-寡聚核巧酸捕获探针溶液，于4°C保存W备使用（参见图2)。
[0039] 3)对食氨酸脱硫弧菌特异性DNA片段的检测实验
[0040] 将10yL磁性微球修饰的捕获探针，10yL信号探针DNA2,W及提取的食氨酸 脱硫弧菌特异性DNA目标链混合至并于37°C反应30分钟。反应得到的溶液通过磁 性分离得到沉淀物并定容至2mU并用于流式细胞仪检测。每个样取100000个点，并至少 重复检测S次取平均值得到总巧光强度（参见图3)。
[0041] 由图3所示，当目标菌种浓度在2X104至5X106c化1ml/i范围时，巧光信号度随 着细菌浓度的增加而增强，最低检测浓度为2X104c化1ml/i，其相对巧光信号强度与细菌 浓度的对数成良好的线性关系，线性回归方程为Y= 142. 011抽-352. 18 (Y为相对巧光信号 强度；X为目标细菌的浓度，n= 6,R= 0. 9764)。
[0042] 实施例2
[0043] 基于磁性微球-寡核巧酸探针对不同种类的硫酸盐还原菌（食氨酸脱硫弧菌、致 黑脱硫肠状菌）进行选择性检测：
[0044] 1)提取致黑脱硫肠状菌的特异性DM片段
[0045] 取含有致黑脱硫肠状菌的水溶液（4~6mL)加入到200mL培养基中，培养3~4 天，将细菌进行离屯、分离（离屯、速度为8000-10000转/分钟，离屯、时间8-10分钟）后，将 上层液吸出倒掉，取下层SRB细胞沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒处理。提取纯化得 到的DNA依次与化qDNA聚合酶及特异性引物混合进行PCR扩增反应，用量如下；DNA模 板，5yL;超纯水，15. 8yL;聚合酶缓冲溶液，2. 5yL;dNTPs，0. 5yL;引物1，0. 5yL;弓I 物2, 0. 5yL;taq聚合酶，0. 2yL。热循环温度如下：预变性（94°C, 5min) ;35循环，变性 (94°C，30s)，退火（55°C，30s)，伸展（94°C，30s);终止（72°C，7min)。将得到的特异性 DM片段作为选择性检测的目标样品。
[0046] 2)提取食氨酸脱硫弧菌的特异性DNA片段
[0047] 取含有食氨酸脱硫弧菌的水溶液（4~6血）加入到200mL培养基中，培养3~4 天，将细菌进行离屯、分离（离屯、速度为8000-10000转/分钟，离屯、时间8-10分钟）后，将 上层液吸出倒掉，取下层SRB细胞沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒处理。提取纯化得 到的DNA依次与化qDNA聚合酶及特异性引物混合进行PCR扩增反应，用量如下；DNA模 板，5yL;超纯水，15. 8yL;聚合酶缓冲溶液，2. 5yL;dNTPs，0. 5yL;引物1，0. 5yL;弓I 物2, 0. 5化；taq聚合酶，0. 2yL。热循环温度如下：预变性巧4°C，5min) ;35循环，变性 (94°C，30s)，退火（55°C，30s)，伸展（94°C，30s);终止（72°C，7min)。将得到的特异性 目标DNA片段作为选择性检测的对比样品。
[0048] 3)磁性微球-寡聚核巧酸捕获探针的构建
[0049] 试验中所用到的亲和素修饰的磁性纳米微球（1. 02ym，lOmg.m。）购买于挪威英 杰生命科技有限公，所需的人工合成寡聚核巧酸值Ml,DM2)由上海生工生物工程有限公 司合成。
[0050]所述DNA序列为DNA1 ;biotin-AAAAAAAAAGGGACGCG(5, -3,）；DNA2 ; GACCCATAAAAAAAAA-切5(5' -3'）
[CK)5U首先，取lOuL亲和素修饰的磁珠用磁珠清洗溶液重复清洗四次后定容至ImL;其次，将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DM1混合，具体结合比例为；ImL， lOmg.mL-i磁珠对应1血，5nMDM1，反应条件为25°C，150转摇床2小时。反应结束后，用 磁珠清洗溶液重复清洗结合DNA探针的磁珠四次并将其最终定容到ImL反应缓冲溶液中即 得到基于磁性微球-寡聚核巧酸捕获探针溶液，于4°C保存W备使用。
[0052] 4)对不同种类的硫酸盐还原菌（食氨酸脱硫弧菌、致黑脱硫肠状菌）进行选择性 检测
[0化3] 将10yL磁性微球修饰的捕获探针，10yL信号探针DNA2,W及提取的DNA目标 链样品混合至并于37°C反应30分钟。提取的DNA目标链样品依次为空白样，目标 样，对比样，目标样与对比样混合样品，其中，目标样为致黑脱硫肠状菌的特异性DNA片段， 对比样为食氨酸脱硫弧菌的特异性DNA片段。反应得到的溶液通过磁性分离得到沉淀物并 定容至2mU并用于流式细胞仪检测。每个样取100000个点，并至少重复检测S次取平均 值得到总巧光强度（参见图4)。
