GACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAAC TGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG CCTGGCATTATGCCCATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACAGTACATCAATGGGCGTGGATAGC GGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGA (SEQ ID NO ：3)
[0046] 增强子4 :
[0047] TAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCAT TGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTC AATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCTATTGACGTCAATG ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGG (SEQ ID NO ：4)
[0048] 增强子5 :
[0049] TACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATACTGAGTCAATAGGGACTTTCCA TTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGT CAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCAGCCAATTTAATTAA AACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGG (SEQ ID NO ：5)
[0050] 实施例2hCMV增强子的扩增
[0051] 以质粒pIRESneo3 (购自Clontech公司）为模版，hCMV增强子序列为参考，设计引 物（5<与：V端添加 NruI (TCGCGA)酶切位点）进行聚合酶链式反应，扩增出hCMV增强子 序列，反应条件如表1。
[0052] 所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57 (购自Fermentas公司）连接，并进行测 序鉴定以获得正确的目的序列。
[0053] 表1 PCR反应条件
[0054]
[0055] 实施例3人EF-I α启动子的扩增
[0056] 以质粒pEF6/V5_HisA (购自Invitrogen公司）为模版，人EF-I α启动子序列为 参考，设计引物，进行聚合酶链式反应，扩增出人EF-Ια启动子序列，反应条件如表1。
[0057] 所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57 (购自Fermentas公司）连接，并进行测 序鉴定以获得正确的目的序列。
[0058] 实施例4SV40早期启动子的扩增
[0059] 以质粒pEF6/V5-HisA (购自Invitrogen公司）为模版，SV40早期启动子序列为参 考，设计引物，进行聚合酶链式反应，扩增出SV40早期启动子序列，
[0060] 反应条件如表1。
[0061] 所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57 (购自Fermentas公司）连接，并进行测 序鉴定以获得正确的目的序列。
[0062] 实施例5重组pCV表达载体的构建
[0063] 将人 IgGl 重链恒定区（genebank ID:3500,5 ^ 端添加了 Kozak 序列）经 NheI/ BamHI双酶切处理后，连接至Nhel/BamHI双酶切后的质粒pIRESne〇3 (pCV)，所获得的重组 质粒命名为pCV-CHh。
[0064] 将增强子1，增强子2,增强子3,增强子4,增强子5分别替换pCV-CHh载体中的 hCMV增强子。所获得的重组质粒分别命名为pCV-CHl，pCV-CH2, pCV-CH3, pCV-CH4, pCV-C H5。
[0065] 实施例6重组pCV表达载体瞬时转染表达研究
[0066] 米用脂质体法（freestyle MAX，invitrogen)将质粒 pCV-CHh，pCV-CHl, pCV_CH2， PCV-CH3, pCV-CH4, pCV-CH5分别转染CHO-S细胞，检测CH瞬时表达水平。
[0067] 按照 freestyle MAX 操作说明书，将 5 μ g pCV-CHh，pCV-CHl, pCV-CH2, pCV-CH3, p CV-CH4, pCV-CH5质粒分别转染培养于6孔板（3ml/welI)的CHO-S细胞(约3 X IO6个细胞)。 转染细胞在8%C02 , 37°C的Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用ELISA法检 测人 IgG 重链（CH)表达量。pCV-CHh，pCV-CHl, pCV-CH2, pCV-CH3, pCV-CH4, pCV-CH5 的表达 量分别是390ng/ml, 921ng/ml, 428ng/ml, 460ng/ml, 500ng/ml, 403ng/ml。结果显示，本发明 增强子相对于hCMV增强子，在相同条件下，将CH表达量提高了 2倍多，见图1。
[0068] 实施例7重组pEF表达载体的构建
[0069] 将实施例3中的产物与pIRESne〇3质粒进行Spel/Nhel双酶切连接，获得质粒 pEF〇
[0070] 将人 IgGl 重链恒定区（genebank ID:3500,5 '端添加了 Kozak 序列）经 NheI/ BamHI双酶切处理后，连接至Nhel/BamHI双酶切后的质粒pEF，所获得的重组质粒命名为 pEF-CH。
