-样品识别。在IlluminaMiSeq(SanDiego，CA)上对扩增 后产物一并进行纯化、定量和测序。将测序阅读片段与人基因组比对，如图4中，映射到每 个DMD探针的阅读片段的数目进行计数、标准化和作图。从图4的图表中明显地，标准化的 阅读片段计数揭示了男性患者的外显子49-52的完全缺失，和女性携带患者（男性患者的 母亲）的外显子49-52的杂合缺失。DMD是X连锁基因，且因此缺失将在男性中显示为零阅 读片段计数，而在携带者女性中显示为大约为对照的一半的阅读片段计数。该些注释符合 从基因储藏库获得的原始患者基因型的注释，且因此证实了通过MLPA-SBS的拷贝数检测。 [007引 实施例II
[0079]MLPA原理论证
[0080] 该个实施例示出了采用用于读出的商业化系统（Illumina,Inc.，SanDiego,CA) 的高度多重MLPA的用途。
[0081] 如下设计用于DMD、BRCA1/2、PMS2、SMN1/2和对照基因的无填充探针。左和右探 针序列（LP0和RP0)附带有使得能够用Illumina索引引物进行扩增的序列。对于每个探 针对，LP0序列（其与基因组退火）在它的5'端附接W产生如下寡核巧酸：
[0082] 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-[LP0]-3'，沈QIDN0:5。类似地，各 个探针对中的RP0在它的3'端附接W产生如下寡核巧酸
[0083] 5' -P- [RP0]-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'，沈QIDNO: 6。该个RP0 寡核巧酸也用5'磯酸醋修饰W利于在邻近LP0退火时的连接。
[0084] 部分左接头：
[00化]5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-LP0,沈QIDN0:7
[0086] LPO是左探针寡核巧酸，其对应于与基因组DM祀退火的互补序列。
[0087] 部分右接头（具有标记为叩"的5'磯酸醋）：
[0088] P-RP0-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'，沈Q IDN0:8
[0089] RPO==右侧探针寡核巧酸，其对应于与直接邻近LPO的基因组DM祀退火的互补 序列。
[0090] 使用标准寡核巧酸合成方法合成了两百五十走个探针对并W等摩尔量合并。
[OOW] 将上述探针对的池与变性的基因组DM杂交，将退火的探针对连接并使用下述引 物扩增。
[0092] 在成功的杂交和连接之后，探针对构型如下；
[0093] 5' -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-LP0-RP0-AGATCGGAAGAGCACACGTCTG AACTCCAGTCAC-' 3,SEQIDNO:9
[0094] 使用所示引物的连接后扩增添加了Illumina测序所要求的额外序列，特别是流 动池扩增和样品多重识别。
[00巧]AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT,SEQID NO: 10
[00化]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-LP0-RP0-A GATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC TCCAGTCAC，沈Q ID NO:11
[00巧]CTTGAGGTCAGTG(TAGTGC)TAGAGCATACGGCAGAAGAC GAAC，沈Q ID NO: 12 [009引PCR引物，索引1(ATCACG)SEQ ID N0:13
[0099] 该个试验在含有前文表征的DMD基因拷贝数变化的八个样品上进行。使用50bp单 端运行在Illumina MiSeq上对产物进行测序。将阅读片段映射到基于标签的参照物上，将 每个标签的命中针对每个样品的总产率标准化。标准化的标签计数示于图5到12中。所 有八个事件都是可容易检测的，而不需要标准化阅读片段计数的复杂分析。
[0100] 原始提交的和可能经过修改的权利要求包括本文所公开的实施方式和教导的变 化、替代、改变、改进、等同和基本上等同，包括目前未预见的或未预料的，和例如可由申请 人/专利权人和其他人得出的那些。除非在权利要求中明确记载，权利要求的步骤或组分 有关任何特定顺序、数量、位置、尺寸、形状、角度、颜色或材料不应从说明书或其他权利要 求中暗示或得出。
[0101] 本文中设及的所有专利和申请都据此明确通过引用在此将全文并入本说明书中。
【主权项】
