能。2. 根据权利要求1所述的建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，其 特征在于，包括如下步骤： 步骤一 ：hESCs维持未分化培养 采用无基质细胞作滋养层的培养方法，维持hESCs的未分化状态，将未分化hESCs克 隆接种于包被有基质蛋白matrigel的6cm培养皿上，用mTeSRl培养基进行培养，每天去除 分化细胞，更换培养基，培养条件为37°C，5%C02，每隔5- 7天用浓度为0. 5mM的EDTA在 37°C，5%C02条件下消化3 - 4min，以1:4一 1:6的比例传代细胞； 步骤二：mAGM-S3基质细胞的准备 取液氮中冻存的小鼠AGM区域基质细胞mAGM-S3,复苏到包被明胶的贴壁6孔板，培养 基为a-MEM、5%胎牛血清，每天更换培养基，培养条件为37°C，5%C02，待mAGM-S3细胞融 合度不低于90%时，采用13.3GrayX射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用， 得到2X105细胞/孔； 步骤三：hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞 在显微镜下用200yL枪头枪尖将培养的hESCs未分化集落划分成数个小集落，之后将hESCs未分化的小集落接种于备好的mAGM-S3细胞上，加hESCs未分化细胞维持液2-3mL， 马上补加2 - 3uL的Rho激酶抑制剂促使集落贴壁，轻柔摇匀，37°C，5% 0)2静置培养3天， 每天换液2 - 3mL，得到2X105/孔的贴壁hESCs，用造血诱导分化液再培养14天，产生大量 造血干/祖细胞，收集细胞备用，培养过程中每天换液2-3mL/孔，第6天以后根据细胞培 养情况可一天换液2次； 步骤四：液体悬浮培养 液体悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第二阶 段主要是诱导嗜酸性粒细胞的分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞的成熟，三个阶段 分别各7天，共21天； 1) 将步骤三中共培养14天的细胞，用PBS洗涤2遍，经0. 25%Trypsin/EDTA37°C处理 5 - 7min后，冰PBS或者含血清培养液终止胰酶作用，用lmL枪头反复吹打直至无大细胞团 块凝集，收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，将细胞因子培养液I分为A/B两 组，重悬，培养于低粘6孔板中，记为悬浮培养第0天，进入造血干/祖细胞扩增阶段，细胞 置于37°C，5%C02孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2- 4天更换培养液，将细胞收集到离 心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液重悬，转移至低粘6孔板中继续培 养； 2) 7天以后，用lmL枪头轻柔吹散细胞团块，100ym滤膜过滤后收集到离心管中， 1500rpm室温离心5min，弃上清，用细胞因子培养液II，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培 养第7天，进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段；细胞置于37°C，5%C02孵育箱中孵育，根据细 胞培养条件2- 4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清， 更换新鲜培养液； 3) 7天以后，用lmL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清， 用细胞因子培养液III，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第14天，进入嗜酸性粒细胞成 熟阶段；细胞置于37°C，5%C02孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2- 4天更换培养液，将 细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所得细胞采用以下方法进行检测： 步骤一：共培养及悬浮培养细胞流式细胞学表面分子检测 分别收集悬浮培养第〇、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取一定量 细胞1500rpm室温下离心5min，弃上清，2- 5%FBS/PBS重悬，加入普通兔血清5- 10uL 混匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗原非特异性结合，再用70ym滤膜过滤，加入特异性 抗体CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、 FceR1-PE、2D7-APC各 5uL，混匀，常温避光反应 20- 30 分钟，（2-5% )FBS/PBS液lmL洗 涤1一2次，1800rpm室温下离心5min，弃上清，（2 - 5% )FBS/PBS液200uL重悬于流式上 样管中，用BDCantoII/Calibur流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo7. 2. 5软件进 行分析 步骤二：制备细胞甩片 分别收集悬浮培养第〇、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，分别取约IX104细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，lOOuLPBS重悬，加样到甩片离心机中，以 550rpm室温离心5min，制备细胞甩片； 步骤三：麦格氏-姬姆萨（May-Giemsa)染色 将制备的细胞甩片置于染色台上，以麦格氏液固定10分钟，GiemsaB液染色3分钟， 自来水冲洗后，GiemsaA液染色20分钟，自来水冲洗后，自然瞭干，封片，显微镜下观察； 步骤四：间接免疫荧光染色 将制备的细胞片置于湿盒中，4 %多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，0. 1 %Triton-100/5%脱脂奶粉/PBS破膜30min，添加一抗为1:100稀释的羊抗人EP0抗体，4°C 孵育过夜，5%SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG(H+L) -Cy?3,室温摇晃 孵育30分钟，0. 