[0054] 如图4所示，对比样品（即食氨酸脱硫弧菌的特异性DNA片段）的巧光信号与空 白样近似，说明捕获探针并不能捕获特异性目标DNA链，从而无法获得巧光信号，具有高度 的选择性。而混合样的巧光信号与目标样强度（致黑脱硫肠状菌的特异性DM片段）相差 不大，说明此检测系统对于混合样具有高度的检测识别能力，且对比样品的存在对目标样 品的检测干扰性不大。
【主权项】
1. 一种检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于：利用基于磁性微球及 寡核苷酸探针对不同种类SRB特异性DNA片段为目标检测物，间接对SRB进行荧光检测。2. 按权利要求1所述的检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于：所述 磁性微球及寡核苷酸探针为亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA 1、信号探针 DNA 2,以及不同种类硫酸盐还原菌特异性DNA杂交获得； 其中，磁性微球-捕获探针DNAl与目标检测物DNA链部分片段结合形成双链，目标检 测物DNA单链未结合部分与DNA2信号探针结合。3. 按权利要求1所述的检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于：所述 杂交条件为将磁性微球-捕获探针、荧光信号探针及不同浓度SRB特异性DNA片段按1: 1:1 的体积比混合，于37-40°C摇床孵育30-60分钟。4. 按权利要求1或2所述的检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于： 所述不同种类硫酸盐还原菌特异性DNA为将SRB种群于SRB选择性培养基上在25-40°C，隔 绝空气条件下进行富集，然后将SRB细菌进行清洗并利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取 细菌DNA ; 以利用不同种类的SRB特异性引物对上述提取的细菌DNA进行聚合酶链式反应（PCR) 扩增得到细菌特异性DNA片段。5. 按权利要求4所述的检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于：所用 SRB选择性培养基配方为：1升陈海水中加入0. 4-1. 0克NaSO4,0. 2-0. 6克K2HPO3,1. 0-2. 0 克 NH4C1，0. 1-0. 5 克 CaCl2,1. 5-4. 0 克 MgSO4,1. 0-3. 0 克酵母浸出膏，3-5 毫升乳酸钠。6. 按权利要求4所述的检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于：所 述聚合酶链式反应用量为模板DNA，5. 0-6. 0 y L ;超纯水，10. 0-16. 0 y L ;聚合酶缓冲溶 液，L 0-3. 0 y L ;三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs)，0? 5-1. 0 y L ;上游引物，L 0-2. 0 y L ;下 游引物，〇. 5-2. 0 y L ;耐热DNA聚合酶，0. 2-0. 5 y L ;或所述上下游引物的用量相反； 反应条件为：复制起始（94°C，5-10min) ;35个循环变性（94°C，30-60s)，退火处理 (55°C，30-60s),延伸（94°C，30-60s);终止（72°C，7-10min)。7. 按权利要求1所述的检测不同种类硫酸盐还原菌（SRB)的方法，其特征在于：所述 荧光检测是将信号收集于流失细胞仪（BD FACS Aria II )，激光光源为25mW，639nm，分析速 度为 10000events/s。
【专利摘要】本发明涉及到硫酸盐还原菌(SRB)的检测，具体为一种基于磁性微球及寡核苷酸探针检测不同种类硫酸盐还原菌的方法。利用基于磁性微球及寡核苷酸探针对不同种类SRB特异性DNA片段为目标检测物，间接对SRB进行荧光检测。基于磁性微球及寡核苷酸探针对提取的不同种类SRB所特有的DNA片段为目标检测物，间接对SRB进行检测，具有高度特异性。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104988215
【申请号】CN201510301122
【发明人】曾艳, 张盾
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月4日