头将悬浮培养第21天的细胞轻轻取出，1500rpm室温离心5min，弃上清， 培养基RPMI-1640+20 % FBS重悬于低粘六孔板中，密度I X IO7细胞/孔，细胞置于37°C， 5% C02孵育箱中培养50min，去除贴壁的巨噬细胞；轻取上清，PBS洗两遍，（2 - 5% )FBS/ PBS液I. 5mL/孔重悬于低粘24孔板中，密度IX IO6细胞/mL ;每孔加入不同浓度的LPS 刺激剂，浓度梯度为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL ;6h 后分别取样， 1800rpm室温离心5min，弃上清，采用ImL Trizol/样本提取RNA，冻存于-80°C储存，实时 荧光定量PCR方法检测Toll样受体4的表达；
[0031]
[0033] GAPDH (管家基因，135bp)引物序列：
[0034] 上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG
[0035] 下游引物：ATGGGTGGAATCATATTGG
[0036] TLR4(160bp)引物序列：
[0037] 上游引物：AATCCCCTGAGGCATTTAGG
[0038] 下游引物：AACTCTGGATGGGGTTTCCT
[0039] 逆转录20 μ L反应体系：
[0040] 成分 用量（PL) Mix 4 Reverse transcriptase I Nuclease-free water 15 RNA template IOOfg 到 I μ g 总 RNA
[0041] 反应程序：25°C 5min ;42°C 30min ;85°C 5min ;持续 4°C ;cDNA 标本放置-20°C储 存；
[0042] 步骤六：统计学分析
[0043] 每次实验独立重复至少3次，所有实验数据描述为平均值土标准差（X土 s);两个 样本均数的比较采用配对t检验，P〈0. 05认为有统计学意义，数据用SPSS13. 0统计软件进 行分析。
[0044] 进一步的，所述步骤一中，未分化hESCs的培养条件为：mTeSRl培养基，37°C、5% CO2培养。
[0045] 进一步的，所述步骤二中，mAGM-S3细胞的培养条件为：37°C、5% C02。
[0046] 进一步的，所述步骤三中，血细胞分化液具体为：
[0047] IMDM 5InmL FBS (去补体化) 60mL NEAA 5mL L-谷氨酰胺 IOmL AA 600 μ L 转铁蛋白 40 μ L VEGF 10 μ g 2-ME 5 μ L
[0048] 进一步的，所述步骤四中，细胞因子培养液具体为：
[0049] 细胞因子培养液I A组：
[0050] 造血诱导分化液加细胞因子
[0051] SCF 20ng/mL IL-6 20ng/mL TPO 5ng/mL FLT3-L 5ng/mL IL-3 lOng/mL GM-CSF 20ng/mL
[0052] 细胞因子培养液I B组：
[0053] 造血诱导分化液加细胞因子
[0054] SCF IOOng/mL IL-6 lOOng'/mL TPO 5ng/mL
[0055] FI/H-L 5ng/mL IL-3 lOng'/mL
[0056] 混匀，0· 22 μ m滤器过滤，置于4°C冰箱备用，
[0057] 细胞因子培养液II :
[0058] 造血诱导分化液加细胞因子
[0059] SCF 100ng/mL
[0060] IL-3 10ng/mL
[0061] GM-CSF 10ng/mL
[0062] 细胞因子培养液III :
[0063] 造血诱导分化液补加细胞因子
[0064] IL-3 10ng/mL
[0065] IL-5 10ng/mL
[0066] 混匀，0. 22 μ m滤器过滤，置于4°C冰箱备用。
[0067] 进一步的，所述步骤四中，为了使嗜酸性粒细胞更加成熟，在步骤3)后，再培养7 天以后，用ImL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮培养第 21天。弃上清，继续加入细胞因子培养液III，培养于低粘24孔板中，继续诱导嗜酸性粒细胞 成熟；细胞置于37°C，5% CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2- 4天更换培养液，将细 胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更好新鲜培养液；7天以后，用ImL枪 头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮培养第28天。
[0068] 进一步的，所述步骤一中，特异性抗体选取CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、 0)45411'(：、0)43411'(：、0)14^^、(3-1(行-4?(：、？〇￡1?1^^、207-4?(：，浓度为每1\10 6细胞加 5uL〇
[0069] 分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约 IX IO4细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，IOOuL PBS重悬，加样到甩片离心机中，以 550rpm室温离心5min，制备细胞甩片。将制备的细胞甩片置于湿盒中，4%多聚甲醛（PFA) 固定 30min，PBS 洗绦 3 次，0· 1% Triton-100/5%脱脂奶粉（skimmed milk，SM)/PBS 破膜 30min，添加一抗为l:100稀释的羊抗人EP0抗体，4°C孵育过夜（8-20小时），5%SM/PBS 洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG(H+L)-Cy?3,室温摇晃孵育30min，0. 1% Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1 一5min，PBS洗涤3次，湿润封片 后在荧光显微镜下观察拍照。
