一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种加巴喷丁的制备方法，特别涉及一种绿色、高效的化学-酶法合 成加巴喷丁的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 加巴喷丁（Gabapentin)是一种一线的抗癫痫药物，其化学名为1-氨甲基环己基 乙酸，分子式为C 19H17NO2。加巴喷丁是哺乳动物体中的一种重要神经递质一 γ -氨基丁酸 (GABA)的结构类似物，主要通过改变GABA的代谢来发挥药理作用，尤其对重症癫痫的治疗 效果明显。在高剂量下耐受性良好，不与血浆蛋白结合，毒性较低，半衰期较长，副作用小。
[0003] 由加巴喷丁的结构信息可知，加巴喷丁分子中包含有一个环己烷基、一个氨甲基 和一个乙酸基。因此，其合成多以环己烷基化合物为起始原料。目前，诸多研宄者以环己 酮、环己基甲醛、亚甲基环己烷、苯甲腈等为原料开发出了数十条合成路径。这些合成路径 所使用的皆为单纯的化学方法，他们各有优劣，但总体上依然普遍存在或多或少的缺陷， 如：反应步骤冗长、反应条件苛刻、需要使用有毒或者易燃易爆的危险性试剂、工艺过程不 经济等。因此，多数并不适用于工业化生产。Rex Alien等（ΕΡ0414262Α2)于1991年报 道的从1-氰基环己基乙腈经选择性水解、加氢合成加巴喷丁的方法。其过程如图1，图 1 中试剂和条件：（1)① Py/TiCl4,② NaCN/Et0H/H20 ; (2)Et0H/PhCH3/HClg/H20/3M NaOH/ MetOH ； (3) 10%Rh-C/H2(50psi)/Me0H/i-Pr0H or Raney Ni (50% in H2O)/Me0H/50 % NaOH/ H2(180psi)/i-Pr0H/THF。
[0004] 这条合成路径通过I-氢基环己基乙腈分子上两个氰基的选择性反应，分别引入 氨甲基和乙酸基，反应步骤较少，原料廉价易得，因而是一条可选路径。然而该路径之所以 未得到广泛应用，其原因在于：一方面，该路径需要使用大量的酸、碱及有机试剂。如反应 ⑵，每生产It 1-氰基环己基乙酸即需消耗HCl气体：0.94t，3M NaOH水溶液：2. 82m3,乙 醇：0. 71t，甲苯：3. 93m3,甲醇：0. 47m3,水：7. 06t ;另一方面，该路径的总体收率较低，反应 (2)中1-氰基环己基乙酸的收率为78%，反应（3)中加巴喷丁的收率最高仅为79%，最终 从1-氢基环己基乙腈到加巴喷丁，其总体收率最高仅为61. 62%。因此该路径的经济性及 环境友好性皆较低，从而限制了其工业化应用。鉴于此，我们尝试对该路径进行大量的改 进，尤其是对第二步及第三步反应的改进，从而构建出一条新的合成工艺。
[0005] 化学法水解1-氰基环己基乙腈生成1-氰基环己基乙酸，反应条件苛刻，环境污染 严重，且选择性差，得率低，原子经济性低。而腈水解酶的高催化选择性、高催化活力、温和 的催化条件为解决这一问题提供了方向。
[0006] 腈水解酶的工业化应用，其关键在于高效的酶生产技术，而高密度培养则使实现 这一目标成为可能。我们的另一项专利（CN 104212785 A)中详细描述了含可高效催化 1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸的腈水解酶，及其基因工程菌的高 密度培养技术。利用该技术，实现了工业化大规模生产此腈水解酶，这为后续加巴喷丁合成 的研宄奠定了基础。
[0007] -般而言生物催化主要包括：添加前体发酵法、游离酶法、静息细胞法、固定化酶 法、固定化细胞法等，这些方法各有特点。而就工业化应用而言，静息细胞法和固定化细胞 法由于避免了酶的纯化步骤，从而大大降低了生产成本。
[0008] 利用纯酶催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸在 本实验室的一篇论文里即有报道（Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry 49(2014)，2141-2148)。然而纯酶催化的弊端在于：（1)酶蛋白直接暴露于催化反应体系 内，稳定性大大降低，反应一段时间后酶活衰减明显；(2)酶的纯化过程复杂而繁琐，会大 大增加生产成本；(3)酶蛋白回收困难，且会对后续的反应产生影响，不利于分离。正是这 些缺陷，致使其不适合应用于工业化生产。
