量：酵母细胞计数、基 质的终浓度（葡萄糖、DP2、DP3、和DP4+，其中"DPx"表示具有"x"个亚单元的葡萄糖寡聚 物）、发酵产物（乙醇、甘油、乳酸和乙酸）、总干固体、以及溶解的干固体和发酵物液相密 度。使用标准操作步骤进行所有的测量。通过在去离子水中以100稀释因子稀释以制备用 于酵母细胞计数的样品，并且利用亚甲蓝染色以评估活性，然后使用血细胞计数器来进行 显微计数。通过HPLC来确定底物和发酵产物的终浓度。通过离心（8,OOOxg，3分钟）来除 去大的固体并随后利用〇. 45ym注射器式过滤器过滤以制备用于HPLC的样品，利用硫酸酸 化至0.OlN的终浓度。基于在105°C干燥3小时过程中的质量损失，来通过重量测定总固体 和溶解的固体的浓度。通过离心并随后利用〇. 45ym注射器式过滤器过滤上清液以制备用 于测量溶解固体和液相密度的样品。利用Anton-Parr光密度计测定发酵物液相密度。
[0150] 图4示出了所有处理的发酵速率。其中一个明显的区别在于染菌对照（1C)，与其 它处理相比，其显示出较少的总质量损失。这完全由于一个发酵烧瓶，但是其影响通过IC 处理相对与其它处理较大的误差棒所表示。因此，最终质量损失上的不同不能认为是统计 上显著的。还可以观察到在约16小时之后，对于两个最高的BRONAVf20剂量，质量损 失似乎稍有降低。尽管这些差异是可以再现的并且是统计上显著的，但其似乎不太重要，因 为在24小时（其仅为工业标准温育时间的约一半）之后，这两个处理的质量损失与无染菌 对照（IFC)是相同的。
[0151] 每个处理的乳酸终浓度和乙醇产率如图5和6所示。变量分析（ANOVA)显示在 两个端点处理之间存在显著差异。包括比较处理所有可能的处理对，使用针对成对比较的 Tukey's检验来鉴定显著性差异，且该差异通过在每个图中的每个柱上的符号标记来显示。 标记有相同字母的任何处理表示彼此之间无显著差异。
[0152] 如图5所示，在最终乳酸浓度方面观察到了明显差异。在IFC中观察到最低乳 酸浓度以及在IC中出现最高值。例如，如染菌对照（IC)利用植物乳杆菌感染玉米醪液 并且无非氧化型杀生物剂的情况，与无染菌对照（IFC)相比，乳酸的终浓度提高近14倍。 在所有剂量均产牛.BRONAlVf20减少乳酸的量，并且明显具有剂量-响应关系。最低 乳酸浓度在利用BRONAM? 20的200-ppmv剂量处理染菌的玉米醪液的情况下观察 至IJ，该浓度仅稍高于在无染菌对照（IFC)中观察到的浓度（0. 11+0. 01g/100ml比IFC的 0. 06+0. 003g/100ml)。在"Bronam-200"和IFC处理中终乳酸浓度的差异是统计上显著的： P= 0. 012(其中P是两个浓度相同的概率）。即使在最高剂量BRONAMli加也无法完 全消除乳酸终浓度的升高可能是由于在接种乳酸细菌和添加抗微生物化合物之间的1小 时温育期所导致的。
[0153] 在乙醇产率方面观察到的差异被认为是统计上显著的，并且其方式与图5示出的 趋势是一致的。IC的乙醇产率明显低于所有其它处理的乙醇产率，除了 "Bronam-50"处理 之外。相对于无染菌对照（IFC)，在染菌对照（IC)中利用植物乳杆菌感染，降低了乙醇产率 约2%。相对于染菌对照（1C)，在所有测试的剂量水平上BRONAM8 20的添加降低了细 菌感染的影响，并且在至少为IOOppmv的浓度，相对于染菌对照（1C)，细菌感染的影响被完 全消除。利用"Bronam-20"，例如相对于染菌对照（1C)，发现乙醇产率提高了 2.6%。
[0154] 本研究的结果显示BRONAlVri 20能够在对于用于燃料乙醇工业的发酵是通常 的发酵条件下控制植物乳杆菌感染。当含有30% (w/w)玉米干固体的醪液被植物乳杆菌 感染时，乳酸浓度提高超过10-倍（由0.06%升高至0.76%，w/v)以及乙醇产率降低2%。 在至少IOOppm的浓度，利用BRONAivr20处理完全消除了细菌感染对于乙醇产率的影 响，并且相对于染菌对照（IC)，降低乳酸终浓度80 %或更高。
[0155] 基于本研究的结果，显示非氧化型杀生物剂，诸如BRONAM? 20可以控制在玉 米发酵过程中的细菌染菌，而不会杀灭对于燃料乙醇生产中的发酵是非常重要的酵母。进 一步考虑这些结果，相信针对在燃料乙醇发酵中控制细菌感染方面，非氧化型杀生物剂，诸 如:BRONAM? 20提供了抗生素的有价值的备选物。
[0156] 实施例2
