色（B组）结果。
[0188] 步骤九：功能实验
[0189] 用ImL枪头将悬浮培养第21天的细胞轻轻取出，1500rpm室温离心5min，弃上清， 培养基RPMI-1640+20 % FBS重悬于低粘六孔板中，密度I X IO7细胞/孔，细胞置于37°C， 5% C02孵育箱中培养50min，去除贴壁的巨噬细胞。轻取上清，PBS洗两遍，（2 - 5% )FBS/ PBS液I. 5mL/孔重悬于低粘24孔板中，密度IX IO6细胞/mL ;每孔加入不同浓度的LPS 刺激剂，浓度梯度为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL ;6h 后分别取样， 1800rpm室温离心5min，弃上清，采用ImL Trizol/样本提取RNA，冻存于-80°C储存，实时 荧光定量PCR方法检测Toll样受体4的表达。
[0190]
[0192] GAPDH (管家基因，135bp)引物序列：
[0193] 上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG
[0194] 下游引物：ATGGGTGGAATCATATTGG
[0195] TLR4(160bp)引物序列：
[0196] 上游引物：AATCCCCTGAGGCATTTAGG
[0197] 下游引物：AACTCTGGATGGGGTTTCCT
[0198] 逆转录20 μ L反应体系：
[0199]
[0200] 反应程序：25°C 5min ;42°C 30min ;85°C 5min ;持续 4°C。cDNA 标本放置-20°C 储 存。
[0201] 步骤十：统计学分析
[0202] 每次实验独立重复至少3次，所有实验数据描述为平均值土标准差（X土 s)。两个 样本均数的比较采用配对t检验，P〈0. 05认为有统计学意义，数据用SPSS13. 0统计软件进 行分析。
[0203] 试验例2 :
[0204] 材料及部分培养液同试验例1 :
[0205] (4)嗜酸性粒细胞细胞因子培养液配制
[0206] 细胞因子培养液I A组：
[0207] 造血诱导分化液添加细胞因子
[0208] SCF IOOngymL IL-6 lOOng/mL TPO 5ng/mL FLT3-L 5ng/mL IL-3 lOng'/mi. GM-CSF lOOng/mL·
[0209] 细胞因子培养液I B组：
[0210] 造血诱导分化液添加细胞因子
[0211] SCF 200ng/mL· IL-6 200ng/mL· TPO 5ng/mL FLT3-L 5ng/mL IL-3 lOng'/mL·
[0212] 混匀，0. 22 μ m滤器过滤，置于4°C冰箱备用，
[0213] 细胞因子培养液II :
[0214] 造血诱导分化液添加细胞因子
[0215] SCF 200ng/mL
[0216] IL-3 100ng/mL
[0217] GM-CSF 10ng/mL
[0218] 细胞因子培养液III:
[0219] 造血诱导分化液添加细胞因子
[0220] IL-3 100ng/mL
[0221] IL-5 100ng/mL
[0222] 混匀，0. 22 μ m滤器过滤，置于4°C冰箱备用。
[0223] 实验步骤同试验例1
[0224] 如图4,试验例1与试验例2显示，hESCs/mAGM_S3共培养细胞悬浮培养阶段早期 加入（A组）比不加入（B组）细胞因子GM-CSF的培养基组合Eos扩增量更明显。
[0225] 如图4所示，本发明中，我们对液体悬浮培养第0、7、14、21天的细胞进行流式检 测，发现造血干/祖细胞进入液体悬浮培养阶段后，⑶88+Siglec-S+细胞表达水平从不足 0. 5%左右逐步增加到第21天的95%以上，如图3a所示，⑶34+细胞比例从14%左右下降 到约0.05% ;CD45+细胞从7%左右和CD43+细胞从14%左右扩增到几乎100%。如图3b 所示，仅有2% -3%左右细胞表达c-Kit、Fe ε Rl和⑶14,几乎不表达2D7。EPO是成熟嗜 酸性粒细胞胞内特异性表达的颗粒蛋白，EPO+细胞比例从第0天的〈1/1000增加到第21天 的细胞的96. 88%，如图3c所示，第0、7、14、21天的EPO+细胞比例与CD88 +Siglec-8+细胞 比例吻合。May-Giemsa染色发现，悬浮培养第0、7、14、21天嗜酸性粒细胞的增长规律与流 式检测和免疫染色结果的规律相同。镜下观察嗜酸性粒细胞与外周血嗜酸性粒细胞极其相 似，胞体呈圆形或椭圆形，胞核多分叶或杆状，染色质凝聚，胞质淡染呈淡紫红色，胞质中 均匀分布密集粗大且折光性强的桔红色颗粒，部分嗜酸性粒细胞破碎后颗粒常分散于细胞 周围。以上数据表明，本实验将hESCs向髓系诱导，再定向诱导为成熟嗜酸性粒细胞，而非 其他谱系种类的细胞。
[0226] 液体悬浮培养过程中，前两周细胞持续扩增，第二周达到峰值，总细胞量从悬浮培 养第〇天的1. 218 X IO6增殖到第14天的7. 85 XlO6,第三周呈现下降趋势，大量非嗜酸性粒 细胞死亡。其中，嗜酸性粒细胞生长趋势与总细胞扩增趋势一致，在悬浮培养前两周迅速增 殖，从CD34+CD45+造血干/祖细胞定向诱导分化为嗜酸性粒细胞扩增约500倍以上，第三周 呈现下降趋势。嗜酸性粒细胞扩增趋势较总细胞量更为明显，而下降趋势则更趋于缓和，表 明嗜酸性粒细胞的扩增比例明显高于培养基中的其他种类细胞，且后期死亡比例也更低。 (图 3c)。
[0227] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，其特征在于，将培养 未分化的hESCs与经13. 3GrayX射线辐照处理后的mAGM-S3细胞共培养3天后，加入造血 诱导分化液经一定条件培养得到造血干/祖细胞，将造血干/祖细胞扩增后，利用细胞因子 培养液使造血干/祖细胞进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段，持续培养后更换细胞因子培养 液使嗜酸性粒细胞趋于成熟，之后检测确定成熟嗜酸性粒细胞纯度和功