[0009] 与之相比，静息细胞催化则表现出了一定的优势。一方面，酶蛋白存在于相对 温和、适宜的细胞内环境，稳定性大大提高；另一方面，细胞收集操作简单、方便，避免了 繁琐的酶纯化过程；最后，静息细胞也更利于催化剂回收。利用含腈水解酶的静息细胞 催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸在我们的另一项专利（CN 104212785A)中即有论述。同时，我们的另一篇论文里也有详细报道（Xue et al/Catalysis Communications 66(2015) 121-125)。结果表明，催化水平较纯酶有大幅度提高。在此基础 上，我们初步建立了一条化学一酶法合成加巴喷丁的工艺。并报道于一篇论文里（Ya-Ping Xue et al/Catalysis Communications 66(2015)121-125)。
[0010] 该工艺中，首先用含腈水解酶的静息细胞催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生 成1-氰基环己基乙酸。由于静息细胞在催化过程中细胞破碎，导致大量的蛋白及有机大分 子物质被释放至反应体系，这些有机大分子物质会让后续的加氢催化剂中毒。因此，不得不 对酶催化转化液进行预处理。
[0011] 经过预处理后的含1-氰基环己基乙酸的水溶液可直接加氢生成加巴喷丁内酰 胺，然后加巴喷丁内酰胺经过一个简单的化学过程生成加巴喷丁纯品，其过程如图2所示。
[0012] 然而该工艺依然存在较为突出的缺陷，无法在工业化生产中得到应用：
[0013] (1)该工艺使用静息细胞作为催化剂，但静息细胞使用一次后酶活迅速衰减至 20%，这意味着静息细胞几乎只能使用一次，无法实现批次重复使用。然而就该生产加巴喷 丁的工艺而言，生物催化剂的生产成本恰是总成本的主要部分，因此，降低总成本，即必须 从提高生物催化剂利用率着手。
[0014] (2)静息细胞在催化过程中，随着细胞的破碎，大量的蛋白及有机大分子物质被释 放出来，这些物质会使后续的加氢催化剂中毒，为了解决这一问题，不得不对静息细胞催化 转化液进行预处理。使用三氯化铝絮凝，虽然能达到加氢要求，但是一方面，三氯化铝对设 备有一定的腐蚀作用；同时转化液中还存在少量的蛋白质。对加氢催化剂的重复使用存在 一定的影响，另一方面，预处理工序也会增加生产成本；
[0015] (3)该工艺并未实现水的循环利用，而废水处理恰恰也是总生产成本的一个重要 部分。
[0016] 为了解决这些问题，不得不对该工艺做进一步改进。首先，固定化细胞为解决使用 静息细胞催化所带来的问题提供了可能。将游离细胞固定化，可大大增强其机械强度，很好 的保证其细胞的完整性，避免了蛋白及大分子物质的泄漏问题，增强了酶的稳定性，从而使 得酶的批次重复使用成为可能。因此，研宄开发一种性能优异、制备工艺简单经济的固定化 细胞技术具有极大的现实意义。此外，需要设计更加优化的水及有机试剂循环利用的工艺， 从而进一步降低生产成本。本发明正是基于这一思路展开的探索与研宄。 (三）
【发明内容】
[0017] 本发明的目的是提供一种绿色、高效的化学-酶法合成加巴喷丁的方法，即首先 利用固定化细胞催化1-氰基环己基乙腈选择性水解生成1-氰基环己基乙酸，然后含1-氰 基环己基乙酸的酶催化转化液直接加氢生成加巴喷丁内酰胺，最后加巴喷丁内酰胺经水 解、碱化生成加巴喷丁，并在该过程中实现废水及其他试剂的循环使用，最终得到一条绿 色、经济、高效的加巴喷丁合成工艺。
[0018] 本发明采用的技术方案是：
[0019] 本发明提供一种化学-酶法生产加巴喷丁的方法，所述的方法为：（1)酶催化：以 含腈水解酶的固定化细胞为酶源，以1-氰基环己基乙腈为底物，以水或磷酸盐缓冲液为反 应介质，在20-50°C、100-350rpm条件下进行转化反应（优选20-50°C、100-350rpm条件下 反应l-5h，更优选35°C、200rpm条件下反应2. 5h)，反应结束后，将转化反应液过滤，获得 滤饼和滤液，滤饼回收酶源，滤液即为含1-氰基环己基乙酸的转化液；所述含腈水解酶的 固定化细胞按如下方法制备：将含腈水解酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌 体加入缓冲液（优选pH = 7. 0、IOOmM磷酸盐缓冲液）或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬液 中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝〇. 5~2h，然后加入戊二醛进行交联， 10~25°C搅拌交联0. 