[0157] 制备了乳杆菌MRS醪液（25%强度）并且向试管中分装IOml的量，并在121°C高 压灭菌20分钟。向试管中添加期望浓度的杀生物剂，然后向每个试管中添加100微升的 Lactobacillusfermentans的过夜醪液，并且在37°C温育24小时。
[0158] 在该实施例中，使用上述方法，通过检测在一系列检测中的乳酸链球菌肽（命名 为成分A)与2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇（命名为成分B)的组合（改变比率和相对于 细菌Lactobacillusfermentans的浓度范围）显示了协同效应。结果如下所示。
[0159]
[0160] 通过Kull，E.C.，Eisman，P.C.，Sylwestrwicz，H.D?和Mayer,R.L. 1961，Applied Microbiology, 9:538-541所描述的方法来表征协同，其中：
[0161] QA/Qa+QB/Qb小于 1。
[0162] Qa=以ppm表示的化合物A的浓度，单独作用，其产生端点；
[0163] Qb=以ppm表示的化合物B的浓度，单独作用，其产生端点；
[0164] Qa=以ppm表示的化合物A的浓度，在混合物中，其产生端点；
[0165] Qb=以ppm表示的化合物B的浓度，在混合物中，其产生端点；
[0166] 当QA/QjPQB/Qb的和大于1时，表示诘抗作用，当和为1时，表示加和作用。当该 值的和小于1时，出现协同。
[0167] 在上表中，可以看出，针对不同的组合，乳酸链球菌肽和2-溴-2-硝基丙 烷-1，3-二醇的组合提供了协同结果。该效应对于在生产乙醇的发酵之前或发酵过程中控 制细菌是非常有用的。
[0168] 实施例3
[0169] 在该实施例中，使用上述方法，通过检测在一系列检测中的乳酸链球菌肽（命名 为成分A)与2, 2-二溴-3-次氮基丙酰胺（命名为成分B)的组合（改变比率和相对于细 菌Lactobacillusfermentans的浓度范围）显示了协同效应。结果如下所示。
[0170]
[0171] 在上表中，可以看出，针对不同的组合，乳酸链球菌肽和2, 2-二溴-3-次氮基丙酰 胺的组合提供了协同结果。该效应对于在生产乙醇的发酵之前或发酵过程中控制细菌是非 常有用的。
[0172] 申请人具体地引入所有在本公开中引用的文献的全部内容。另外，当以范围，优选 的范围，或一列优选的上限值和优选的下限值给出一个量、浓度、或其他值或参数时，应该 理解的是无论范围是否独立地披露，具体披露的所有的范围由任何一对任意上限范围限定 或优选的值和任意下限范围限定或优选的值形成。当本申请引用数值范围时，除非另外说 明，该范围倾向于包含其终点和在此范围中的所有整数和分数。当定义范围时，本发明的范 围不倾向于受限于具体的值。
[0173] 通过考虑本发明的说明书和实施本发明在此公开的内容，对于本领域技术人员来 说其他本发明的实施方式将是显而易见的。本发明的说明书和实施例意在被认为仅是在一 个真实的范围内起代表性的作用，而本发明的精神是由权利要求及其等价物所表征的。
【主权项】
1. 利用发酵生产乙醇的方法，包括： a) 在容器中存在至少一种稳定的氧化剂和酵母的情况下，发酵可发酵的醪液以生产 乙醇和固体成分，其中在所述醪液中所述稳定的氧化剂控制细菌的生长而不会减小酵母种 群；以及 b) 蒸馏经发酵的醪液以从经发酵的醪液的固体成分中分离至少部分乙醇。2. 根据权利要求1的方法，还包括： 从含有小于约IOOppm的稳定的氧化剂的所述固体成分中获得干酒糟产品。3. 根据权利要求1的方法，其中稳定的氧化剂是稳定的次氯酸、稳定的次氯酸盐、稳定 的氯胺、稳定的次溴酸（例如溴氨基甲酸盐）、稳定的二氧化氯、稳定的过氧乙酸、碘、稳定 的碘产品、缓释氯三酮三氯均三嗪三酮钠、缓释二氯均三嗪三酮钠、缓释氯三酮、缓释三氯 均三嗪三酮钠、稳定的氯乙内酰胺、稳定的溴乙内酰胺或稳定改性的乙内酰胺、或它们的任 意组合。4. 根据权利要求1的方法，其中步骤（b)中的经发酵的醪液含有IOppm以下的抗生素。5. 根据权利要求1的方法，其中步骤b)中的所述经发酵的醪液在蒸馏之后含有约 IOppm的稳定的氧化剂。6. 根据权利要求1的方法，其中步骤b)中的所述经发酵的醪液在蒸馏之后含有约 Ippm稳定的氧化剂。7. 根据权利要求1的方法，其中细菌为乳杆菌属细菌（Lactobacillus sp.)、醋杆菌属 细菌（Acetobacter sp.)、或它们的任意组合。8. 