1%Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1 一5min，PBS 洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照； 步骤五：功能实验 用lmL枪头将悬浮培养第21天的细胞轻轻取出，1500rpm室温离心5min，弃上清，培养 基RPMI-1640+20 %FBS重悬于低粘六孔板中，密度1X107细胞/孔，细胞置于37°C，5 %C02 孵育箱中培养50min，去除贴壁的巨噬细胞；轻取上清，PBS洗两遍，（2 - 5% )FBS/PBS液 1. 5mL/孔重悬于低粘24孔板中，密度1X106细胞/mL;每孔加入不同浓度的LPS刺激剂， 浓度梯度为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL;6h后分别取样，1800rpm 室温离心5min，弃上清，采用lmLTrizol/样本提取RNA，冻存于-80°C储存，实时荧光定量 PCR方法检测Toll样受体4的表达；其结果如图6所示；GAPDH(管家基因，135bp)引物序列： 上游引物：AACGGAITTGGTCGTAITG下游引物：ATGGGTGGAATCATAITGG TLR4(160bp)引物序列： 上游引物：AATCCCCTGAGGCAITTAGG下游引物：AACTCTGGATGGGGITTCCT 逆转录20yL反应体系： 成分用量（U L) Mix 4 Reverse transcriptase 1 Nuclease-free water 15 RNA template 10〇rg 剑 1 u g总RNA 反应程序：25°C5min;42°C30min;85°C5min;持续 4°C;cDNA标本放置-20°C储存； 步骤六：统计学分析 每次实验独立重复至少3次，所有实验数据描述为平均值土标准差（X土s);两个样本 均数的比较采用配对t检验，P〈0. 05认为有统计学意义，数据用SPSS13. 0统计软件进行分 析。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，未分化hESC的培养条件 为：mTeSRl培养基，37°C、5%C02培养。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，划分成的hESC每个小集落 为0. 5- 1X103细胞，50- 70个集落/6孔板每孔。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，hESC未分化细胞维持液： DMEM-F12 500mL KSR血清替代物 125mL L-谷氨酰胺 6.25mL NEAA 5mL 2-ME 5pL bFGF 3.5ug 造血诱导分化液具体为： IMDMnlninL 去补体化FBS 60ml. NEAA 5mL L-谷氨酰胺 lOmL AA 600uL 转铁蛋白 40pL VEGF 10ng 2-ME 5uL〇7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，诱导培养因子液具体为： 细胞因子培养液IA组： 造血诱导分化液添加细胞因子 SCF 20-100ng-/mL IL-6 20-1OOng/mL TPO 5ng/mL FLT3-L 5ng/raL IL-3 lOng/raL GM-CSF 20-1OOng/mL 细胞因子培养液IB组： 造血诱导分化液添加细胞因子 SCF 100-200ng-/tnL IL-6 100-200n8-/inL TPO 5ng/mL FLT3-L 5ng/mL IL-3 1Ong/triL 混匀，0. 22ym滤器过滤，置于4°C冰箱备用， 细胞因子培养液II: 造血诱导分化液添加细胞因子SCF 100-200ng/mL IL-3 10- 100ng/mL GM-CSF 10- 100ng/mL 细胞因子培养液III: 造血诱导分化液添加细胞因子IL-3 10- 100ng/mL IL-5 10- 100ng/mL 混匀，0. 22ym滤器过滤，置于4°C冰箱备用。8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，为了使嗜酸性粒细胞更加 成熟，在步骤3)后，再培养7天以后，用lmL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室 温离心5min，记为悬浮培养第21天。弃上清，加入细胞因子培养液III，培养于低粘24孔板 中，继续诱导嗜酸性粒细胞成熟；细胞置于37°C，5%C02孵育箱中孵育，根据细胞培养条件 2- 4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更好新鲜培 养液；7天以后，用lmL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮 培养第28天。9. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，计数板计数后，取1X10 5 细胞，1800rpm室温离心5min。10. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，特异性抗体选取 CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、 FceR1-PE、2D7_APC，浓度为每IX106细胞加 5uL。
【专利摘要】一种建立人胚胎干细胞向成熟嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，包括：hESCs H1细胞株维持未分化培养；mAGM-S3基质细胞的准备；H1细胞株与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞；造血干/祖细胞的液体悬浮培养；共培养及悬浮培养得到的细胞进行流式细胞学表面分子检测；选取无基质细胞培养条件下的H1细胞株未分化集落与经13.3GrayX射线照射的小鼠基质细胞AGM-S3共培养，获得多能造血干/祖细胞，悬浮培养，定向诱导分化为成熟嗜酸性粒细胞。之后进行计数、甩片、May-Giemsa染色观察细胞形态、免疫荧光染色观察Eos细胞内颗粒蛋白的表达、流式细胞学检测细胞表面分子的表达和进行功能实验。利用本方法能显著提高嗜酸性粒细胞体外诱导分化的效率。
【IPC分类】C12N5/0735, C12N5/0787
【公开号】CN104911149
【申请号】CN201510330014
【发明人】马峰
【申请人】中国医学科学院输血研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月15日