[0070] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0071] 本发明设计出最优化的体外高效定向诱导培养成熟嗜酸性粒细胞的实验方法，在 体外条件下成功地从hESCs定向诱导分化出高纯度的功能成熟嗜酸性粒细胞，为研宄人类 嗜酸性粒细胞早期发生、发育、分化、成熟提供了有益的基础。我们将hESCs和mAGM-S3共 培养细胞回收进行悬浮培养，并加入一系列促进造血和对嗜酸性粒细胞发育分化成熟起 重要作用的细胞因子后能够有效产生大量高纯度功能成熟嗜酸性粒细胞。
[0072] 本发明hESCs克隆与mAGM细胞共培养约10-14天后，早期造血干/祖细胞快速增 殖。我们对液体悬浮培养第〇、7、14、21天的细胞进行流式检测，发现造血干/祖细胞进入 液体悬浮培养阶段后，⑶88+Siglec-8 +细胞表达水平从不足0. 5%左右逐步增加到第21天 的95%以上，CD34+细胞比例从14%左右下降到约0. 05% ;CD45 +细胞从7%左右和CD43 + 细胞从14%左右扩增到几乎100%。仅有2% - 3%左右细胞表达c-Kit、Fc ε Rl和⑶14， 几乎不表达2D7。EPO+细胞比例从第0天的〈1/1000增加到第21天的细胞的96. 88%，第 0、7、14、21天的EPO+细胞比例与CD88+Siglec-8+细胞比例吻合。May-Giemsa染色发现，悬 浮培养第〇、7、14、21天嗜酸性粒细胞的增长规律与流式检测和免疫染色结果的规律相同。 镜下观察嗜酸性粒细胞与外周血嗜酸性粒细胞极其相似，胞体呈圆形或椭圆形，胞核多分 叶或杆状，染色质凝聚，胞质淡染呈淡紫红色，胞质中均匀分布密集粗大且折光性强的桔 红色颗粒，部分嗜酸性粒细胞破碎后颗粒常分散于细胞周围。
[0073] 本实验中通过使用LPS刺激我们培养的hESCs来源的嗜酸性粒细胞，发现在工作 浓度上升到l〇〇〇ng/ml，作用6小时后，细胞表面TLR4基因表达水平较未刺激状态的细胞有 明显升高，提示本实验方法培养出来的嗜酸性粒细胞具有天然免疫功能。
[0074] 液体悬浮培养过程中，前两周细胞持续扩增，第二周达到峰值，总细胞量从悬浮培 养第〇天的1. 218 X IO6增殖到第14天的7. 85 XlO6,第三周呈现下降趋势，大量非嗜酸性粒 细胞死亡。其中，嗜酸性粒细胞生长趋势与总细胞扩增趋势一致，在悬浮培养前两周迅速增 殖，从CD34+CD45+造血干/祖细胞定向诱导分化为嗜酸性粒细胞扩增约500倍以上，第三周 呈现下降趋势。嗜酸性粒细胞扩增趋势较总细胞量更为明显，而下降趋势则更趋于缓和，表 明嗜酸性粒细胞的扩增比例明显高于培养基中的其他种类细胞，且后期死亡比例也更低。
[0075] 我们也发现在悬浮培养的第一周阶段添加 GM-CSF相比于不加 GM-CSF的培养方 法，前者得到的成熟嗜酸性粒细胞的绝对数量比后者明显多。即便在减少了其他细胞因子 如SCF和IL-6的浓度的情况下，前者依然比后者高。由此，我们得到了一个嗜酸性粒细胞 培养的最优方案。
[0076] 我们开拓性地从hESCs定向诱导获得大量高纯度成熟Eos，首次将胚胎干细胞向 Eos诱导成功。通过这一系统有助于深入了解嗜酸性粒细胞早期发生、发育、分化及成熟过 程。未来将借助于更先进和优化的细胞分选仪器，对表达不同表面标记的细胞进行特异性 分选及再培养，可描绘出嗜酸性粒细胞发育分化过程中表面分子表达的演变过程，摸索出 嗜酸性粒细胞分化的路径。
【附图说明】
[0077] 图1是hESCs与mAGM-S3共培养造血诱导过程各阶段细胞生长情况，A:hESCs未 分化集落；B :mAGM-S3细胞；C :共培养Day4hESCs集落开始分化（4X) ;D :共培养Day9分化 集落和类血管结构（4 X) ;E:共培养DayHhESCs分化集落（4 X) ;F:共培养Day 14"铺路石 样"造血干/祖细胞（40X)。
[0078] 图2是hESCs与mAGM-S3共培养获得的细胞进行悬浮培养流程。
[0079] 图3a是悬浮培养第0 - 21天，流式方法检测细胞⑶34、⑶45、⑶43的表达情况， 表明本实验方法诱导hESCs向髓系诱导分化。
[0080] 图3b是悬浮培养第0-21天，流式方法检测细胞CD14、c_Kit、2D7、Fc ε Rl的表 达情况，表明本实验方法诱导得到的细胞并非肥大和嗜碱性粒细胞。
[0081] 图3c是悬浮培养第0 - 21天，流式方法检测细胞⑶88、Siglec-8的表达情况，表 明本实验方法诱导得到的细胞是嗜酸性粒细胞，而且早期加入细胞因子GM-CSF得到的嗜 酸性粒细胞纯度比早期不加入细胞因子GM-CSF的高。
[0082] 图4是hESCs/mAGM-S3共培养细胞悬浮培养阶段早期加入（A组）比不加入（B组） 细胞因子GM-CSF的培养基组合Eos扩增量更明显。
[0083] 图5是悬浮培养第0 - 21天，嗜酸性粒细胞染色观察。嗜酸性粒细胞胞内特异性 颗粒蛋白EPO的表达情况，间接免疫荧光染色（A组）和麦格氏-姬姆萨（May-Giemsa)染 色（B组）结果。
[0084] 图6是嗜酸性粒细胞在不同浓度的LPS刺激之后，TLR4的表达水平情况。在Iug/ ml的LPS浓度刺激下，TLR4的表达水平最高。
【具体实施方式】
[0085] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0086] 试验例1 :
[0087] hESCs细胞系Hl由中国医学科学院实验血液学国家重点实验室于2