根据权利要求1的方法，其中细菌为专性厌氧菌。9. 根据权利要求1的方法，其中步骤（a)中的经发酵的醪液与在不存在稳定的氧化剂 的条件下发酵的相同的经发酵的醪液相比，具有至少约5-倍小的酸，以重量％计，其中酸 为乳酸或乙酸。10. 利用发酵生产乙醇的方法，包括： a) 在容器中存在至少一种酵母的情况下，发酵可发酵的醪液以生产乙醇和固体成分； b) 在存在至少一种非氧化型杀生物剂的至少一个发酵池中储存至少部分经发酵的醪 液，其中在至少一个发酵池中非氧化型杀生物剂控制细菌的生长；以及 c) 从至少一个发酵池向至少一个蒸馏单元进料储存的醪液； d) 在至少一个蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从固体成分中分离至少部分乙醇。11. 生产乙醇的方法，包括： a) 在发酵罐容器中存在酵母和循环的生产用水的情况下，发酵可发酵的醪液以生产包 括乙醇和固体成分的经发酵的醪液； b) 任选利用含水溶液洗涤来自发酵罐容器的气体释放，并向发酵罐容器中循环至少部 分洗涤器出口溶液； c) 任选在至少一个发酵池中储存至少部分经发酵的醪液； d) 向蒸馏单元中进料经发酵的醪液； e) 在蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从釜馏物中分离至少部分乙醇； f) 将釜馏物分成含液体部分和含固体部分； g) 任选向发酵罐容器中循环至少部分f)的含液体部分； h) 回收f)的含固体部分至少部分作为湿酒糟产品和/或干燥至少部分含固体部分以 生产干酒糟产品和蒸发的蒸气； i) 任选冷凝h)的蒸发的蒸气并且向发酵罐容器中循环至少部分经冷凝的蒸气，以及 其中，在向发酵罐容器中循环水源之前，非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂被添 加至或其存在于b)的洗涤器出口溶液的经循环的水、来自f)的釜馏物分离的含液体部分、 来自i)的酒糟干燥的经冷凝的蒸气的至少一种来源中、或它们的任意组合中。12. 生产乙醇生产的干酒糟副产品的方法，包括： a) 在发酵罐容器中存在酵母的情况下，发酵可发酵的醪液以生产包括乙醇和固体成分 的经发酵的醪液； b) 任选利用含水溶液洗涤来自发酵罐容器的气体释放，并向发酵罐容器中循环至少部 分洗涤器出口溶液； c) 任选在至少一个发酵池中储存至少部分经发酵的醪液； d) 向蒸馏单元中进料经发酵的醪液； e) 在蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从釜馏物中分离至少部分乙醇； f) 将釜馏物分成含液体部分和含固体部分； g) 任选向发酵罐容器中循环至少部分f)的含液体部分； h) 干燥至少部分含固体部分回收f)的含固体部分以生产干酒糟产品和蒸发的蒸气； i) 任选冷凝h)的蒸发的蒸气并且向发酵罐容器中循环至少部分经冷凝的蒸气，以及 其中用于在发酵容器中控制细菌的非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂被添加至 或存在于发酵罐容器、发酵池和循环的水源、或它们的任意组合中的至少一种中。13. 根据权利要求12的方法，还包括获得含有小于约IOOppm非氧化型杀生物剂和/或 稳定的氧化剂的干酒糟产品。
【专利摘要】本文描述一种利用抗生素备选物在乙醇发酵系统中控制细菌生长的方法，该抗生素备选物可以是非氧化型杀生物剂、稳定的氧化剂或其任何组合。作为选择，本发明的方法或组合物可以包括一种和多种多环抗菌肽。该方法提供如下改进：诸如增加的乙醇产率并且将最少量的杀生物带入到该方法的副产品中。
【IPC分类】C12P7/06
【公开号】CN105002222
【申请号】CN201510244521
【发明人】C.L.维亚特, M.L.科科伦, T.E.麦克尼尔, R.A.克拉克, R.D.C.B.波托, D.奥庞格, P.胡克斯特拉
【申请人】巴克曼实验室国际公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2011年3月16日
【公告号】CA2793614A1, CN102985551A, CN102985551B, EP2547777A2, EP2547777A4, EP2955231A2, US8951960, US20110230394, US20150118726, WO2011116042A2, WO2011116042A3