1. 多重连接依赖性探针扩增方法，其包括： (a) 提供样品组织以查询多个不同的靶核酸； (b) 针对所述多个不同靶核酸中的每一个提供多个不同的探针组，其中每个探针组包 含： 第一基因座特异性探针，其包含第一接头序列和第一靶特异性部分；和 第二基因座特异性探针，其包含第二接头序列和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶 特异性部分； (c) 将所述多个不同探针组与所述多个不同靶序列杂交以形成多个杂交复合体； (d) 连接所述多个杂交复合体以形成多个连接的探针； (e) 扩增所述多个连接的探针以形成多个扩增子，其中所述扩增步骤使用第一通用引 物和第二通用引物进行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补的区域，所述第 二通用引物包含与所述第二接头序列互补的区域；和 (f) 通过对所述多个扩增子的每一个进行测序在检测系统中与长度无关地检测所述多 个扩增子。2. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括测定所述多个不同靶核酸中每一个的拷 贝数。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多个不同靶核酸多于约100个。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多个不同靶核酸在约50到约100个靶核酸的 范围内。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多个不同靶核酸在约100到约500个靶核酸 的范围内。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多个不同靶核酸在约100到约1000个靶核酸 的范围内。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多个不同靶核酸在约100到约10 8个靶核酸 的范围内。8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一通用引物和所述第二通用引物中的至少 一个进一步包含索引序列。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测系统包括合成测序。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述检测系统包括配置在包含所述多个扩增子 的阵列上进行合成测序循环的流体处理系统，所述检测系统被配置为将辐射从源引导至所 述阵列并将荧光发射从所述阵列引导至照相机，和配置为自动改变所述检测系统以增加引 导至所述阵列的所述辐射的暴露水平和在所述增加的暴露下检测从所述阵列到所述照相 机的荧光发射的系统控制界面。11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测单核苷酸多态性。12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括测定所述多个不同靶核酸的至少 一部分的甲基化程度。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括定量靶mRNA。14. 一种方法，其包括： 提供检测系统，所述检测系统包括配置为在包含多个扩增子的阵列上进行合成测序循 环的流体处理系统，该检测系统被配置为将辐射从源引导至所述阵列并将荧光发射从所述 阵列引导至照相机，和配置为自动改变所述检测系统以增加引导至所述阵列的所述辐射的 暴露水平和在所述增加的暴露下检测从所述阵列到所述照相机的荧光发射的系统控制界 面， 通过多重连接依赖性探针扩增提供所述多个扩增子；和 测定所述多个扩增子的序列。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述多个扩增子多于约100个。16. 根据权利要求14所述的方法，其中所述多个扩增子在约50到约100个靶核酸的范 围内。17. 根据权利要求14所述的方法，其中所述多个扩增子在约100到约500个靶核酸的 范围内。18. 根据权利要求14所述的方法，其中所述多个扩增子在约100到约1000个靶核酸的 范围内。19. 根据权利要求14所述的方法，其中所述多个扩增子在约100到约10 8个靶核酸的 范围内。20. 根据权利要求14所述的方法，其中所述方法用于测定拷贝数、单核苷酸多态性的 存在、甲基化程度和mRNA的量中的至少一个。
【专利摘要】用于多重连接依赖性探针扩增方法包括(a)提供含有不同靶核酸的样品组织，(b)针对每个靶核酸提供不同的探针组，每个探针组包含具有第一接头序列和第一靶特异性部分的第一基因座特异性探针及具有第二接头序列和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分的第二基因座特异性探针，(c)将所述探针组与所述靶序列杂交以形成杂交复合体；(d)连接所述杂交复合体以形成连接的探针，(e)扩增连接的探针以形成扩增子，和(f)通过对每个扩增子进行测序在检测系统中检测扩增子。
【IPC分类】C07H21/04, C12P19/34, C12Q1/68
【公开号】CN104995309
【申请号】CN201380072327
【发明人】E·奥利瓦瑞斯, J·索伦森, T·兰德斯
【申请人】因维蒂公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2013年12月6日
【公告号】CA2894381A1, EP2929044A1, US20140235470, WO2014089536A1