[0071] 将hCMV增强子，增强子1，增强子2,增强子3,增强子4,增强子5分别用NruI酶 处理，PEF载体用NruI酶处理。将上述增强子酶切产物分别与pEF酶切产物连接，所获得 的重组质粒分别命名为 pEF-CHh，pEF-CHl, pEF-CH2, pEF-CH3, pEF-CH4, pEF-CH5。
[0072] 实施例8重组pEF表达载体瞬时转染表达研究
[0073] 米用脂质体法（freestyle MAX, invitrogen)将质粒 pEF-CHh，pEF-CHl, pEF_CH2, PEF-CH3, pEF-CH4, pEF-CH5分别转染CHO-S细胞，检测CH瞬时表达水平。
[0074] 按照 freestyle MAX 操作说明书，将 5 μ g pEF-CHh，pEF-CHl, pEF-CH2, pEF-CH3, p EF-CH4, pEF-CH5质粒分别转染培养于6孔板（3ml/welI)的CHO-S细胞(约3 X IO6个细胞)。 转染细胞在8%C02 , 37°C的Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用Elisa法检 测人 IgG 重链恒定区表达量。pEF-CHh，pEF-CHl, pEF-CH2, pEF-CH3, pEF-CH4, pEF-CH5 的 CH 表达量分别是 460ng/ml, 1260ng/ml, 603ng/ml, 530ng/ml, 820ng/ml, 469ng/ml。结果显示， 本发明增强子相对于hCMV增强子，在相同条件下，CH表达量提高了近3倍，见图2。
[0075] 实施例9重组pSV表达载体的构建
[0076] 将实施例4中的产物与pIRESne〇3质粒进行Spel/Nhel双酶切连接，获得质粒 pSV。
[0077] 将人 IgGl 重链恒定区（genebank ID:3500,5 '端添加了 Kozak 序列）经 NheI/ BamHI双酶切处理后，连接至Nhel/BamHI双酶切后的质粒pSV，所获得的重组质粒命名为 pSV-CH。
[0078] 将hCMV增强子，增强子1，增强子2,增强子3,增强子4,增强子5分别用NruI酶 处理，PSV载体用NruI酶处理。将上述增强子酶切产物分别与pSV酶切产物连接。所获得 的重组质粒分别命名为 pSV-CHh, pSV-CHl, pSV-CH2, pSV-CH3, pSV-CH4, pSV-CH5。
[0079] 实施例10重组pSV表达载体瞬时转染表达研究
[0080] 米用脂质体法（freestyle MAX, invitrogen)将质粒 pSV-CHh，pSV-CHl, pSV-CH2, PSV-CH3, pSV-CH4, pSV-CH5分别转染CHO-S细胞，检测CH瞬时表达水平。
[0081] 按照 freestyle MAX 操作说明书，将 5 μ g pSV-CHh，pSV-CHl, pSV-CH2, pSV-CH3, p SV-CH4, pSV-CH5质粒分别转染培养于6孔板（3ml/welI)的CHO-S细胞(约3 X IO6个细胞)。 转染细胞在8%C02, 37°C的Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用ELISA法 检测 CH 表达量。pSV-CHh，pSV-CHl, pSV-CH2, pSV-CH3, pSV-CH4, pSV-CH5 的表达量分别是 230ng/ml, 505ng/ml, 200ng/ml, 191ng/ml, 303ng/ml, 231ng/ml。结果显不，本发明增强子相 对于hCMV增强子，在相同条件下，CH表达量提高了 2倍，见图3。
【主权项】
1. 一种人工合成的增强子，其特征在于所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 /Jn〇2. -种哺乳动物细胞表达载体，其特征在于所述表达载体含有权利要求1所述的核苷 酸序列。3. 根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于所述核苷酸序列位于表 达载体启动子的5'端或者3'端。4. 根据权利要求3所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于所述表达载体启动子选 自hEF-1 a启动子、hCMV启动子或者SV40早期启动子。5. -种哺乳动物宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为权利要求2-4任一所述表达载 体所转染。6. 根据权利要求5所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为CHO、BHK、 SP2/0、HEK293 或者 C127。7. 根据权利要求6所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为CHO细胞。8. -种哺乳动物来源蛋白质的表达方法，其步骤包括， a，将权利要求1所述的增强子序列插入哺乳动物细胞表达载体启动子的5'端或者3' 端， b，在增强子序列插入之前或者之后加入哺乳动物来源蛋白质的核苷酸序列， c，哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物宿主细胞， 山培养哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。9. 一种如权利要求1所述的增强子在提高哺乳动物来源蛋白质表达量的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种人工合成的DNA增强子及其应用。本发明增强子可添加于哺乳动物细胞的重组蛋白表达载体，用于增强启动子转录活性强度，从而增强哺乳动物或者其他来源蛋白质的分泌表达，将其在动物细胞中的外源蛋白表达量大幅度提高。
【IPC分类】C12N15/67, C12N15/113, C12N15/85, C12N5/10
【公开号】CN104975018
【申请号】CN201410129992
【发明人】张玉晶, 张成海, 周远锋
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日