5~a后，弃去上清液，真空抽滤后，获得固定化细胞；所述腈水解酶 基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示；所述 载体为硅藻土、珍珠岩或活性炭；所述载体与菌悬液中湿菌体重量比为〇. 01~〇. 1 :1 (优 选0. 04~0. 09:1);所述缓冲液或蒸馏水体积用量以湿菌体湿重计为5ml/g~15ml/g ;所 述戊二醛以体积浓度25% (v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25% (v/v)戊二醛水溶液 体积用量以湿菌体重量计为〇. 05~0. 5ml/g (优选0. lml/g);所述聚乙稀亚胺以体积浓度 5 % (v/v)聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所述5 % (v/v)聚乙烯亚胺水溶液体积用量以湿菌 体重量计为0. 01~I. 〇ml/g (优选0. 3ml/g)，本发明所述聚乙稀亚胺分子量70000,聚合度 1600 ；
[0020] (2)加氢反应：取步骤（1)含1-氰基环己基乙酸的转化液于加氢反应釜中， 加入加氢催化剂，通入氢气，于0-300°C、400-1200rpm条件下搅拌反应（优选0-300°C、 400-1200rpm条件下搅拌反应4-20h，更优选110°C、1000 rpm条件下搅拌反应9h)，反应完 全后将反应液冷却至30-80°C (优选60°C )，放空氢气，将反应液过滤，获得滤液和滤饼， 滤饼回收催化剂，滤液冷却至室温后加入等体积的二氯甲烷萃取（优选萃取3次），静置 分层（优选于分液漏斗中静置l_8h，更优选5h)，获得有机相和水相，有机相经旋蒸（优选 35-60°C，更优选40°C )得加巴喷丁内酰胺晶体，加巴喷丁内酰胺晶体进行水解反应生成加 巴喷丁盐酸盐，然后加巴喷丁盐酸盐进行碱化反应，获得加巴喷丁，二氯甲烷回收再利用； 水相通过蒸氨法（即于25-150°C，优选55°C下旋蒸，收集氨气，直至母液pH达7. 0左右） 回收氨气和废水，而废水则回收作为反应介质用于步骤（1)中的酶催化反应；所述加氢催 化剂为雷尼镍。
[0021] 进一步，步骤（2)所述水解反应为：取加巴喷丁内酰胺晶体与0. l-12mol/L的HCl 水溶液混合（优选6mol/L)，加热回流I-IOh (优选4h)，回流反应液冷却至室温，加入二氯 甲烷萃取，有机相回收未反应的加巴喷丁内酰胺，水相于〇_4°C冷却结晶，过滤得白色固体， 滤液回收补充HCl后用于加巴喷丁内酰胺水解反应；所得白色固体于丙酮中研磨，过滤，滤 饼于40°C下干燥得加巴喷丁盐酸盐，其中二氯甲烷及丙酮通过旋蒸回收再利用，而回收所 得的加巴喷丁内酰胺则继续水解；所述加巴喷丁内酰胺晶体用量以HCl水溶液体积计为 15. 3-612. 8g/L，更优选 153. 2g/L。
[0022] 进一步，步骤⑵所述碱化反应为：取加巴喷丁盐酸盐加入水中，20-60°C (优选 40°C )下搅拌溶解，调pH值至L 0-7. 5,加入甲苯，搅拌10-120min (优选30min)，于0-4°C 下冷却结晶，过滤得白色晶体，滤液回收与加巴喷丁盐酸盐混合后，继续下一次碱化反应， 白色晶体于甲醇或异丙醇中重结晶，得加巴喷丁；所述加巴喷丁盐酸盐用量以水体积计为 20. 8-1038. 4g/L，更优选 726. 9g/L ;所述调 pH 值至 L 0-7. 5 所用试剂为 0· l-12mol/L 的 NaOH水溶液，也可以用其他碱，更优选10mol/L的NaOH水溶液；所述甲苯与水体积比为 0· 05-0. 8:1，更优选 0· 25:1。
[0023] 进一步，步骤（1)所述酶源用量为1.0~3. 5g/L反应介质（更优选2. 2g/L)，所述 底物终浓度为〇· 2-1. 5mol/L(更优选0· 5mol/L) 〇
[0024] 进一步，步骤（2)所述加氢催化剂与1-氰基环己基乙腈的质量比为0.02-0.3:1， 更优选0. 1:1。
[0025] 进一步，步骤（2)所述通入氢气前先通入氮气置换空气，（优选置换3次），氢气通 入量为〇. 5-5MPa，更优选2MPa。
[0026] 本发明所述含腈水解酶基因的重组基因工程菌是将Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶突变体基因 F168V(核苷酸序列为SEQ ID N